miR-499通過靶向TGF-α抑制人骨肉瘤細胞系Saos2遷移和促凋亡

王 磊，邱明憲，張慧榮，張金萍，趙 靜，康 肖*，張清泉

(1.河北省衡水市第四人民醫院， 河北 衡水 053000； 2.河北省衡水市人民醫院， 河北 衡水 053000)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是兒童、青少年較常見的高度惡性腫瘤[1]，近年來，隨著醫療水平的發展，骨肉瘤的治療手段得到了一定提高，但是預后仍然差強人意，5年內生存率低于30%[2]。其發病機制的分子機制也未得到充分的探討。

微小RNA(microRNA，miRNA)，其屬于內源性的非編碼RNA，通過與目標基因 mRNA 的3′-UTR 區域部分序列互補相結合，參與調控多種生物學進程[3]。近年來miRNA功能調控為骨肉瘤治療提供了新的研究方向，在骨肉瘤發展過程中，已證實多種miRNA與其發生發展相關，其中miRNA-206通過靶向Notch3抑制骨肉瘤的轉移[4]；過表達miRNA-188-5p能明顯抑制骨肉瘤細胞增殖能力，阻滯細胞周期的進展[5]，多種miRNA已經證實與骨肉瘤的發病機制有關，在這些miRNAs中，目前 miR-499在骨肉瘤惡性增殖和遠處轉移中的確切生物學功能尚不清楚。轉化生長因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)作為表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)的配體，據報道TGF-α基因與許多類型的癌有關[6]。本研究初步證實了miR-499以及靶基因TGF-α對骨肉瘤細胞的生物功能調控作用，揭示了miR-499作為抗癌因子在骨肉瘤中的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本及動物：組織樣本采集自衡水市第四人民醫院經病例確診的28例骨肉瘤手術患者手術切除的腫瘤標本及癌旁組織標本，研究中所有樣本均得到了本院倫理委員會批準(2020)倫審第(53)號,并已取得了患者的知情同意；SPF級BALB/c裸鼠28只，4～9周，體質量15～20 g。

1.1.2 試劑(盒)：人骨肉瘤細胞系(Saos2中國科學院上海細胞庫)；RT-qPCR試劑盒、BCA蛋白質分析試劑盒、R轉錄試劑盒[自賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；Transwell 小室(Coring公司)；TGF-α抗體、GAPDH抗體(內參)、Ki67抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理：使用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，培養人成骨肉瘤細胞系(Saos2)。轉染前24 h將增殖狀態良好的細胞接種密度按5×105個/孔接種于6孔板，隨后參照轉染試劑LipofectamineTM2000 試劑說明書對細胞進行轉染。

1.2.2 RT-qPCR檢測TGF-α的mRNA水平：使用Trizol從細胞系或組織中提取總RNA，總RNA經R轉錄試劑盒合成cDNA，其中U6為miR-499的表達水平的內參，GAPDH為TGF-α的mRNA表達水平的內參，參照RT-qPCR試劑盒制造商指示，進行PCR反應，RT-qPCR結果以2-△△Ct值形式得到。

1.2.3 Western blot檢測TGF-α蛋白：用放射免疫沉淀法緩沖液從組織或細胞中分離總蛋白，蛋白濃度采用BCA法檢測，等量(40 μg)提取的蛋白用10% SDS-PAGE分離，然后蛋白轉至PVDF膜上，5%的奶粉(脫脂)于37 ℃封閉1 h。加入一抗TGF-α抗體(1∶500)，GAPDH抗體(1∶1 000)，其中GAPDH為內參。4 ℃，過夜。加入辣根過氧化物酶標記的兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，加入顯影劑1 min，然后使用ImageJ2X軟件進行免疫印跡分析。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因實驗： 通過TargetScan發現miR-499在TGF-α基因3’-UTR上的潛在結合位點，構建TGF-α野生型3′-UTR熒光素酶報告基因質粒pMIR-TGF-α-wt和突變型報告基因質粒pMIR-TGF-α-mut，將野生型或突變型報告基因質粒與miR-NC、miR-499 mimic、NC-inhibitor或miR-499抑制劑共轉染進Saos2細胞。轉染24 h后，測量各組細胞的熒光素酶活性。

