榆梔止血顆粒減輕宮腔粘連大鼠子宮內膜纖維化

姜艷玲，丁 麗，李發余，解世雷，張一瓊

(1.中藥制藥共性技術國家重點實驗室, 山東 臨沂 276006； 2.山東省日照市人民醫院 婦科, 山東 日照 276826；3.南昌大學第一附屬醫院 婦產科, 江西 南昌 330006)

宮腔粘連(intrauterine adhesion，IUA)又稱為Asheman綜合征，是子宮內膜損傷，修復系統失衡，從而引起宮腔形態異常而發生的纖維化病變[1]。目前，宮腔鏡宮腔粘連分離術(transcervical resection of adhesion，TCRA)是臨床上治療IUA的主要治療方法，但治療后再黏率高，治療效果不夠理想[2]。因此，尋找一種能有效促進子宮內膜修復的藥物，是臨床治療上急需解決的問題之一。骨髓干細胞(bone marrow stem cell，BMSC)被假設為子宮內膜再生和修復的重要細胞，但其機制尚未被詳細報道[3]。多項證據表明基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)/CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)軸在骨髓間充質干細胞歸位過程中起著至關重要的作用[4]。已有研究證明，能夠通過SDF-1/CXCR4信號通路有效促進BMSC的增殖和遷移[5]。榆梔止血顆粒為婦科疾病用藥，根據中醫學整體觀念及遵循辨證與辨病相結合的原則，本研究建立IUA模型大鼠，擬探討榆梔止血顆粒是否可用于治療宮腔粘連，并初步分析其作用機制。遵循辨證與辨病相結合的原則。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SD大鼠，雌性，SPF級，體質量200 g左右[河南省動物實驗中心，動物許可證號SCXK(豫)2017-0001]。

1.1.2 主要試劑：榆梔止血顆粒(國藥準字Z20130019，山東新時代藥業有限公司)，0.9%的氯化鈉溶液溶解稀釋用于研究。蛋白提取試劑盒、伊紅-蘇木精試劑盒、Masson染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；SDF-1抗體、CXCR4、β-actin抗體及辣根過氧化物酶結合的二抗(兔抗羊)(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：參照文獻[6]，用機械刺激加脂多糖雙重刺激制備大鼠IUA模型。假手術組大鼠僅做切口，不刮宮。將大鼠隨機分成假手術組、模型組、榆梔止血顆粒低(30 mg/kg)、中(60 mg/kg)和高劑量組(120 mg/kg)，灌胃體積每天1次為10 mL/kg。

1.2.2 樣本采集：末次給藥24 h后，將大鼠麻醉，經腹主動脈取血，離心取上清，置于-80 ℃冰箱中保存備用。處死后，取各組大鼠子宮組織，肉眼觀察。取大鼠同一側子宮組織置于10%中性甲醛固定液中固定，另一側子宮組織置于液氮中保存。

1.2.3 試劑盒檢測血清炎性因子等：按照試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清白介素6(IL-6)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，轉化生長因子β1(TGF-β1)水平。

1.2.4 HE及Masson染色檢測子宮內膜腺體數量及纖維化程度：將固定24 h后的子宮組織，制成石蠟切片，進行HE染色及Masson染色。HE染色標本用于子宮內膜腺體計數。Masson染色標本用于子宮內膜纖維化面積比的計算[7]。

1.2.5 Western blot檢測大鼠子宮組織SDF-1、CXCR4蛋白表達：取出液氮中保存的子宮組織，制備組織勻漿，提取總蛋白，分析各組大鼠子宮組織中SDF-1、CXCR4蛋白的表達情況，以β-actin蛋白為內參進行蛋白定量分析。

1.3 統計學分析

本研究采用SPSS 22.0軟件統計分析，數據以均數±標準差(x±s)表示，方法采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，采用SNK-q檢驗進一步兩兩比較。

2 結果

2.1 大鼠子宮組織大體形態學的觀察

假手術組大鼠子宮大小正常，表面光滑呈淡粉色，雙側子宮粗細均勻，大小相近，有彈性。模型組大鼠子宮水腫明顯，呈白色略透明，子宮兩側粗細不均，彈性減退。榆梔止血顆粒低劑量組較模型組纖細，顏色大致正常，粗細尚均勻，彈性稍差，表面有少量充血點；榆梔止血顆粒中劑量組子宮粗細較均勻，輕微水腫，表面光滑，組織有彈性；榆梔止血顆粒高劑量組子宮粗細均勻，大小正常，表面光滑，組織彈性良好。

2.2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平

與假手術組相比，模型組血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，榆梔止血顆粒各組處理后，血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平顯著降低且呈劑量依賴性(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平Table 1 Serum IL-6, TNF-α, TGF-β1 levels of rats in each group(x±s, pg/mL, n=10)

