基于灌流濃縮培養的羅伊氏乳桿菌高密度發酵研究

李子財，李林，李光洲，王建清，辛維崗，張棋麟，王峰，林連兵*

1(昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明，650500)2(云南省高校飼用抗生素替代技術工程研究中心，云南 昆明，650500)3(玉溪嘉和生物技術有限公司，云南 玉溪，653100)

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)普遍存在于人和動物腸道中，是一種對宿主有益的共生菌[1]，它可以通過代謝產生有機酸、雙乙酰、H2O2、細菌素及類細菌素等物質[2-4]，是一種具有較高生物開發價值的乳酸菌。目前羅伊氏乳桿菌被廣泛應用于食品[5]、飼料[6]、抗菌劑[7]、新型材料前體[8-9]等領域，如瑞典BioGaia公司開發的一系列L.reuteri益生菌制劑，在全世界范圍內銷售，用于改善人和動物的健康水平；我國也于2003年批準其可用于保健食品、食品和嬰幼兒食品等領域。由于羅伊氏乳桿菌自身特殊的生長特性，難以達到高密度發酵培養，導致其生產成本較高[10]，如何提高羅伊氏乳桿菌的發酵效率成為亟待解決的問題。

在傳統發酵培養模式中，多數通過調控優化培養過程中的pH、溶氧、溫度和培養基組分等參數來提高菌株發酵的密度[11]，但受限于培養過程中菌株發酵產物的不斷累積，導致菌株生長受到抑制或者死亡[12]。灌流培養技術是利用中空纖維柱截流系統使得菌株產生的代謝物能夠持續不斷的排出，同時蠕動泵持續的補充新鮮培養基，實現培養基的置換以減輕乳酸和銨根離子等代謝產物對菌株生長的負面影響，并維持菌株的持續生長代謝。該技術具有生產成本低、培養時間短、產量和活性高等特點[13-15]。

近年來，灌流培養和灌流濃縮培養技術不斷完善，已廣泛應用于哺乳細胞的高密度培養，在較小規模培養下能實現較高的產量，例如，原來產品規模需要2 000 L，如選擇灌流工藝可能只需要200 L就能實現目標[16]。目前國內已有藥明生物、嘉和生物、復宏漢霖等公司將該工藝應用于細胞的發酵生產，該工藝發展應用前景廣闊[17]。

有關羅伊氏乳桿菌高密度發酵培養的研究較少，潘海博等[18]以批培養的方式對培養基組分進行優化，活菌數達9.33×1010CFU/mL；王超[19]對培養參數進行優化，活菌數達4.4×1010CFU/mL，菌體干重(cell dry weight,CDW)13.7 g/L；KRAUTER等[20]用批補料培養的方式使得產量比批培養增加了1倍。目前灌流濃縮培養技術還未被引入到羅伊氏乳桿菌等相關益生菌的發酵培養。本文擬以羅伊氏乳桿菌DSM 17938為發酵菌株，比較批培養、批補料培養和灌流濃縮培養對羅伊氏乳桿菌發酵生物量的影響，探索羅伊氏乳桿菌高密度發酵技術。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)DSM 17938，昆明理工大學生命科學與技術學院噬菌體與腸道微生物課題組保存。

1.1.2 試劑

D(+)-無水葡萄糖、胰蛋白胨(casein tryptone，CT)、牛肉浸粉(beef extract powder，BED)、酵母浸粉(yeast extract fermentation，YEF)、Tween-80、消泡劑、瓊脂粉等，北京索萊寶科技有限公司；C2H3NaO2、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、K2HPO4、NH2HPO4、NaOH，國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖測定試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 儀器與設備

EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；DNP-9082BS型電熱恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；pHS-25數顯pH計，上海精密儀器有限公司；6500美國wisdom酶標儀，美國WAS公司；BLB10-20SJ自動發酵罐，上海百侖生物科技有限公司；BT600-2 J精密蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司；WA94510INV41LL型中空纖維柱，德國賽多利斯公司；Minispin小型高速離心機，上海心亮實業有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化與培養

從-80 ℃冰箱中取1支凍存的羅伊氏乳桿菌甘油菌，用接種環挑取少量菌液于MRS固體培養基中劃線，將平板置于37 ℃恒溫培養箱中培養36 h，挑取單菌落，接種于2 mL MRS液體培養基中，在恒溫37 ℃搖床中活化培養24 h，按5%接種量將活化后的菌液接種于搖瓶中，在恒溫37 ℃搖床中擴大培養12 h，用于上罐培養的種子液。

1.3.2 發酵液活細胞計數

每2 h取樣1次，將發酵的菌液搖勻后，取100 μL供試菌液于900 μL PBS緩沖液中，梯度稀釋后取100 μL稀釋液涂于MRS固體培養基上(3個平行樣)，放于37 ℃恒溫培養箱中培養36 h，選擇菌數為30～300的菌落平板計數，取平均值[21]。

