信號肽及發酵條件優化促進膠原蛋白在谷氨酸棒桿菌中分泌表達

齊靜靜，范炳森，張萌，許菲

(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

膠原蛋白是哺乳動物體內含量最多的一類蛋白質，占蛋白質總量的25%～30%，是動物結締組織和細胞外基質的重要組成成分。膠原蛋白由3條左旋多脯氨酸α鏈以相錯一個殘基的形式相互纏繞形成右手三股螺旋[1]，典型的三股螺旋結構決定了其具有良好的生物力學性能和生物相容性[2]，在醫藥組織工程、化妝品、食品等領域[3]均有廣泛的應用，2019年全球膠原蛋白市場規模達153.56億美元，并保持穩步增長的趨勢。目前市面上的膠原蛋白主要通過動物提取獲得，具有潛在的免疫原性，有一定的安全隱患；此外，也可通過轉基因動植物表達和化學合成獲得，但往往價格昂貴、產量低，難以大批量生產。而微生物發酵表達重組膠原蛋白由于具有安全性高、成本低、產量高、序列設計靈活等優點[4]，近年來受到了越來越廣泛的關注，市場潛力大。

目前重組膠原蛋白常用的表達系統有大腸桿菌(Escherichiacoli)和畢赤酵母(Pichiapastoris)，大腸桿菌具有發酵周期短、表達量高、便于遺傳操作等優點，是蛋白質異源表達最廣泛的宿主菌。利用大腸桿菌表達來源于化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的膠原蛋白Scl2[5]，即使缺乏脯氨酸羥化酶修飾，仍能形成穩定的三股螺旋結構，且在接近、甚至略高于37 ℃穩定性較好，在搖瓶水平膠原蛋白V-CL的最優產量為300 mg/L，補料分批發酵最優產量為19 g/L[6-7]；通過共表達伴侶蛋白、響應面優化等策略可以促進單鏈類人源膠原蛋白在大腸桿菌中的異源表達[8-9]，其中類人源II型膠原蛋白產量達到14.2 g/L[10]。然而由于大腸桿菌外膜的屏障作用，外源蛋白多為胞內表達，且易形成包涵體，此外，大量內毒素的存在也為后期純化帶來壓力。酵母作為真核表達系統，可進行翻譯后修飾，并且無致病性、易進行高密度發酵。利用畢赤酵母分泌表達單鏈重組人源膠原蛋白的研究比較成熟，人源Ш型膠原蛋白α1鏈的膠原域片段經親水性改造及補料分批發酵條件優化，產量提高至19.49 g/L[11]；其膠原域全長在畢赤酵母GS115的胞外分泌產量最高達3.36 g/L[12]。然而由于缺少促進三股螺旋折疊的C-端前導肽，重組膠原蛋白只能以單鏈的形式分泌到胞外。通過表達帶有C-端前導肽的膠原蛋白序列和共表達羥化酶可以促進人源膠原蛋白在畢赤酵母中折疊形成三股螺旋[13]，但是會導致其表達量下降和在內質網中的積累[14]；即使僅截取9 kDa的膠原域片段并將C-端前導肽替換為分子量低的折疊域仍無法在畢赤酵母分泌具有三股螺旋結構的膠原蛋白[15]。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是公認的符合食品安全標準的宿主，不含內毒素，可應用于氨基酸、有機酸、藥用蛋白等的生產，其含有豐富的信號肽序列和單層膜結構，且胞外很少檢測到蛋白酶活性，有利于異源蛋白的分泌表達。目前研究表明其具有2條主要分泌途徑，通過不同信號肽使蛋白質穿過細胞膜，分別是分泌未折疊蛋白的Sec依賴型和轉運折疊蛋白的Tat依賴型。對C.glutamicumATCC 13032的胞外蛋白組進行研究，發現在搖瓶水平，分泌型蛋白Cg2052的含量最高[16]；對該菌株在高密度培養條件下的分泌組分析，發現胞外蛋白Cg1514占比最高[17]，以Cg1514的信號肽介導分泌淀粉酶的產量達786.2 mg/L；PorB是谷氨酸棒桿菌中4種孔道蛋白之一，對陰離子選擇型細胞壁通道的形成起重要作用，可以有效地作為錨定蛋白用于細胞表面展示，而且其信號肽介導的Sec依賴性分泌途徑可以高效分泌外源蛋白，介導M18 scFv的分泌量達68 mg/L[18]；CspB作為幾種谷氨酸棒桿菌菌株的主要分泌蛋白和表面蛋白，其信號肽作為Sec類型的強信號肽用于多種外源蛋白的分泌表達[19]。對C.glutamicumR基因組分析發現，由CgR0949介導的Tat依賴型分泌途徑分泌的α-淀粉酶活性最高[20]；后續與Ptac啟動子結合CgR0949進行(green fluorescent protein,GFP)分泌表達，產量可達2.8 g/L；此外，有研究報導來源于大腸桿菌的TorA信號肽可以有效地介導GFP在C.glutamicumATCC 13869中經Tat依賴型途徑的分泌表達[21]，過表達Tat途徑的TatABC蛋白的同時用TorA信號肽介導分泌的pro-TG蛋白的量大于經Sec途徑的產量[22]。

