莪術醇抑制人骨肉瘤細胞系的增殖和促凋亡

江 寧，郭 鈞，劉 鋮，周 舉

(1.中國人民解放軍總醫院第五醫學中心(原中國人民解放軍第307醫院)骨科，北京 100007；2.清華大學第一附屬醫院 骨科，北京 100016)

骨肉瘤是骨科惡性腫瘤中最為常見的一種，由間質細胞惡性增生引起，多發于股骨、脛骨、骨盆等部位，具有高度異質性，其特點是形成不成熟的骨樣組織或類骨質[1]。外科手術治療、放射治療、化學治療和靶向分子治療是現階段治療骨肉瘤的主要手段[2]，隨著國內外學者對骨肉瘤的不斷探索，越來越多的分子被證實參與了骨肉瘤的發生發展過程[3-4]，最新的研究也證實了，β-連環蛋白(β-catenin)的異常表達與骨分化和骨形成有關，β-catenin在骨肉瘤細胞中的表達顯著升高，參與調控骨肉瘤細胞增殖、分化、發育和凋亡[5]，β-catenin是目前臨床治療骨肉瘤的重要分子靶點。莪術醇是從傳統中藥姜科植物莪術中提取出的化合物，具有抗菌、消炎、抗血小板凝集、鎮痛及抗腫瘤活性，對于胃癌、食管癌、非小細胞肺癌等實體瘤均有較好的抑制作用[6-7]，然而目前尚不清楚莪術醇對于骨肉瘤細胞的增殖和凋亡的影響。本次研究旨在探究莪術醇作用于骨肉瘤細胞的效應及相關機制，希望為骨肉瘤的靶向治療提供更多理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人骨肉瘤細胞系MG-63和U2OS(中國科學院細胞庫)。

1.1.2 試劑(盒)：莪術醇溶液(中國食品藥品檢定研究院)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；反轉錄試劑盒(廣州泛思生物科技有限公司)；Bax一抗、Bcl2一抗、caspase3一抗和β-catenin一抗[艾博抗(上海)貿易有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理：將MG-63細胞、U2OS細胞置于含10%胎牛血清和0.5%青霉素、0.5%鏈霉素的培養基中進行培養，保持培養箱內溫度為37 ℃、5% CO2濃度，持續培養至細胞匯合達到80%以上以0.25%胰蛋白酶消化傳代，待細胞穩定增殖后將其分為對照組、莪術醇20、40、80和160 μmol/L干預組，取對數期細胞進行后續實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖：取經上述培養的各組MG-63細胞和U2OS細胞，調整細胞為2×104個/mL接種于96孔板中，每組設置5個復孔。對照組中加入無血清培養液，莪術醇0、20、40、80和160 μmol/L給藥組分別加入100 μL以無血清培養液稀釋至相應濃度的莪術醇溶液，待各組溶液滴加完畢，繼續保持37 ℃、5% CO2濃度培養48 h。48 h后向每孔中避光滴加10 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續孵育4 h后丟棄上層培養液，再滴加100 μL二甲基亞砜溶液，振蕩搖勻后培養10 min，待底部結晶完全溶解時，使用酶標儀檢測波長570 nm處的吸光度值，計算細胞抑制率和半數抑制濃度(IC50)值。

1.2.3 Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲水平：取對數增殖期的上述各組MG-63細胞和U2OS細胞，調整細胞為2×104個/mL，加入Transwell上室，下室中加600 μL含20%胎牛血清的培養液，37 ℃培養12 h后移除上室細胞，用4%多聚甲醛將下室細胞固定，結晶紫染色晾干后拍照并記錄細胞遷移數目。細胞侵襲實驗步驟除Transwell上室需預先用Matrigel基質膠進行包被，其他與上述一致。

1.2.4 流式細胞測量術檢測細胞凋亡：取經過不同處理的上述各組人骨肉瘤MG-63細胞和U2OS細胞，并將其制成1×106個/mL的細胞懸液，磷酸鹽緩沖液清洗多次后轉移至離心管中，高速離心后取細胞沉淀，加入500 μL按碘化丙啶染色液(×20)∶核糖核酸酶A(×50)=50∶2.5配置的工作液，37 ℃下避光孵育30 min，使用流式細胞儀檢測波長488 nm處的紅色熒光強度，計算細胞凋亡率。