1.3.3 菌體質量濃度的測定

取25 mL發酵液在12 000 r/min下離心10 min，棄上清液，PBS緩沖液懸浮洗滌3次，60 ℃烘干至恒重，稱量計算菌體干重(g/L)。

1.3.4 發酵液中葡萄糖含量的測定

利用葡萄糖檢測試劑盒(GOD-POD比色法)測定發酵液中的葡萄糖含量，取等體積混合試劑1和試劑2，分裝成1 mL測試管，樣品管加入10 μL待測樣品，標準管加入10 μL葡萄糖標準液，對照管加入10 μL純化水。37 ℃水浴10 min，調零后在505 nm波長下測定樣品管和標準管的吸光度，按公式(1)計算葡萄糖質量濃度：

(1)

1.3.5 羅伊氏乳桿菌批培養生長曲線的繪制

將種子液以5%的接種量接種到裝有15 L MRS液體培養基的發酵罐中，以批培養的方式發酵培養。每隔2 h取樣，搖勻后取1 mL于1.5 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min，去上清液用PBS緩沖液懸浮，測定菌液的OD600值，當菌液OD600值超過0.8時稀釋一定的倍數，使稀釋后OD600值維持在0.2～0.8，吸光度值乘以稀釋倍數即為發酵液的OD600值。以培養時間為橫坐標，發酵OD600值為縱坐標，繪制菌株生長曲線。

1.3.6 發酵培養

批培養過程如下：將上罐種子液以5%的接種量[19]接種到裝有15 L MRS液體培養基的發酵罐中，將溶氧與通氣關聯，pH與堿泵關聯，在恒pH 5.5[22]、溶氧15%[23]、恒溫37 ℃[19]，攪拌速率為120 r/min條件下有氧發酵培養，每隔2 h取樣檢測。

批補料培養過程如下：將上罐種子液以5%的接種量接種到裝有8 L MRS液體培養基的發酵罐中，將溶氧與通氣關聯，pH與堿泵關聯，在恒pH 5.5、溶氧15%、恒溫37 ℃，攪拌速率120 r/min下有氧發酵培養，當菌株OD600達對數生長中期后，每隔2 h補加2×MRS培養基1 L，補加至15 L，每隔2 h取樣檢測。

灌流濃縮培養發酵示意圖見圖1，具體過程如下：將上罐種子液以5%的接種量接種到裝有15 L MRS液體培養基的發酵罐中，將溶氧與通氣關聯，pH與堿泵關聯，在恒pH 5.5、溶氧15%、恒溫37 ℃，攪拌速率120 r/min下有氧發酵培養，當菌株發酵達對數生長中期后，啟動中空纖維柱截流系統進行濃縮補料培養，灌流流速20 mL/min，循環流速為灌流流速的10倍，每隔2 h取樣檢測。

圖1 灌流濃縮培養發酵示意圖Fig.1 Fermentation diagram of concentrated fed-batch

1.3.7 灌流濃縮培養條件優化

為探究在不通氣/通氣和恒pH/不調pH下對羅伊氏乳桿菌高密度發酵的影響，設計4個方案，工藝參數如表1所示。每隔2 h取樣檢測，以發酵過程中活菌數和發酵結束時菌體干重為主要指標，確定最優的發酵條件。

灌流流速的優化：為了維持發酵過程中細胞生長代謝的穩定，使發酵產量和活菌數最大化，根據確定的培養條件，進一步對灌流流速進行優化，分別設計灌流流速為10、20、30、40、50 mL/min，每2 h取樣檢測，以發酵過程中活菌數和發酵結束時菌體干重為主要指標，確定最佳發酵灌流流速。

表1 培養條件的優化設計Table 1 Optimum design of culture conditions

1.3.8 數據統計與分析

采用Excel和Origin Pro8.5數據軟件進行統計與分析，所有實驗數據均為3次重復實驗以平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 羅伊氏乳桿菌批培養生長曲線

按照1.3.4方法，使用自動發酵罐進行發酵，對羅伊氏乳桿菌DSM 17938的生長曲線進行測定，每隔2 h測1次發酵液吸光度值OD600。繪制的菌株生長曲線如圖2所示，0～2 h處于生長遲緩期，2～8 h步入對數生長期，OD600值急速增加，8～12 h進入生長穩定期，菌體密度達到最大值4.3×1010CFU/mL，12 h以后細胞進入衰亡期。根據菌株生長情況，確定羅伊氏乳桿菌DSM 17938在培養6 h時，可進行批補料培養和啟動灌流濃縮培養。

圖2 羅伊氏乳桿菌DSM 17938的生長曲線Fig.2 Growth curve of L.reuteri DSM 17938

2.2 羅伊氏乳桿菌不同培養方式的效果比較

由圖3-a可知，3種不同發酵方式下，活菌數呈現先增后減的趨勢，在一段時間內3種培養方式的活菌數增加變化趨勢不大，但隨著發酵的進行，菌密度持續增加。灌流濃縮培養雖然延長了發酵的周期，但凸顯出巨大優勢，在第22 h時活菌數達2.98×1015CFU/mL，CDW為53.43 g/L，是批培養和批補料培養的5.3和3.6倍(圖3-b)。通過監測發酵過程中碳源的消耗情況，發現灌流濃縮培養過程中可以持續維持較高的葡萄糖濃度，而較持續的葡萄糖補入適于乳酸菌的增殖。