為了搭建谷氨酸棒桿菌分泌表達重組膠原蛋白的平臺，本研究選用來自Streptococcuspyogenes膠原蛋白Scl2中穩定性較高的B片段(約占CL膠原域的1/3)[6]為研究對象，在B前端插入輔助膠原折疊形成三股螺旋結構的V-domain和胰蛋白酶切位點LVPRGS，通過在V-B前端引入不同信號肽，并進行發酵條件優化，對目的蛋白進行分離純化和表征。本研究為重組膠原蛋白異源表達新宿主的選擇提供基礎，也為谷氨酸棒桿菌分泌表達信號肽的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌E.coliJM109用于載體構建和擴增，谷氨酸棒狀桿菌C.glutamicumATCC 13032用于目的基因表達；大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達質粒pXMJ19、克隆有V-B基因的質粒pCold-III-V-B，本實驗室保藏。擴增不同信號肽構建重組質粒pXMJ19-SPs-V-B所用的引物(表1)蘇州金唯智生物科技有限公司。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 主要試劑和培養基

蛋白Marker、Prime STAR?HS(Premix)、Blunting Kination Ligation (BKL) Kit、T4 DNA Ligase，TaKaRa公司；異丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、氯霉素，上海生工生物工程股份有限公司；腦心浸出液肉湯(brain heart infusion,BHI)，青島海博生物；其他試劑均為國產分析純。

LB培養基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，固體培養基含瓊脂糖15；氯霉素作為大腸桿菌抗性篩選時，終質量濃度為30 μg/mL。

種子培養基：BHI培養基。

發酵培養基1(g/L)[23]：(NH4)2SO420，玉米漿干粉20，K2HPO41，KH2PO41，MgSO40.25，3-(N-嗎啉基)丙磺酸鈉鹽42，葡萄糖20，pH 7.0。

發酵培養基2：BHI培養基。

發酵培養基3(g/L)：葡萄糖150，(NH4)2SO440，KH2PO41，MgSO40.5，玉米漿15，酵母膏1，蛋白胨0.5，MnSO4·H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.01，焦磷酸硫銨素0.001，生物素0.001，輕質碳酸鈣20，pH 7.2。