1.2.5 RT-qPCR檢測凋亡相關蛋白和β-catenin的mRNA表達：取經過不同處理的上述的各組MG-63細胞和U2OS細胞，磷酸鹽緩沖液沖洗3次后加入Trizol試劑提取骨肉瘤細胞中的總RNA，調整RNA濃度后采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，引物設計見表1，以GAPDH作為標準化內部參照，設置反應條件為：95 ℃ 15 min預變性，95 ℃ 10 s變性，65 ℃ 30 s退火/延伸，采用PCR儀檢測各組細胞內凋亡相關蛋白Bax、Bcl2、caspase 3和β-catenin的mRNA表達水平。

表1 引物設計Table 1 Primer design

1.2.6 Western blot檢測凋亡相關蛋白和β-catenin蛋白表達：取經過不同處理的上述各組人骨肉瘤MG-63細胞和U2OS細胞，緩沖液清洗多次后加入細胞裂解液進行裂解，3 000 r/min離心15 min后取上清液保存于-80 ℃條件下，蛋白質定量法測定中蛋白濃度，取20 μg樣品以10% SDS-PAGE凝膠電泳進行分離，設置上層膠電壓為90 V，電泳30 min，設置分離膠電壓為120 V，電泳2 h，再將蛋白以90 V電轉移至聚偏氟乙烯膜上，封閉2 h后加入Bax、Bcl2、caspase 3和β-catenin一抗4 ℃孵育過夜，Trisl緩沖液漂洗3次后加入二抗室溫下培養2 h，Trisl緩沖液再次漂洗3次后滴加化學發光液，以目的蛋白β-actin表示各組蛋白相對表達量[8]。

1.3 統計學分析

采用SPSS22.0軟件處理本次所有實驗數據，Prism8.0軟件繪制圖表，計數資料率用(n，%)表示，χ2檢驗。計量資料采用均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 莪術醇抑制骨肉瘤細胞增殖

莪術醇呈濃度依賴性地抑制MG-63和U2OS細胞體外增殖，IC50值分別為128.03 μmol/L、117.95 μmol/L(圖1)。

圖1 莪術醇對骨肉瘤細胞增殖的影響Fig 1 Effects of curcumol on proliferation of osteosar-coma cells (x±s，n=3)

2.2 莪術醇抑制骨肉瘤細胞遷移和侵襲

以上述藥物濃度實驗中得出的半數抑制濃度IC50值128.03 μmol/L、117.95 μmol/L作為后續莪術醇組濃度，Transwell檢測莪術醇對骨肉瘤MG-63、U2OS細胞遷移和侵襲的影響，與對照組相比，莪術醇顯著抑制骨肉瘤MG-63、U2OS細胞的體外遷移和侵襲(P<0.05)(圖2)。

2.3 莪術醇誘導骨肉瘤細胞凋亡

與對照組相比，莪術醇顯著誘導MG-63、U2OS細胞凋亡(P<0.05)(圖3)。

2.4 莪術醇對Bax、BCl2和caspase 3基因mRNA表達的影響

與對照組相比，莪術醇組Bax、caspase 3的mRNA表達上調，Bcl2的mRNA表達下調(P<0.05)(圖4)。

2.5 莪術醇對Bax、BCl2和caspase 3蛋白表達的影響

與對照組相比，莪術醇組Bax、caspase 3的蛋白表達上調，Bcl2的蛋白表達下調(P<0.05)(圖5)。

2.6 莪術醇對β-catenin基因和蛋白的調控

與對照組相比，莪術醇組MG-63、U2OS細胞內β-catenin的mRNA表達水平和蛋白表達均被顯著抑制(P<0.05)(圖6～7)。

3 討論

骨肉瘤具有高度侵襲性，惡性程度高，極易復發和轉移，患者預后差[9]。血管內皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑等靶向藥物在骨肉瘤的治療中擁有較好的應用前景，通過抑制靶向識別特定的分子受體，抑制免疫檢查點，發揮抗腫瘤免疫作用[10]。探究骨肉瘤發生發展的分子機制，確定有效治療靶點和抗腫瘤藥物，對于臨床治療而言意義重大。