上述批培養和批補料培養的實驗結果與潘海博等[18]、王超[19]研究結果相近，造成這2種培養方式活菌數和產量較低的主要原因是：(1)菌株所需碳源氮源等主要營養物質不足；(2)發酵過程中乳酸、H2O2和CO2等代謝廢物的不斷積累，導致pH值影響帶電物質的解離狀態和結構，從而影響菌株利用營養成分和代謝產物的效率[24]。而灌流濃縮培養利用中空纖維柱截流裝置，彌補了批培養和批補料培養的缺陷，實現了持續補償新鮮培養基的同時置換出菌株的代謝廢物，維持一個適宜的生長環境。綜合考慮，后續研究以灌流濃縮培養方式為基礎，對羅伊式乳桿菌進行高密度發酵的研究。

a-活菌數；b-菌體干重；c-葡萄糖含量圖3 不同培養方式對羅伊氏乳桿菌發酵的影響Fig.3 Effects of different culture methods on fermentation of L.reuteri

2.3 羅伊氏乳桿菌灌流濃縮培養條件優化

羅伊氏乳桿菌屬于兼性厭氧菌，具有較強的耐酸性，根據2.2中的研究結論，在灌流濃縮培養的基礎上，按1.3.8的實驗方法，通過監測發酵過程中活菌數和葡萄糖的消耗速率，確定培養的條件。

由圖4-a可知，在通氣發酵的前期活菌數增長速率明顯高于不通氣，隨著發酵的進行恒pH時活菌數高于不調pH，在第22 h時通氣-恒pH條件下活菌數高達2.98×1015CFU/mL，而在不通氣-不調pH時活菌數僅為1.46×1013CFU/mL；圖4-b通過監測發酵過程中碳源的消耗情況，發現在有氧時葡萄糖的消耗速率快于無氧時，恒pH時葡萄糖消耗速率要高于不調pH，也證明了通氣和pH控制對菌株的生長增殖具有重要的作用。

a-活菌數；b-葡萄糖質量濃度圖4 不同培養條件對羅伊氏乳桿菌發酵的影響Fig.4 Effects of different culture conditions on fermentation of L.reuteri

SCHIRALDI等[11]研究乳酸菌生長代謝，發現在發酵過程中維持適量的溶氧有助于菌株的生長代謝，與本實驗結論一致；不調pH時活菌數較低，主要是由于羅伊氏乳桿菌在代謝過程中產生大量的乳酸，隨著乳酸的不斷積累，導致pH值不斷下降，抑制乳酸脫氫酶的活性，從而抑制糖代謝，影響菌體能量的獲取，從而抑制了菌株的生長[25]。因此，在發酵過程中維持合適的溶氧和pH有助于菌株的生長和增殖。

2.4 羅伊氏乳桿菌灌流流速優化

灌流流速在灌流開發工藝過程中具有重要的指導價值，流速過低不足以供給菌株生長最低的營養需求，也不能及時帶走代謝廢物，導致菌株生長受限，活率下降；流速過高則培養基利用率低，成本高。由圖5-a可知，隨著灌流速度的增加，活菌數呈先增加后降低的趨勢，灌流流速為40 mL/min時，活菌數最大達8.1×1015CFU/mL，菌體干重60.96 g/L；菌體OD600值(圖5-b)和菌體干重(圖5-d)則隨流速的增加而緩慢的增加，但流速超過40 mL/min時，菌株活菌數在降低，葡萄糖濃度逐漸升高(圖5-c)，主要由于流速過大時中空纖維柱截流系統和高轉速的蠕動泵產生的高剪切力造成了菌體死亡，將高剪切力的蠕動泵換為低剪切力蠕動泵時，可有效降低細胞死亡率，即在灌流培養過程中控制合適的流速具有重要作用。

a-活菌數；b-菌株OD600值；c-葡萄糖質量濃度；d-菌體干重圖5 不同灌流流速對羅伊氏乳桿菌發酵的影響Fig.5 Effects of different irrigation rates on fermentation of L.reuteri

3 結論與討論

本研究利用3種不同培養方式對羅伊氏乳桿菌進行發酵，證明灌流濃縮培養在活菌數和產量上都凸顯出巨大的發酵優勢，通過對其發酵條件進行初步探索，確定最佳灌流發酵條件為：通氣(氧含量恒定為15%)、恒pH為 5.5、流速為40 mL/min的最優條件下活菌數達到8.1×1015CFU/mL，菌體干重60.96 g/L，相對于未優化時提升了2.72和1.07倍。本研究在培養過程中采用恒流灌流培養模式，仍然無法實現培養基利用率最大化，后期研究可通過代謝流分析不同時段發酵液中營養物質的消耗量和代謝廢物累積量，研究其糖酵解及其代謝機理，采取階段性增加流速的方式灌流培養，以實現培養基利用率的最大化。在未來益生菌工業化的進程中，獲取產量高、成本低廉和活率高的菌株是發酵工藝的最終目的。