氯霉素在谷氨酸棒桿菌中作為抗性篩選時，終質量濃度為15 μg/mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體的構建

pXMJ19-V-B的構建：將質粒pCold-III-V-B和空載pXMJ19均用Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切，分別回收目的產物，經純化后，用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接，并轉化至E.coliJM109中，然后涂布于含30 μg/mL氯霉素的LB平板，挑取轉化子于37 ℃培養，提取質粒，將測序驗證正確的重組質粒命名為pXMJ19-V-B。

pXMJ19-SPs-V-B的構建：以質粒pXMJ19-V-B為模板，設計引物CspB-F/R、PorB-F/R、Cg1514-F/R、CgR0949-F/R、Cg2052-F/R、TorA-F/R，通過PCR獲得帶有6種不同信號肽的重組質粒。PCR體系為：Prime STAR HS (Premix) 25 μL、上下游引物1 μL、模板1 μL，加水至50 μL。PCR擴增條件為：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55～68 ℃ 10 s，72 ℃ 8 min，30個循環；72 ℃ 10 min。產物回收后做磷酸化處理，16 ℃過夜連接，轉化至E.coliJM109，然后涂布于含30 μg/mL氯霉素的LB平板，培養12～14 h挑取單菌落培養送基因測序。測序驗證正確后，將質粒命名為pXMJ19-SPs-V-B。

1.2.2 谷氨酸棒桿菌的轉化

將測序正確的重組質粒pXMJ19-SPs-V-B電擊轉化進C.glutamicumATCC 13032感受態細胞，通過抗性篩選得到陽性轉化子，并命名為C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-SPs-V-B。為了能夠更好地反映信號肽的分泌表達情況，同時構建胞內表達C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-V-B作為對照菌株。

1.2.3 重組菌誘導表達的初始條件

將保存重組菌的甘油管在BHI平板上劃線，30 ℃，培養24～32 h，然后挑取單菌落至5 mL的BHI中，30 ℃，200 r/min過夜培養；取一定量的種子液轉接至發酵培養基[23]，使初始OD600為0.1，28 ℃，200 r/min培養3 h后添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L進行誘導，培養48 h。

1.2.4 重組菌發酵條件的優化

(1)信號肽的優化：將C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-SPs-V-B和C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-V-B分別誘導表達，每隔8 h取樣靜置15 min測OD600，并繪制生長曲線，誘導結束后，收集發酵上清液，濃縮20倍進行SDS-PAGE分析，比較目的條帶的粗細，確定最優信號肽。

(2)發酵培養基的優化：選擇最優信號肽對應菌株，分別用發酵培養基1、2、3進行誘導表達，誘導結束后取上清液濃縮后進行SDS-PAGE分析，確定最佳發酵培養基。

(3)起始誘導OD600的優化：將種子液轉至最佳發酵培養基，在OD600分別為2、6、10、14時，加入IPTG誘導，48 h后取上清液濃縮，通過SDS-PAGE確定最佳誘導時機。

(4)誘導時長的優化：在最佳起始誘導OD600，加入IPTG分別誘導24、32、40、48、56、64 h，探究誘導時長對pXMJ19-SP-V-B表達量的影響。

(5)IPTG濃度的優化：在最佳起始誘導OD600加入終濃度分別為0.2、0.5、0.8、1.1 mmol/L的IPTG，28 ℃誘導至最佳時長，研究IPTG濃度對pXMJ19-SP-V-B表達的影響。

(6)溶氧條件的優化：在最優條件基礎上，將誘導表達培養基的裝液量改為50 mL/500 mL(帶擋板搖瓶)、50 mL/500 mL、100 mL/500 mL(帶擋板搖瓶)、100 mL/500 mL，研究不同溶氧條件對表達的影響。

1.2.5 膠原蛋白的純化

在最優發酵條件下，收集菌液，4 ℃、12 000 r/min離心25 min，取上清液，經0.22 μm水系濾膜過濾。然后用His TrapTMHP 5 mL親和純化，先用5倍柱體積結合緩沖液A(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑、pH 7.4)平衡，再以5 mL/min的流速上樣。上樣結束后，用洗脫緩沖液B(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑、pH 7.4)進行梯度洗脫獲得目的蛋白，并利用SDS-PAGE分析純化情況。

1.2.6 胰蛋白酶酶切

將純化后的膠原蛋白與胰蛋白酶以物質的量比250∶1的比例混合，16 ℃過夜酶切后，用HiTrap Desalting做脫鹽處理，以超純水為流動相，流速為5 mL/min，經SDS-PAGE驗證后進行真空冷凍干燥。