2.3 各組大鼠子宮組織病理形態表現

假手術組大鼠子宮內膜完整，腺體分布均勻。模型組子宮內膜變薄，腺體排列稀疏，可見大量炎性細胞浸潤。與模型組相比，榆梔止血顆粒各組的子宮內膜增厚，炎性細胞浸潤減少(圖1)。

假手術組大鼠子宮內膜間質大小均勻，排列整齊；模型組大鼠子宮腔變小，膠原纖維呈條索狀且排列緊密；與模型組相比，榆梔止血顆粒各組大鼠子宮腔明顯增大，膠原纖維分布稀疏(圖2)。

2.4 HE染色觀察各組大鼠子宮內膜腺體數量和間質纖維化程度

與假手術組相比，模型組和榆梔止血顆粒各組大鼠子宮內膜腺體數均減少(P<0.05)，纖維化面積比率均增大(P<0.05)；與模型組相比，榆梔止血顆粒各組大鼠子宮內膜腺體數增加(P<0.05)，纖維化面積比率減小(P<0.05)，且均呈劑量依賴性(表2)。

A.sham operation group; B.model group; C.YZ-L group; D.YZ-M group; E.YZ-H group圖1 各組大鼠子宮HE染色Fig 1 HE staining of rat uterus in each group(×100)

A.sham operation group; B.model group; C.YZ-L group; D.YZ-M group; E.YZ-H group圖2 各組大鼠子宮Masson染色Fig 2 Masson staining of rat uterus in each group(×100)

表2 大鼠子宮內膜腺體數和間質纖維化面積比率Table 2 Rat endometrial gland number and interstitial fibrosis area ratio(x±s, n=10)

2.5 大鼠子宮組織SDF-1、CXCR4蛋白表達

與假手術組相比，模型組SDF-1蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，榆梔止血顆粒處理組SDF-1蛋白相對表達量明顯下降且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖3，表3)。

表3 各組大鼠子宮組織SDF-1、CXCR4蛋白表達檢測結果Table 3 Test results of SDF-1 and CXCR4 protein expression in uterine tissues of rats in each group(x±s, n=10)

3 討論

中醫學認為濕、熱、瘀血是宮腔粘連的主要病理基礎，相當于現代醫學的“炎性反應”和“纖維化”[8-9]。宮腔粘連發病機制復雜，其中炎性和纖維化的形成是宮腔粘連原因之一[10]。本研究構建IUA大鼠模型，結果顯示造模大鼠子宮水腫明顯， 子宮內膜變薄，腺體數量減少， 纖維組織增生， 血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平顯著升高，揭示模型建立成功。

1.sham operation group; 2.model group; 3.YZ-L group; 4.YZ-M group; 5.YZ-H group圖3 各組大鼠子宮組織Western檢測結果Fig 3 Western test results of rat uterine tissues in each group

榆梔止血顆粒，具有清熱、涼血、滋陰等作用，IUA大鼠經榆梔止血顆粒給藥后，子宮輕微水腫，子宮內腺體數量增加，纖維化程度減弱，僅有少量炎性細胞，血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平顯著降低且呈劑量依賴性，表明榆梔止血顆粒可治療IUA大鼠子宮損傷，抑制炎性反應。

SDF-1是趨化細胞因子超家族的關鍵成員，它與干/祖細胞表面的受體CXCR4相互作用。SDF-1/CXCR4軸在細胞增殖、遷移、黏附、存活和旁分泌中發揮重要作用[11]。BMSCs是一種表達CXCR4的骨源性多功能干細胞，能夠分化為細胞譜系，已被研究用于多種疾病的治療[12-13]。過往研究發現，趨化因子SDF-1及其特殊受體CXCR4在骨髓間充質干細胞歸位中起著至關重要的作用[4,14]。雌激素可能通過SDF-1/CXCR4軸參與子宮內膜異位癥的形成和發展[15]。本研究結果發現，模型組大鼠子宮組織中SDF-1蛋白相對表達量升高，說明SDF-1蛋白可能增強宮腔粘連大鼠炎性反應，促進子宮纖維化增生。經榆梔止血顆粒治療后，IUA大鼠子宮組織SDF-1蛋白表達量顯著降低，且呈劑量依賴性，表明榆梔止血顆粒可下調SDF-1蛋白表達，揭示榆梔止血顆粒可能通過SDF-1/CXCR4軸減輕子宮炎性反應，修復子宮結構，延緩纖維化。

綜上所述，榆梔止血顆粒可能通過抑制SDF-1/CXCR4軸，減輕大鼠宮腔粘連炎性反應，降低子宮組織纖維化，修復子宮結構，為臨床治療TCRA術后子宮修復提供了新思路，但具體機制仍需進一步研究。