miR-223抑制肺結核大鼠肺部病變

童曉維，肖 韓

(宜昌市第三人民醫院 肺病科, 湖北 宜昌 443000)

肺結核(pulmonary tuberculosis，PT)只由結核分枝桿菌引發的傳染性疾病，對人類的健康造成嚴重的危害。青壯年是PT的好發人群，中國結核病患者占全球的15%以上，也是結核病高發的國家之一[1]。結核分枝桿菌屬于一種寄生菌，當機體發生感染時會在巨噬細胞內寄生，細胞內的結核分枝桿菌會在巨噬細胞凋亡后一起被清除。結核分枝桿菌感染人體一般通過呼吸道傳播，感染發生時，人體的細胞免疫功能會對機體進行保護，因此有大部分的患者并不會發病[2]。在肌體細胞中，T細胞主導細胞免疫功能，巨噬細胞可有效反應細胞中的免疫功能。干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)可有效的調節巨噬細胞的活化，白細胞介素-18(interleukin-18，IL-18)可以誘導IFN-γ大量的產生[3]。因此，猜測IFN-γ和IL-18介導著肺結核疾病的免疫調節機制。近年來，在很對真核細胞和病毒中均發現了微小RNA-miRNA，其主要是源自內源性染色體的單鏈RNA。近年來有研究發現，miRNA對動物體內的炎性反應和免疫機制起到一定的調節作用，同時對多種生物學活性均能進行調節。近些年，隨著對miRNA的深入研究，發現結核病患者體內存在特異性miRNA表達[4]。高度保守的miR-223可調控炎性反應，其機制可能是通過抑制其相關靶基因而實現[5]。有報道，miR-223在結核病患者的單核細胞中低表達，巨噬細胞的細胞因子可隨著miR-223的低表達而大量產生[6]。由此可見，在肺結核的機體免疫中miR-223起重要作用，但其具體的作用機制尚不明確，因此本文旨探究miR-223對肺結核大鼠肺部病變及IFN-γ蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠60只，清潔級，體質量100～210 g(上海斯萊克實驗動物有限公司)[許可證號：SCXK(滬)1012-0002]。

1.2 試劑

結核分枝桿菌(青島綠谷商貿有限公司)；IL-18和IFN-γ ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；Trizol試劑(浙江聯碩生物科技有限公司)；RT-qPCR檢測試劑盒(上海優予生物科技有限公司)；引物序列、miR-223 mimics質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物的分組及處理：將大鼠分為正常組(NC組)；肺結核大鼠模型組(PT組)：經大鼠尾靜脈注射0.2 mL結核分枝桿菌懸液；肺結核大鼠給予miR-223 mimics干預組(miR-223組)，每組10只。血液檢查及結核菌素試驗證實肺結核建模成功后，miR-223組大鼠尾靜脈注射miR-223 mimics質粒，2 mg/kg，3組大鼠均連續7 d。

1.3.2 樣本的收集：7 d后分別多次抽取大鼠尾靜脈血4 mL，分離血清，將血清置入到抗凝管中抗凝后保存用于后續試驗。分別脫頸處死大鼠，取出肺組織后，保存用于后續實驗。

1.3.3 流式細胞儀檢測外周血T細胞亞群：用常規法檢測外周血T細胞免疫因子CD3+%、CD4+%、CD8+%的變化。

1.3.4 ELISA檢測血清中IFN-γ和IL-18的水平：用ELISA試劑盒檢測血清中IFN-γ和IL-18水平。

1.3.5 大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落的計數：取肺組織50 mg，制備均漿組織，在組織液中加入4%硫酸消化組織，15 min后加入2.5 mol/L的NaOH，將pH值調至7.0左右，將組織接種于斜面培養基中，培養基溫度保持在37 ℃，5周后對培養基上的結核分枝桿菌菌落數進行計數。

