窖泥中梭菌和互營球菌交互作用對生長和短鏈脂肪酸代謝的影響

孫紅，柴麗娟，方冠宇，陸震鳴，張曉娟，王松濤，沈才洪，史勁松，許正宏,*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學)，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫，214122)4(江蘇省生物活性制品加工工程技術研究中心，江蘇 無錫，214122)5(國家固態釀造工程技術研究中心，四川 瀘州，646000)

泥窖生香發酵是我國濃香型白酒的獨特生產方式，窖泥在濃香型白酒中發揮著不可或缺的作用，測序技術顯示窖泥微生物群落主要由梭菌綱和產甲烷古菌組成[1-3]。梭菌屬(Clostridium)是梭菌綱中的一個優勢屬，約占細菌總豐度的0.54%～4.42%[1,4-6]。與退化窖泥相比，正常和優質窖泥中梭菌的相對豐度明顯更高[4]，而且梭菌屬的相對豐度會隨著窖齡的增加而增加[6]。梭菌屬不僅是窖泥群落中的一個豐富類群，在濃香型白酒典型風味物質的形成中也發揮著重要作用[7]。目前已經通過分離培養和高通量測序方法證明梭菌屬微生物是窖泥中短/中鏈脂肪酸合成的重要屬之一[2,8-10]。此外，高通量測序結果顯示，不同窖泥樣本中互營細菌(包括互營球菌、互營單胞菌等)的豐度占總細菌的1.35%～7.64%[1,2,11]，互營細菌能夠與其他微生物進行互營代謝，但其在白酒釀造體系中與其他微生物的互作報道較少。

傳統發酵食品大多在開放環境中進行生產，發酵過程中會形成復雜的微生物群落。微生物間相互作用方式有互利共生、偏利共生和競爭等多種類型，微生物間的互作在驅動微生物群落組裝[12]、維持群落結構穩定[13]和調節群落代謝功能[14]方面起著至關重要的作用。到目前為止，關于窖泥微生物群相互作用關系的研究主要基于高通量測序數據的相關性分析[4,15]。例如，通過共現網絡分析發現梭菌綱(Clostridia)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、甲烷桿菌綱(Methanobacteria)和甲烷微菌綱(Methanomicrobia)之間存在大量顯著的正相關或負相關[4,11,16]。然而，基于共現性網絡等相關性分析方法研究的窖泥微生物群相互作用受到不同算法的影響[17]，潛在的互作關系需要通過其他方法進一步驗證。盡管目前已經從窖泥中分離出許多產脂肪酸的梭菌屬微生物，但是關于梭菌屬與其他物種之間相互作用對脂肪酸代謝的影響鮮有研究，這限制了對窖泥微生物功能的全面理解[8,9,18-19]。

實驗室前期從窖泥中分離篩選到1株互營細菌，經系統發育分析其屬于毛螺菌科(Lachnospiraceae)，命名為NovisyntrophococcusfermenticellaeJN500902T，與互營球菌SyntrophococcussucromutansDSM 3224T具有最高的序列相似性(92.8%)[20]。在前期對窖泥梭菌分離篩選時發現，互營球菌與部分梭菌共培養時存在顯著的協同效應，當前者存在時，這些梭菌菌株產丁酸、己酸等脂肪酸的能力可顯著提高。己酸和丁酸是濃香型白酒主體風味物質己酸乙酯和丁酸乙酯形成的重要前體物質。因此，為進一步探究梭菌和互營球菌之間的互作規律，本研究以從窖泥中篩選出的1株互營球菌和7株梭菌屬微生物為研究對象，結合比較基因組分析和共培養的方法，分析不同梭菌屬微生物的短鏈脂肪酸代謝途徑，以及與互營球菌共培養對生長和短鏈脂肪酸產生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

互營球菌NovisyntrophococcusfermenticellaeJN500902(N.902)、老窖梭菌ClostridiumfermenticellaeJN500901(C.901)、酪丁酸梭菌C.tyrobutyricumClt01、糞味梭菌C.scatologenesCls01、路氏梭菌C.luticellariiClu07、嗜酸梭菌C.aciditoleransClaci01、廣西梭菌C.guangxienseClgx01和拜式梭菌C.beijerinckiiClb01。以上菌株均分離自濃香型白酒窖泥，其中，N.902和C.901保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)，編號分別為CICC 24502T和CICC 24501T，其他菌株保存于本實驗室。

1.1.2 培養基

強化梭菌培養基(RCM)(g/L)：蛋白胨10，酵母粉3，葡萄糖5，可溶性淀粉1，乙酸鈉3，半胱氨酸鹽酸鹽0.5，瓊脂粉20。添加1 mL/L(1.0 g/L)的刃天青作為厭氧指示劑。pH=6.28，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器

