秦皮甲素抑制人鼻咽癌細胞系HNE-3增殖

沈永華，汪峻峰，程澤星，馮娟娟

(揚州大學附屬醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，江蘇 揚州 225001)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是臨床常見的一種頭頸部惡性腫瘤，目前采用放射治療、化學藥物等方式治療鼻咽癌，但患者治療后的不良反應大且易發生轉移，因而尋找高效且安全的治療藥物或治療方式成為亟待解決的問題[1]。從植物中提取的有效活性成分具有抗氧化、抗腫瘤等作用，并可通過多途徑、多靶點等發揮作用，但其具體作用機制仍需進一步探究[2-4]。秦皮甲素(esculin)是從中藥秦皮中提取的有效成分，其具有抗腫瘤等作用，研究表明秦皮甲素可抑制肺癌細胞增殖[5]。但秦皮甲素與鼻咽癌相關研究尚未見報道。環狀RNA(circular RNA，circRNA)是由外顯子和內含子選擇性剪切形成的閉合環狀RNA分子，其不具有5′端帽子與3′尾巴結構且不易被外切核酸酶降解，并可參與腫瘤細胞增殖、分化、遷移及侵襲等生物學行為，研究表明circ-ZNF609在鼻咽癌細胞中表達量升高，并可促進細胞增殖及轉移[6]。但circ-ZNF609是否可作為鼻咽癌的治療靶點尚未闡明。因此，本研究旨在探討秦皮甲素是否可通過調控circ-ZNF609的表達而影響鼻咽癌細胞生物學行為，為鼻咽癌治療藥物的研發提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秦皮甲素(esculin)(中國食品藥品檢定研究院；批號：110756-201803)；人鼻咽癌細胞系HNE-3(上海賓穗生物科技有限公司)；熒光定量PCR試劑、Trizol試劑、反轉錄試劑(Thermo Fisher公司)；circ-ZNF609小分子干擾RNA(si-circ-ZNF609)及其陰性對照(si-NC)(廣州市銳博生物科技有限公司)；pcDNA、circ-ZNF609過表達載體(pcDNA-circ-ZNF609)(上海吉滿生物科技有限公司)；CCK-8試劑、Matrigel基質膠、丙酮酸激酶、己糖激酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；Transwell小室(Corning公司)；葡萄糖攝取檢測試劑盒(AAT Bioquest公司)；兔抗人MMP-2、MMP-9與二抗(CST公司)；乳酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的處理及分組：取對數生長期HNE-3細胞按每孔5×103個/100 μL接種96孔板(100 μL/孔)，分別加入含有不同濃度秦皮甲素(0.2、0.6、1.8 mmol/L)的培養基培養24 h[7]，分別記為esculin-L組和esculin-M組、esculin-H組。同時將正常培養的HNE-3細胞記為Ctrl組。按照Lipofectamine 2000轉染試劑分別將si-NC、si-circ-ZNF609轉染至HNE-3細胞，分別記為si-NC組、si-circ-ZNF609組。pcDNA、pcDNA-circ-ZNF609分別轉染至HNE-3細胞后加入含有1.8 mmol/L秦皮甲素的培養基培養24 h，分別記為esculin-H+pcDNA組、esculin-H+pcDNA-circ-ZNF609組。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖：消化重懸各組HNE-3細胞，按照每孔3×104個/100 μL接種96孔板，加入10 μL CCK-8試劑，培養2 h后，用酶標儀檢測每孔在450 nm波長處的吸光度值(A值)并計算細胞存活率[實驗組A值/對照組A值×100%]。

1.2.3 檢測葡萄糖攝取水平、乳酸水平與丙酮酸激酶、己糖激酶的活性：收集各組HNE-3細胞，按照葡萄糖攝取水平檢測試劑盒檢測細胞葡萄糖攝取量，收集細胞培養液上清，按照乳酸水平檢測試劑盒檢測乳酸含量。將各組HNE-3細胞按照每孔1×104個接種于12孔板，離心后棄上清，加入1 mL提取液，應用超聲波破碎細胞，8 000×g，離心10 min，收集細胞上清后采用丙酮酸激酶、己糖激酶檢測試劑盒檢測其活性。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞遷移與侵襲：遷移實驗：首先用無血清培養基調整各組HNE-3細胞為1×105個/mL單細胞懸液。按照100 μL/孔接種上室，下室接種600 μL完全培養基，培養24 h后取出小室，用多聚甲醛固定遷移細胞20 min，0.1%結晶紫染色10 min，流水漂洗后晾干，于顯微鏡下計數。侵襲實驗：將培養基與Matrigel基質膠按照1∶6的比例充分混勻，分別在小室的上室加入100 μL稀釋液，培養箱內凝固5 h備用，后續實驗步驟同遷移實驗。