1.2.5 免疫組化檢測TGF-α蛋白： 將骨肉瘤組織和癌旁組織置于65 ℃烤片，梯度脫蠟、水化。進行抗原修復。加入5%的正常羊血清封閉15 min。加入5%的正常羊血清封閉15 min。隨后加入一抗TGF-α抗體(1∶100)、Ki67抗體(1∶100)，4 ℃過夜。加二抗(1∶200)，37 ℃孵育30 min。采用DAB顯色后，蘇木精室溫復染2 min，而后進行脫水和中性樹脂封片。采用正置顯微鏡觀察切片。

1.2.6 Transwell侵襲實驗檢測Saos2細胞遷移： 轉染后，收集各組細胞，Matrigel凝膠于4 ℃條件下過夜，將Saos2細胞濃度調整為1×106個/mL。在上室加入100 μL細胞懸液；將含有10%的胎牛血清600 μL培養基添加到下室中；然后于恒溫箱中孵育24 h。將小室置于95%乙醇中固定 5 min；染色(0.5%結晶紫溶液)10 min后，用棉簽輕輕擦拭濾膜上層細胞后顯微鏡下觀察該膜下層細胞。

1.2.7 TUNEL實驗檢測Saos2細胞凋亡： 在4%多聚甲醛中固定各組人成骨肉瘤細胞系Saos2細胞30～60 min，在0.3% H2O2中孵育(37 ℃，20 min)，采用PBS清洗3次后滴入50 μL的生物素標記溶液，孵育(37 ℃下60 min)。結束后清洗(PBS)1次，滴加0.1～0.3 mL標記反應終止液，37 ℃，30 min，滴加DAB(0.2～0.5 mL)顯色液，蘇木精染色液染色細胞核。用95%乙醇脫水5 min，隨后于無水乙醇中脫水2次(3 min/次)，最后甲苯透明 2次(5 min/次)，顯微鏡下觀察切片。

1.2.8 構建骨肉瘤裸鼠移植瘤模型： 將裸鼠隨機分為miR-NC組(n=7)，miR-499 mimic組(n=7)，NC-inhibitor組(n=7)和miR-499 inhibitor組(n=7)。Saos2細胞轉染后，調整細胞濃度為5×107個/mL，使用注射器向每只裸鼠右后肢腋部注射1×107個/只細胞懸液，21 d后腹腔注射水合氯醛麻醉(0.01 mL/g體質量)并引頸脫臼處死裸鼠，從皮下去除其腫瘤組織及甲醛固定。

1.3 統計學分析

本研究所有數據使用SPSS Statistics 22.0統計軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差(x±s)表示，兩組數據間的比較采用t檢驗，3組或3組以上的比較采用One-way Anova。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織中miR-499和TGF-α的表達水平差異

與癌旁組織相比，骨肉瘤組織中miR-499的表達顯著降低(P<0.01)，而TGF-α的mRNA表達則相反顯著升高(P<0.01)。TGF-α蛋白在骨肉瘤組織中蛋白表達和陽性信號明顯高于癌旁正常組織(P<0.01)。TGF-α可能是miR-499的靶基因(P<0.01)。miR-499模擬物或抑制物轉染成功(P<0.01)雙熒光素酶報告基因實驗發現，pMIR-TGF-α-wt質粒與miR-499模擬物共轉染進Saos2細胞時，熒光素酶活性明顯降低。而轉染miR-499抑制物則能明顯增強pMIR-TGF-α-wt質粒的熒光素酶活性(圖1)。

2.2 miR-499抑制TGF-α促進Saos2細胞的生物學功能

TGF-α促進了Saos2細胞遷移(P<0.01)，抑制細胞凋亡(P<0.01)，而miR-499模擬物則顯著抑制了Saos2細胞遷移(P<0.01)，促進了細胞凋亡(P<0.01)。共轉染miR-499+TGF-α后，細胞數量相比Saos2組有所降低，同時Saos2細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)(圖2)。

2.3 miR-499和TGF-α在骨肉瘤裸鼠移植瘤模型中的調控機制

miR-499過表達可下調TGF-α mRNA的蛋白表達，而miR-499抑制物則結果相反，增強TGF-α mRNA和蛋白的表達水平(圖3)。miR-499 模擬物組可明顯抑制骨肉瘤的生長且瘤中TGF-α的陽性指標顯著減少，而miR-499抑制劑可明顯促進骨肉瘤的生長且TGF-α的陽性指標顯著增加(圖4)。