Whitley DG250厭氧箱，英國Don Whitley Scientific；Tecan Spark多模微孔板閱讀器，瑞士Tecan；S22型微量pH計，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；Waters e2695高效液相色譜，美國Waters公司。

1.1.4 主要試劑

RCM培養基原料，國藥集團化學試劑有限公司；乙酸、丁酸和戊酸，Sigma-Aldrich公司；其他化學試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物系統進化樹分析

基于7株菌的16S rRNA基因全長序列，利用MEGA X軟件構建進化樹[21]。分析方法為鄰位相連法(neighbor-joining method)，模型選擇Kimura 2-parameter model，進化樹的檢驗方法為bootstrap method，設置重復抽樣次數為1 000，其他參數使用默認值[22]。

1.2.2 梭菌泛基因組分析

從NCBI上下載所研究梭菌物種的模式種或相似度最高的菌株基因組序列文件，基因組具體信息如表1所示。利用Prokka v1.14.6軟件預測梭菌基因組的開放閱讀框(open reading frame，ORF)[23]。使用eggNOG-Mapper對7個梭菌基因組的ORF進行功能注釋，E-value設為1e-3[24]。采用PanGP軟件的冪律模型，擬合梭菌的基因組數量與泛基因組大小和核心基因組數量的曲線[25]。使用在線網站Venn diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)統計7株梭菌屬微生物的核心基因組和菌株特異性基因進行可視化。根據KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注釋結果，統計梭菌屬微生物短鏈脂肪酸代謝通路中基因的數量差異，繪制代謝通路圖。

表1 模式菌株或代表菌株的基因組信息Table 1 Genomic information of type strains or representative strains

1.2.3 微生物共培養

種子液的制備：取出于-80 ℃冰箱中保藏的互營球菌N.902和7株梭菌，連續培養傳代3次，經劃線分離后獲得純菌株，用RCM液體培養基培養至對數生長期，制備活力良好的種子液。

共培養：互營球菌N.902和不同梭菌在裝有100 mL的250 mL三角瓶中進行純培養和共培養實驗。收集對數生長中期活力良好的互營球菌N.902和梭菌種子液，測量種子液的OD600值后，參考CHARUBIN等[26]的研究計算種子液的接種量，使得接種后純培養體系的理論初始OD600值為0.01，共培養體系理論初始OD600值為0.02。其中，共培養中互營球菌和梭菌的接種量保持一致。所有培養都在厭氧培養箱中進行，培養溫度為37 ℃，培養時間為48 h，每隔6 h取樣測定菌株生長和脂肪酸代謝情況。

1.2.4 微生物生長的檢測

每隔6 h從上述純培養和共培養的三角瓶中吸取200 μL發酵液至96孔板中，采用Tecan Spark多模微孔板閱讀器測量OD600值的變化情況。

1.2.5 葡萄糖和pH值的檢測

取發酵過程菌液0.5 mL，經適當稀釋后離心(12 000 r/min，5 min)獲得上清液，過濾膜除雜后，使用生物傳感儀測量上清液中葡萄糖含量。另取1 mL發酵液用微量pH計測定pH值。

1.2.6 短鏈脂肪酸的檢測

使用色譜柱為Sapphire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)測定短鏈脂肪酸；流動相：1 mL/min 70% NaH2PO4和30%的乙腈，用磷酸調節pH=2.7；進樣量為10 μL；流速為1 mL/min；柱溫為40 ℃；紫外檢測波長設置為210 nm；每個樣本的運行程序為20 min。

1.3 數據處理與可視化

采用在線網站(http://www.bioinformatics.com.cn)繪制花瓣圖，Graphpad Prism 8軟件繪制熱圖，Adobe Illustrator軟件繪制短鏈脂肪酸代謝通路。采用OriginPro 2021軟件對純培養和共培養的OD600、pH和葡萄糖變化進行數據處理與繪圖。所有圖片的組合使用Adobe Illustrator軟件。

2 結果與分析

2.1 系統發育樹和泛基因組分析

將互營球菌N.902和7株梭菌的16S rRNA基因全長序列在EzBioCloud數據庫和NCBI數據庫中進行Blast，互營球菌N.902和老窖梭菌C.901為實驗室前期從窖泥中篩選出的新種，全基因組測序結果已經提交至GenBank，其比對結果相似度都為100%。另外6株細菌與數據庫的Blast結果也都在97%以上，符合種水平序列相似度標準，具體的比對結果如表2所示。

表2 不同菌株的16S rRNA比對結果Table 2 Alignment results of different strains based on 16S rRNA gene sequences