1.3.6 HE染色觀察肺組織病理學形態：常規制備，HE染色后用顯微鏡觀察。

1.3.7 免疫組化檢測肺組織中IFN-γ蛋白表達：切片組織脫蠟，將抗原修復液加入到組織中，在98 ℃的環境下修復組織，15 min后清洗切片組織，用山羊血清將組織封閉，把IFN-γ蛋白一抗加入到組織中，在4 ℃環境中孵育過夜，次日PBS再次清洗組織，將生物素標記的二抗加入到組織中，在37 ℃的環境中孵育，30 min后將DAB溶液滴加到組織內將組織染色，用蘇木精將細胞核復染，將組織脫水透明后晾干，用中性樹膠將組織封片，顯微鏡下觀察組織中IFN-γ蛋白表達。

1.3.8 RT-qPCR檢測肺組織中miR-223、IFN-γ mRNA表達：用胰蛋白酶消化肺組織，Trizol法裂解后對總的RNA進行提取，反轉錄成cDNA。miR-223引物序列：上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTG GCTC-3′,下游引物5′-TGTCAGTTTGTCAAATACCC CA-3′；IFN-γ引物序列：上游引物5′-AGTTATATCT TGGCTTTTCA-3′，下游引物5′-TTCGACTGATTAAT AAGC-3′。反應條件：分別在60 ℃、95 ℃環境下預變性10 min、30 s；在72 ℃環境下退火30 s；在95 ℃環境下延伸30 s，共計40個循環。miR-223、IFN-γ mRNA相對表達量用2-△△Ct法進行計算。

1.4 統計學分析

應用SPSS 10.1軟件對NC組、PT組和miR-223組的數據進行分析。用均數±標準差(x±s)表示，3組間的數據比較用單因素方差法進行檢驗，兩組間比較采用LSD-t進行檢驗。

2 結果

2.1 外周血T細胞亞群變化的比較

和NC組相比，PT組大鼠外周血T細胞亞群CD3+%、CD4+%水平明顯降低，而CD8+%水平升高(P<0.05)；miR-223組大鼠外周血T細胞亞群CD3+%、CD4+%水平較PT組明顯回升，而CD8+%水平較PT組明顯回降(P<0.05)(表1，圖1)。

表1 各組大鼠外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的變化Table 1 Changes of CD3+、CD4+、CD8+ of T cell subsets in peripheral blood of rats in each group(x±s，%，n=10)

2.2 血清中IFN-γ和IL-18水平變化比較

和NC組大鼠血清中IFN-γ和IL-18水平比較，PT組顯著增加(P<0.05)；干預后的miR-223組大鼠血清中IFN-γ和IL-18水平較PT組顯著降低(P<0.05)(表2，圖2)。

表2 各組血清中IFN-γ和IL-18水平比較Table 2 Comparison of serum IFN-γ and IL-18 levels in each group(x±s，pg/mL，n=10)

2.3 肺組織結核分枝桿菌菌落數的比較

miR-223組大鼠肺組織中結核桿菌菌落數為(4.28±1.76/CFU)，低于PT組(9.33±2.15/CFU)(P<0.05)。

2.4 大鼠肺組織病理學形態比較

和正常的NC組相比，PT組肺組織細支氣管周圍有大量以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤；干預后的miR-223組大鼠肺組織得到明顯改善，較PT組肺組織細支氣管周圍炎細胞大量減少(圖1)。

圖1 大鼠肺組織病理形態HE染色Fig 1 HE staining of rat lung histopathology(×200)

2.5 大鼠肺組織中IFN-γ蛋白表達比較

和NC組相比較，PT組大鼠IFN-γ蛋白陽性細胞計數顯著增加(P<0.05)；干預后的miR-223組大鼠IFN-γ蛋白陽性細胞計數較PT組顯著降低(P<0.05)(圖2，表3)。

圖2 各組大鼠肺組織中IFN-γ蛋白表達免疫組化染色Fig 2 Immunohistochemical staining of IFN-γ protein expression in lung tissues of rats in each group(×200)