1.2.7 圓二色譜檢測

將凍干后的樣品用10 mmol/L、pH 7.4的PB緩沖液溶解成1 mg/mL的溶液，4 ℃平衡48 h后進行圓二色譜鑒定。全波長是在4 ℃下以1 nm為間隔測定190～260 nm的圓二色譜光譜，平均掃描時間為5 s。熱變曲線是通過監測225 nm處的圓二色譜信號，以10 ℃/h的升溫速率從10 ℃升高到70 ℃獲得的，每個溫度下平衡8 s，熔融溫度(Tm)通過擬合熱變曲線的一階導數求得。

2 結果與分析

2.1 不同信號肽對重組菌表達的影響

信號肽種類不同，介導分泌外源蛋白的能力也有所差別。為了研究不同信號肽對重組膠原蛋白表達的影響，在目的基因前端分別引入信號肽CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052、TorA，構建重組菌進行誘導表達。如圖1-a所示，引入信號肽的菌株整體生長趨勢相近，在誘導期的前24 h，均保持較快的生長速度，積累較多菌體；誘導24～48 h，菌體生長速度明顯變緩，OD600維持在25左右；對照菌株V-B在誘導期的前24 h生長趨勢與其他菌株相似，但誘導24～40 h仍保持較高的生長速度，誘導40～48 h趨于平穩，OD600約為28。誘導結束后，取發酵上清液進行SDS-PAGE分析，如圖1-b、圖1-c所示，與未插入信號肽的對照菌株相比，所有引入信號肽的菌株發酵上清液中均出現分子質量約為23 kDa的條帶，高于目的蛋白的理論分子質量17.82 kDa，這可能是由于膠原域含有大量的脯氨酸，導致膠原蛋白在SDS-PAGE中遷移速度較慢，表觀分子質量約為理論分子質量的1.4倍[24]。其中，Cg1514、CspB、PorB介導分泌蛋白的效果較好，尤其是PorB對應目的蛋白條帶最粗，因此選擇PorB作為介導膠原蛋白V-B分泌的信號肽。

a-不同重組菌株的生長曲線；b-引入信號肽菌株的發酵上清液的SDS-PAGE圖；c-對照菌株(未插入信號肽)發酵上清液的SDS-PAGE圖(1～6分別對應引入信號肽CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052、TorA的菌株；M: premixed protein marker)圖1 信號肽對菌體生長和蛋白表達的影響Fig.1 Effects of different signal peptides on bacterial growth and protein expression

谷氨酸棒桿菌ATCC 13032在搖瓶水平胞外含量最高的蛋白是Cg2052[16]，而在高密度培養條件下胞外的Cg1514蛋白含量最高，本研究中信號肽Cg1514介導分泌膠原蛋白的量明顯高于信號肽Cg2052，這種差異可能是由于搖瓶培養條件的區別[17]，也可能是由于宿主菌胞外蛋白含量的高低并不能完全決定其信號肽分泌外源蛋白能力的強弱。YIM等[17]對比了搖瓶水平信號肽Cg1514和PorB介導分泌內切木聚糖酶的能力，發現Cg1514介導分泌目的蛋白的產量高；而在本實驗中PorB作為信號肽分泌V-B的量約為Cg1514的1.8倍，這可能和蛋白自身性質有關，如蛋白結構和形態等[25]，或者與目的蛋白和信號肽的適配性有關[26]。此外，從分泌途徑來說，作為Sec依賴型信號肽的Cg1514、CspB、PorB介導的膠原蛋白產量高于Tat依賴型的信號肽CgR0949和TorA，在最新的研究中利用谷氨酸棒桿菌分泌表達蛛絲蛋白，其主要分泌途徑為Sec依賴型[27]，因此推測Sec依賴型信號肽介導的分泌途徑有利于膠原蛋白、蛛絲蛋白等纖維狀蛋白的分泌表達。