3 討論

在骨肉瘤中miRNAs通過調控靶基因起到抑癌或者促癌作用[7]。與健康志愿者相比骨肉瘤患者血清中miR-411表達相對較高，并且上調miR-411可以促進骨肉瘤細胞的增殖遷移[8]。另外一項研究則發現miR-646在骨肉瘤中發揮抑癌作用，同時過表達miR-646可以抑制細胞增殖、遷移和侵襲[9]。多項研究已經探究了miRNA在骨肉瘤中的調控機制，本研究首次發現miR-499在骨肉瘤組織中呈現低表達，在以往的研究中，miR-499可以抑制肝細胞癌HepG2細胞的侵襲和遷移[10]，但暫時尚未發現miR-499在骨肉瘤中的相關報道。

miRNAs根據其調控腫瘤中靶基因的不同，從而發揮促癌或抑癌作用，因此探究miR-499的潛在靶基因，是明確miR-499在骨肉瘤中的工作機制的重要環節[11]。本研究通過生信軟件發現miR-499在TGF-α的3′-UTR上具有潛在的結合位點，發現TGF-α是一種癌基因。并采用雙熒光素酶報告基因實驗的結果也證實了TGF-α確為miR-499的靶基因，且在體內實驗中驗證了miR-499能負調控TGF-α mRNA和蛋白表達水平。在骨肉瘤相關研究中TGF-α在骨肉瘤異常高表達并且受miRNA-376c調控[12]，這與本研究結果類似,本研究發現TGF-α可以促進人骨肉瘤細胞Saos2遷移能力并抑制凋亡率。

A，B.RT-qPCR was used to detect the expression of miR-499 and TGF-α mRNA in osteosarcoma and normal adjacent tissues; C.Western blot was used to detect TGF-α protein expression; D.TargetScan performs bioinformatics prediction; E.miR-499 was transfected; F.double luciferase reporter gene assay; G.the expression of TGF-α in tumor tissues was higher than that in normal adjacent tissues, the upper and lower figures show the positive expression of TGF-α in the tissues of different research subjects, and the positive degree is different. The percentage of TGFA antibody-positive cells in the lower figure is significantly higher, suggesting that the protein expression and positive signal of TGF-α in osteosarcoma tissues are enhanced；scale bar=20 μm; *P<0.01 compared with normal圖1 骨肉瘤組織中的表達變化Fig 1 Expression changes in osteosarcoma tissues

A.Transwell was used to detect the cell migration; B.UNEL assay was used to detect the apoptosis rate of cells;scale bar=200 μm; *P<0.01 compared with miR-NC圖2 miR-499/TGF-α軸對Saos2細胞生物學功能調控Fig 2 miR-499/TGF-α axis regulated the biological function of Saos2 cells

腫瘤的發生過程源于原癌基因激活以及抑癌基因突變，因此從細胞水平探究人骨肉瘤細胞增殖、遷移等惡性生物學行為，對于診斷以及控制癌細胞進展有重要意義。因而本研究將進一步深入探究miR-499在骨肉瘤中的作用。體外細胞實驗中發現，miR-499能有效的抑制骨肉瘤Saos2的遷移和促進癌細胞凋亡，而TGF-α則恰恰相反促進了Saos2遷移能力和抑制了凋亡率，同時miR-499抑制TGF-α作為癌基因的調控作用，miR-499抑制了TGF-α的促進遷移和抑制凋亡的作用，初步證實了miR-499通過負調控TGF-α在骨肉瘤中發揮抑制作用。

綜上所述，miR-499/TGF-α軸參與骨肉瘤的發生發展，抑制骨肉瘤Saos2細胞遷移和促進凋亡，致力于為骨肉瘤診斷、治療提供新方向。

A，B.TGF-α mRNA expression was detected by RT-qPCR; C，D.expression of TGF-α protein was detected by Western blot；*P<0.01 compared with miR-NC圖3 miR-499/TGF-α軸的調控機制Fig 3 Regulatory mechanism of miR-499/TGF-α axis

A.tumor growth curve of each group; B.tumor weight of mice in each group; C.immunohistochemistry of osteosarcoma xenograft in nude mice; scale bar=200 μm, *P<0.01 compared with miR-NC圖4 miR-499 mimic和miR-499抑制劑對裸鼠移植骨肉瘤的影響Fig 4 Effects of mir-499 mimic and mir-499 inhibitor on osteosarcoma transplantation in nude mice