表3 各組大鼠肺組織中IFN-γ蛋白表達比較Table 3 Comparison of IFN-γ protein expression in lung tissue of rats in each group(x±s，n=10)

2.6 大鼠肺組織中miR-223、IFN-γ mRNA表達

和NC組大鼠肺組織中miR-223 mRNA表達相比較，PT組顯著降低；和NC組肺組織中IFN-γ mRNA表達相比較，PT組顯著升高(P<0.05)；干預后的miR-223組大鼠肺組織中miR-223 mRNA表達較PT組顯著增加，IFN-γ mRNA表達較PT組明顯降低(P<0.05)(表4)。

表4 各組大鼠肺組織中miR-223、IFN-γmRNA表達比較Table 4 Comparison of miR-223 and IFN-γ mRNA expression in lung tissue of rats in each group(x±s，n=10)

3 討論

肺結核屬傳染性呼吸系統疾病，當機體被結核分枝桿菌感染后的2～3周，會出現免疫和遲發性的超敏反應，讓細菌增殖受到免疫應答抑制。研究發現肺結核發病時，巨噬細胞中被大量炎性因子浸潤，因此調節機體的免疫水平，抑制炎性反應導致的肺組織損傷也是治療肺結核的重中之重[7]。miR-223表達于多種哺乳動物中，其參與細胞增殖及組織生長[8]。miR-223可抑制肺結核患者體內中性粒細胞趨化，減輕肺組織損傷[9]。

免疫功能低下是肺結核的主要發病機制，其中抗結核免疫中CD4+T細胞最為重要[10]。本研究結果顯示，PT組CD3+%、CD4+%降低，而CD8+%水平升高，miR-233干預后免疫應答因子均改善，提示miR-233可增強肺結核大鼠機體內免疫功能。機體內活化的巨噬細胞會產生大量的IL-18，進而誘導T淋巴細胞產生IFN-γ的能力[11]。本文研究發現PT組IFN-γ和IL-18水平增多，miR-223干預后IFN-γ和IL-18表達回降，提示miR-223可通過抑制肺結核大鼠血清中IFN-γ和IL-18水平，進而增強機體的免疫功能。研究發現，肺結核患者血清中IL-18和IFN-γ水平升高，炎性因子增多，進而加重了肺結核的免疫反應[12]。miR-223可通過調控基因的表達進而影響免疫細胞的發育和激活，并參與細胞的免疫反應[13]。

本實驗結果發現PT組結核分枝桿菌的菌落數增加，miR-233組結核分枝桿菌菌落數明顯回降，提示miR-233可減少結核分枝桿菌菌落數數量，改善結核病的嚴重程度。研究發現，miR-223可減少肺結核大鼠肺組織中結核桿菌菌落數，進而抑制巨噬細胞的凋亡[14]。IFN-γ是肌酸激酶，可有效的激活巨噬細胞，進而抵抗細胞內感染的發生，機體對結核桿菌的殺傷力隨著IFN-γ的減少而降低。本研究發現，PT組IFN-γ表達增加，miR-223組中IFN-γ表達回降，提示miR-223可抑制肺結核大鼠肺組織中IFN-γ的表達，增加機體對結核分枝桿菌的殺傷作用，進而改善結核病。嗜中性粒細胞驅動的致死性炎性可通過miR-233進行抑制，進而對白細胞的趨化作用進行調節，介導肺結核及慢性炎性的發生發展。miR-223可抑制巨噬細胞中p65磷酸化，負向調節活化NF-κB，對體內的細胞因子和巨噬細胞的凋亡進行抑制，進而抑制機體內的抗結核免疫[15]。

綜上所述，過表達miR-223可抑制結核分枝桿菌引起的肺部炎性反應，具有抗結核桿菌和調節機體免疫的雙重作用，同時還能有效抑制肺組織中IFN-γ的表達，進而降低結核病的嚴重程度。