1.2.5 RT-qPCR檢測細胞中circ-ZNF609的表達水平：用Trizol試劑分別提取各組HNE-3細胞總RNA，檢測RNA濃度和純度合格后，進行反轉錄合成cDNA，嚴格按照試劑盒說明書配置反應體系與設置反應條件進行RT-qPCR。以2-ΔΔCt法計算circ-ZNF609(以GAPDH為內參基因)相對表達量。

1.2.6 Western blot檢測MMP-2、MMP-9蛋白表達量:用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，取40 μg蛋白加入樣品緩沖液，混勻后置沸水浴5 min，經10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉孵育2 h，分別與一抗MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)在4 ℃條件下孵育24 h，TBST洗膜后與二抗(1∶10 000)在室溫下孵育1 h，凝膠成像系統拍照，應用ImageJ軟件測定各條帶相對灰度值。

1.3 統計學分析

采用SPSS21.0統計學軟件分析數據，計量資料以均數±標準差(x±s)表示且均符合正態分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 秦皮甲素對HNE-3細胞糖酵解增殖的影響

Esculin-L組、esculin-M組、esculin-H組細胞存活率低于Ctrl組(P<0.001)，葡萄糖攝取水平和乳酸水平低于Ctrl組(P<0.001)，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性低于Ctrl組(P<0.001)，且不同劑量組間比較差異有統計學意義(P<0.001)(表1)。

表1 秦皮甲素對HNE-3細胞增殖及糖酵解的影響Table 1 Effect of esculin on the proliferation and glycolysis of HNE-3 cells(x±s，n=9)

2.2 秦皮甲素對HNE-3細胞遷移及侵襲的影響

esculin-L組、esculin-M組、esculin-H組遷移及侵襲細胞數低于Ctrl組(P<0.001)，MMP-2、MMP-9蛋白水平低于Ctrl組(P<0.001)，且不同劑量組間比較差異有統計學意義(P<0.001)(圖1，表2)。

圖1 Western blot檢測秦皮甲素處理對MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響Fig 1 Western blot detected effects of esculin treatment on the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins

表2 秦皮甲素對HNE-3細胞遷移及侵襲的影響Table 2 The effect of esculin on HNE-3 cell migration and invasion(x±s，n=9)

2.3 秦皮甲素對HNE-3細胞中circ-ZNF609表達量的影響

與Ctrl組比較，esculin-L組、esculin-M組、esculin-H組circ-ZNF609的表達量降低(P<0.001)，且不同劑量組間比較差異有統計學意義(P<0.001)(表3)。

表3 秦皮甲素對HNE-3細胞中circ-ZNF609表達量的影響Table 3 Effect of esculin on the expression of circ-ZNF609 in HNE-3 cells(x±s，n=9)

2.4 干擾circ-ZNF609表達對HNE-3細胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲的影響

si-circ-ZNF609組細胞存活率低于si-NC組(P<0.001)，葡萄糖攝取水平和乳酸水平低于si-NC組(P<0.001)，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性低于si-NC組(P<0.001)，遷移及侵襲細胞數低于si-NC組(P<0.001)，MMP-2、MMP-9蛋白水平低于si-NC組(P<0.001)(圖2，表4)。

表4 干擾circ-ZNF609表達對HNE-3細胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲的影響Table 4 Effect of interference with circ-ZNF609 expression on the proliferation, glycolysis, migration and invasion of HNE-3 cells(x±s，n=9)

圖2 Western blot檢測干擾circ-ZNF609對MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響Fig 2 Western blot detected the effects of circ-ZNF609 interference on the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins

2.5 circ-ZNF609過表達能夠推進恢復秦皮甲素對HNE-3細胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲的抑制作用

esculin-H+pcDNA-circ-ZNF609組細胞存活率高于esculin-H+pcDNA組(P<0.001)，葡萄糖攝取水平和乳酸水平高于esculin-H+pcDNA組(P<0.001)，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性高于esculin-H+pcDNA組(P<0.001)，遷移及侵襲細胞數高于esculin-H+pcDNA組(P<0.001)，MMP-2、MMP-9蛋白水平高于esculin-H+pcDNA組(P<0.001)(圖3，表5)。

表5 circ-ZNF609過表達能夠恢復秦皮甲素對HNE-3細胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲的抑制作用Table 5 Over-expression of circ-ZNF609 could restore the inhibitory effects of esculin on the proliferation, glycolysis, migration and invasion of HNE-3 cells(x±s，n=9)

圖3 Western blot檢測circ-ZNF609過表達聯合秦皮甲素處理對MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響Fig 3 Western blot detected the effects of circ-ZNF609 over-expression combined with cetin treatment on the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins

3 討論

秦皮甲素可能通過調控細胞周期相關通路而抑制三陰性乳腺癌細胞增殖[8]。秦皮甲素可通過抑制細胞外信號調節激酶1/2的磷酸化水平而促進肺癌細胞凋亡[9]。但秦皮甲素對鼻咽癌細胞系HNE-3生物學行為的影響尚未可知。本研究結果顯示，秦皮甲素能夠以濃度依賴性的方式降低HNE-3細胞存活率，提示秦皮甲素可抑制HNE-3細胞增殖。腫瘤發生發展與能量供應密切相關，糖酵解途徑可供給腫瘤細胞能量，丙酮酸激酶、己糖激酶是糖酵解途徑中的主要激酶，抑制丙酮酸激酶、己糖激酶活性可促進氧化磷酸化的發生從而加速癌細胞的增殖及轉移[10]。本研究發現，秦皮甲素可降低HNE-3細胞葡萄糖攝取水平和乳酸水平，還可降低丙酮酸激酶和己糖激酶的活性，且呈劑量依賴性，提示秦皮甲素可抑制HNE-3細胞糖酵解從而抑制細胞增殖。MMP-2、MMP-9屬于基質金屬蛋白酶，其在鼻咽癌細胞中表達量升高并可促進細胞轉移[11]。本研究結果顯示，秦皮甲素處理后HNE-3細胞遷移及侵襲細胞數減少，MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，且呈劑量依賴性，提示秦皮甲素可抑制HNE-3細胞遷移及侵襲。但秦皮甲素調節HNE-3細胞生物學行為的分子機制尚需進一步驗證。

本研究發現，秦皮甲素能夠劑量依賴性地降低HNE-3細胞中circ-ZNF609的表達量，提示秦皮甲素可能通過抑制circ-ZNF609的表達而發揮抗鼻咽癌的作用。研究表明胃癌組織與細胞系中的circ-ZNF609水平升高，敲除circ-ZNF609可抑制細胞增殖及侵襲[12]。結直腸癌組織中circ-ZNF609呈高表達，抑制circ-ZNF609表達可抑制結直腸癌細胞遷移[13]。circ-ZNF609在肺腺癌組織和細胞系中表達上調，抑制其表達可抑制肺腺癌細胞增殖[14]。本研究結果顯示，干擾circ-ZNF609表達后HNE-3細胞存活率降低，葡萄糖攝取水平和乳酸水平降低，丙酮酸激酶和己糖激酶的活性降低，遷移及侵襲細胞數減少，而上調circ-ZNF609表達可逆轉秦皮甲素對HNE-3細胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲的抑制作用，提示秦皮甲素可通過抑制circ-ZNF609表達而抑制HNE-3細胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲。

綜上所述，秦皮甲素可抑制HNE-3細胞增殖、糖酵解、遷移及侵襲，其作用機制與抑制circ-ZNF609的表達有關，circ-ZNF609可能作為秦皮甲素治療鼻咽癌的潛在靶點，circ-ZNF609在鼻咽癌發生發展過程中表現為癌基因的作用，可為鼻咽癌生物靶向治療提供實驗依據，還可為進一步揭示秦皮甲素治療鼻咽癌的分子機制奠定實驗基礎。