2.2 發酵培養基對C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達的影響

在微生物發酵培養的過程中，合適的營養供給是微生物快速生長和目的產物大量合成的基礎。為了獲得適合C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達的發酵培養基，選取了3種谷氨酸棒桿菌常用培養基1、2、3進行重組菌的發酵。如圖2-a所示，重組菌在3種發酵培養基中的生長狀況有明顯差異：在培養基2中，誘導16 h菌濃度達到最高，直到誘導結束一直維持在10左右，菌體生長受限，積累菌量最少；在培養基1中，菌體前期生長迅速，后期生長趨勢變緩，誘導24～48 h，OD600逐漸增加到25左右；發酵培養基3中菌體前期生長速度雖低于培養基1，但誘導40 h內一直維持較高的增長速度，誘導48 h時OD600與培養基1相當。

a-不同培養基下菌株的生長曲線；b-不同培養基下發酵上清液的SDS-PAGE圖(泳道1～3分別對應培養基1、2、3)圖2 培養基條件對菌體生長和蛋白表達的影響Fig.2 Effects of medium conditions on bacterial growth and protein expression

取發酵上清液做SDS-PAGE鑒定，如圖2-b所示，培養基1中目的蛋白表達量最高，條帶最粗；培養基3次之；培養基2產量最低，幾乎看不到條帶。分析膠原蛋白在培養基1表達量高的原因可能包括：

(1)培養基1中特有的3-(N-嗎啉基)丙磺酸鈉鹽可提供pH在6.5～7.9范圍的緩沖環境，有利于菌體的快速生長和外源蛋白的表達；(2)培養基1和培養基3雖然誘導結束菌濃度相近，但培養基1中的菌體前期生長速度快，積累了較多菌量，在發酵后期較培養基3更有利于目的蛋白的表達和積累。因此，選擇培養基1作為重組膠原蛋白V-B分泌表達的發酵培養基。

2.3 起始誘導OD600對C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達的影響

起始誘導OD600對重組菌合成目的蛋白有很大影響，當菌體處于對數生長期，活力最強，能很快適應添加誘導劑后的環境，迅速進入蛋白合成期。為了探究起始誘導OD600對C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達的影響。如圖3-a所示，培養前4 h，菌種處于延滯期，生長緩慢，OD600約為2；培養4 h后開始進入對數期，4～14 h為菌種的對數生長期，OD600從5提高至18；之后生長速度明顯變緩。因此，在種子液轉接至發酵培養基后，控制OD600分別達到2、6、10、14時，添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L進行誘導，28 ℃培養48 h，每隔8 h測定OD600并繪制生長曲線。如圖3-b所示，受起始OD600的影響，菌株在誘導表達前8 h，OD600仍維持較大差距。誘導16 h，差距明顯縮小，OD600達到22左右；誘導24 h后，菌體生長速度變緩，OD600以較低速度增長，誘導48 h，所有條件的最終OD600差別不大，都達到28左右。由圖3-c可知，誘導結束后，起始OD600為2和6的菌株對應目的條帶較粗，蛋白表達量高。可能是由于起始OD600為10和14的菌株誘導劑添加時間較晚，前期培養基中營養物質被大量消耗，影響后期目的蛋白合成。而OD600為2時，可觀察到菌體處于延滯期，故選取處于對數生長期的OD600=6為最佳起始誘導菌濃度。

a-未加誘導劑菌株的生長曲線；b-不同起始誘導OD600下菌株的生長曲線；c-不同起始誘導OD600下發酵上清液的SDS-PAGE圖(泳道1～4分別對應起始誘導OD600為2、6、10、14；M-premixed protein marker)圖3 起始誘導OD600對菌體生長和蛋白表達的影響Fig.3 Effect of initial induction of OD600 on bacterial growth and protein expression