*P<0.001 compared with control圖2 莪術醇對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的影響Fig 2 Effects of curcumol on migration and invasion of osteosarcoma cells(x±s，n=3)

*P<0.001 compared with control圖3 莪術醇對骨肉瘤細胞凋亡的影響Fig 3 Effects of curcumol on apoptosis of osteosarcoma cells(x±s，n=3)

骨肉瘤的發病因素較為復雜，不同于正常細胞，骨肉瘤等癌細胞的特點是具有無限增殖、可發生上皮間質細胞轉化和易轉移能力[11]。本研究結果表明莪術醇可顯著抑制骨肉瘤MG-63、U2OS細胞的遷移和侵襲，誘導細胞凋亡。莪術醇等小分子藥物對于癌的治療效果通常是通過與癌細胞內的蛋白質靶點結合來實現的，在本次研究中，莪術醇通過調控骨肉瘤MG-63和U2OS細胞內的β-catenin的表達，阻斷Wnt/β-catenin通路的活性，提高莪術醇對腫瘤細胞的殺傷性，發揮抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的作用，誘導細胞凋亡[12]。

研究表明， Wnt/β-catenin通路的異常激活與骨肉瘤組織形態學的異常、細胞增殖和分化異常有關[13]，當細胞質內的β-catenin大量積累時，β-catenin由胞質轉向胞核，并與細胞核內的T細胞因子/淋巴增強因子(T-cell factor/lymphoid enhanc-ing factor，TCF/LEF)等轉錄因子相結合，激活下游靶基因的啟動子，誘導骨肉瘤細胞的異常增殖和凋亡抗性[14]，最終導致骨肉瘤的發生發展。本次研究發現莪術醇可顯著抑制細胞內β-catenin的mRNA表達水平及蛋白表達。推測原因可能為莪術醇可引起骨肉瘤MG-63、U2OS細胞內鈣離子穩態失衡，導致鈣超載[15]，過量的鈣離子堆積可引起β-catenin上游靶基因糖原合成酶激酶3β表達增強，而活化的糖原合成酶激酶3β可通過影響β-catenin的磷酸化和泛素蛋白酶體途徑抑制β-catenin的穩定性，從而發揮抑制骨肉瘤MG-63、U2OS細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡，抑制骨肉瘤進展的作用。

*P<0.001 compared with control圖4 莪術醇對骨肉瘤細胞內Bax、BCl2和caspase 3基因mRNA表達的影響Fig 4 Effects of curcumol on mRNA expressions of Bax, Bcl2 and caspase 3 genes in osteosarcoma cells(x±s，n=3)

*P<0.001 compared with control圖5 莪術醇對骨肉瘤細胞內凋亡相關蛋白表達的影響Fig 5 Effects of curcumol on apoptosis-related proteins expressions in osteosarcoma cells(x±s，n=3)

*P<0.05 compared with control圖6 莪術醇對骨肉瘤細胞內β-catenin基因mRNA表達水平的影響Fig 6 Effects of curcumol on mRNA expression level of β-catenin gene in osteosarcoma cells(x±s，n=3)

綜上所述，莪術醇通過抑制β-catenin蛋白的表達，抑制骨肉瘤MG-63、U2OS細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡。本次研究結果提示莪術醇具有作為骨肉瘤靶向治療藥物的潛力，但也存在一定的局限性，比如僅探討了莪術醇對于體外骨肉瘤細胞生物學的影響，未驗證其是否在活體中擁有相似的效應，后續還需要進一步探索。

*P<0.05 compared with control圖7 莪術醇對骨肉瘤細胞內β-catenin蛋白表達的影響Fig 7 Effects of curcumol on β-catenin protein expression in osteosarcoma cells(x±s，n=3)