2.4 誘導時長對C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B表達的影響

由圖3-b誘導期菌濃度變化情況發現，誘導48 h，OD600仍有緩慢上升的趨勢，表明菌體仍在積累，誘導時間會影響菌量和目的蛋白的表達量。為了確定最佳誘導時長，在OD600=6時加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L進行誘導。由圖4-a可看出，在誘導前16 h，菌體保持較快的生長速度，誘導16～48 h，菌體生長速度放緩，誘導48～64 h，OD600趨于穩定，維持在28左右。從圖4-b可觀察到，在24～40 h，目的條帶亮度增加，目的蛋白表達量隨誘導時間的延長而增加；誘導時間超過40 h后，目的蛋白條帶沒有明顯的變化，蛋白未出現降解的跡象。考慮到隨著培養時間的延長，體系中營養物質有限，會積累較多代謝產物，導致菌體衰退和老化，以及獲得更高的時空產量，故選取40 h為最佳誘導時長。

a-不同誘導時長菌株的生長曲線；b-不同誘導時長下發酵上清液的SDS-PAGE圖(泳道1～6分別對應發酵時長24、32、40、48、56、64 h)圖4 誘導時長對菌體生長和蛋白表達的影響Fig.4 Effect of induction time on bacterial growth and protein expression

2.5 IPTG濃度對C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達的影響

IPTG作為半乳糖的結構類似物，能夠誘導乳糖操縱子下游基因的表達，其添加量對菌株生長及蛋白產量可能有一定影響。為了確定誘導劑最適添加濃度，在OD600=6時加入IPTG。從圖5-a可看出，IPTG濃度對菌體整體生長趨勢無太大影響。由圖5-b可知，IPTG終濃度為0.5 mmol/L時，目的蛋白條帶最粗，0.2 mmol/L次之；終濃度為0.8和1.1 mmol/L的目的條帶較淺，可能是由于較高的誘導劑濃度會造成菌體代謝壓力大而導致蛋白產量下降[28]。因此在本實驗中誘導劑IPTG的最佳工作濃度為0.5 mmol/L。

a-不同IPTG濃度下菌株的生長曲線；b-不同IPTG濃度下發酵上清液的SDS-PAGE圖(泳道1～4分別對應IPTG濃度為0.2、0.5、0.8、1.1 mmol/L)圖5 IPTG濃度對菌體生長和蛋白表達的影響Fig.5 Effects of IPTG concentration on bacterial growth and protein expression

2.6 溶氧對C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達的影響

谷氨酸棒桿菌是嚴格的好氧型細菌，其生長代謝和產物合成均需要氧氣，因此氧氣濃度至關重要。由圖6-a可看出，在誘導相同時長下，帶擋板的搖瓶OD600比不帶擋板的高，且相同類型搖瓶，裝液量低的OD600較高，說明溶氧對菌體的生長狀況影響較大。誘導0～8 h，帶擋板搖瓶的菌體生長速度很快，約為相同裝液量不帶擋板搖瓶的2倍，其中裝液量為50 mL和100 mL的帶擋板搖瓶在誘導8 h的OD600分別超過50和43，之后OD600無太大變化，進入穩定期；不帶擋板搖瓶條件下的菌體OD600在誘導0～24 h穩定增長，誘導24 h后，OD600保持平穩，誘導40 h后，裝液量50 mL和100 mL的搖瓶OD600分別達到40和28。如圖6-b所示，裝液量50 mL帶擋板的搖瓶目的條帶最粗。表明溶氧對菌體生長和蛋白表達有顯著影響，高的溶氧條件有利于菌體生長和外源蛋白表達。YANG等[29]在谷氨酸棒桿菌中表達腈水合酶，搖瓶培養最高OD600為15.6，酶活性為143.1 U/mL，在10 L發酵罐中的高密度發酵，OD600達到200，總酶活性達到1 432 U/mL，表明在發酵罐水平對溶氧的嚴格控制可以顯著提高谷氨酸棒桿菌中外源蛋白的表達，對進一步高密度培養有指導意義。

a-不同溶氧條件下的生長曲線；b-不同溶氧條件下發酵上清液的SDS-PAGE圖(1～4分別對應50 mL/500 mL、50 mL/500 mL帶擋板搖瓶、100 mL/500 mL、100 mL/500 mL帶擋板搖瓶)圖6 溶氧對菌體生長和蛋白表達的影響Fig.6 Effects of dissolved oxygen on bacterial growth and protein expression

2.7 重組膠原蛋白V-B的表征

重組膠原蛋白V-B包含V domain和膠原域B，純化后經胰蛋白酶消化，V domain被切成多個小肽段，而膠原域B如果正確折疊形成了具有剛性的三股螺旋結構，則不會被胰蛋白酶消化。由圖7-a可知，酶切前V-B分子質量約為23 kDa，酶切后有明顯的單一條帶，分子質量約為12 kDa，與膠原域B分子質量的1.4倍相符，可以推測分泌表達出的膠原蛋白具有三股螺旋結構。對膠原域B進行除鹽凍干處理，稱重估算產量約為30 mg/L，是優化前的3倍。為了進一步確定膠原域B的二級結構，進行了圓二色譜鑒定，如圖7-b所示，膠原域B在225 nm處有膠原蛋白的特征正峰，表明其正確折疊形成三股螺旋結構。又利用圓二色譜在10～70 ℃掃描其熱變曲線，如圖7-c所示，進行擬合后顯示膠原域B的Tm值為25.82 ℃，與文獻報道相近[30]。因此，通過信號肽的優化，構建的谷氨酸棒桿菌表達體系可以直接分泌表達具有三股螺旋結構的膠原蛋白。

PENG等[7]在大腸桿菌中表達來源于化膿性鏈球菌的全長Scl2膠原蛋白V-CL，在搖瓶水平最高產量為300 mg/L，發酵罐水平最高產量達19 g/L。本研究中膠原域B的表達量約為30 mg/L，忽略酶切、除鹽、濃縮的損失以及序列長度對蛋白表達的影響，根據分子質量估算酶切前重組膠原蛋白V-B的保守產量約為67.3 mg/L，而V-B的分子質量約為膠原蛋白V-CL的1/2，由此推算V-B在谷氨酸棒桿菌中的產量約為大腸桿菌中的1/2，且本研究中目的基因尚未進行針對宿主的密碼子優化，因此推測谷氨酸棒桿菌在分泌表達膠原蛋白上仍有較大潛力。

a-SDS-PAGE圖(泳道1為純化后的V-B，泳道2為酶切后樣品)；b-膠原域全波長圖譜；c-膠原域熱變曲線圖7 重組膠原蛋白V-B純化、酶切后的SDS-PAGE圖及膠原域B的圓二色譜圖Fig.7 SDS-PAGE after purification and digestion of V-B and circular dichroism of B domain

3 結論

本研究以食品安全級菌株谷氨酸棒桿菌為底盤細胞，通過引入不同種類信號肽介導膠原蛋白的分泌表達，結果顯示Sec依賴型信號肽PorB介導分泌膠原蛋白的產量最高，經發酵條件優化，膠原蛋白的產量提高到優化前的3倍，經圓二色譜表征，證明其膠原域正確折疊形成三股螺旋結構，同時發現溶氧是搖瓶水平影響膠原蛋白產量的關鍵因素，為工業生產水平的進一步放大試驗提供了指導。本研究是膠原蛋白在谷氨酸棒桿菌中表達的首次嘗試，后續可通過密碼子優化、表達元件和載體結構等方面的進一步優化提高膠原蛋白的表達量，并且，溶氧作為好氧發酵過程中的重要參數，通過在發酵罐水平對溶氧的嚴格控制有望大幅度提高膠原蛋白在谷氨酸棒桿菌中的產量。本研究中谷氨酸棒桿菌分泌表達膠原蛋白體系的建立，為膠原蛋白的重組表達提供了新的宿主選擇，也為微生物難以分泌具有三股螺旋結構膠原蛋白的困境提供了解決思路和理論依據。