以大腸桿菌EscherichiacoliATCC 11775T為外群構建最大似然法系統發育樹，結果表明互營球菌N.902單獨聚為一簇，梭菌屬微生物分成兩大支，嗜酸梭菌Claci01、糞味Cls01、老窖梭菌C.901、酪丁酸梭菌Clt01和路氏梭菌Clu07聚為一大支，拜式梭菌Clb01和廣西梭菌Clgx01進化距離較近，兩者單獨聚為一簇(圖1-a)。

a-基于16S rRNA基因序列的系統發育樹；b-7株梭菌的泛基因組積累曲線圖1 系統進化分析和泛基因組分析Fig.1 Phylogenetic analysis and pan-genome analysis

梭菌屬微生物是濃香型白酒中重要的產香功能菌群，為了進一步研究窖泥中梭菌屬微生物的生理和代謝差異，我們從NCBI數據庫中下載了7株梭菌屬細菌的全基因組進行比較分析。如圖1-b所示，泛基因組積累曲線表明梭菌屬的核心基因組隨著基因組數目的增多逐漸減小，而泛基因組呈現線性增加的趨勢，由此可以推斷梭菌具有開放型的泛基因組。這一結果與對其他梭菌屬成員的研究一致，如C.butyricum[27]和C.beijerinckii[28]等，但是值得注意的是，泛基因組積累曲線受到分析的基因組數量的限制[29]。梭菌屬微生物基因組的異質性，可能會影響互營球菌與不同梭菌的互作類型。

2.2 梭菌屬微生物基因組的KEGG功能注釋

泛基因組結果表明，7株梭菌的核心基因組由1 029個基因家族組成，占泛基因組的34%左右。特有基因由604個基因家族組成，占泛基因組的20%左右(圖2-a)。對核心基因組進行功能注釋，可以注釋到細胞過程(cellular processes)、環境信息處理(environmental information processing)、基因信息處理(genetic information processing)、代謝(metabolism)和有機體系統(organismal systems)5個大類。其中，注釋到代謝大類的基因數量最多，老窖梭菌C.901、嗜酸梭菌Claci01、拜式梭菌Clb01、廣西梭菌Clgx01、路氏梭菌Clu07、糞味梭菌Cls01和酪丁酸梭菌Clt01分別注釋到445、528、651、672、588、590、702和581個(圖2-b)。7株梭菌都含有特異基因，其中拜式梭菌Clb01的特有基因最多，含有180個，其次為嗜酸梭菌Claci01(125個)、廣西梭菌Clgx01(104個)、糞味梭菌Cls01(89個)、路氏梭菌Clu07(68個)、酪丁酸梭菌Clt01(28個)和老窖梭菌C.901(10個)。拜式梭菌Clb01中的特異基因主要集中在碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)和能量代謝(energy metabolism)方面，分別有32和23個。老窖梭菌C.901注釋到的特異基因最少，均勻分布在信號轉導(signal transduction)、脂質代謝(lipid metabolism)和輔因子與維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins)等方面。其余梭菌的特異基因則主要分布在碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)方面(圖2-c)。上述注釋結果表明，梭菌屬微生物在代謝方面可能存在一定的種間差異。

a-核心基因組與特異基因；b-核心基因組功能注釋；c-特異基因功能注釋圖2 梭菌屬細菌基因組的功能注釋Fig.2 Functional annotation of Clostridium strains’ genomes

2.3 梭菌短鏈脂肪酸代謝通路分析

前期研究表明厭氧微生物可以通過反向β-氧化途徑利用乙酸進行碳鏈延長，乳酸和乙醇是有效電子供體[30]。在濃香白酒的發酵體系中，存在糖、乙酸、乳酸和乙醇等多種底物[10]。KEGG代謝通路結果顯示，這7株從窖泥中篩選出的梭菌屬細菌都存在與葡萄糖、乙酸、乳酸和乙醇利用相關的基因，但是短鏈脂肪酸的代謝途徑存在差異(圖3)。

圖3 七株梭菌屬微生物的短鏈脂肪酸代謝通路Fig.3 Metabolic pathways of short-chain fatty acids in seven strains of the genus Clostridium

7株梭菌屬細菌的基因組中都存在較完整的丁酸和己酸產生相關的基因，但是路氏梭菌Clu07和酪丁酸梭菌Clt01中未注釋到編碼丁酰磷酸轉移酶(phosphate butyryltransferase，EC:2.3.1.19)和丁酸激酶(butyrate kinase，EC:2.7.2.7)相關的基因(buk途徑)，僅存在but途徑產生丁酸。這和CHAI等[8]通過克隆文庫對窖泥中產丁酸梭菌的研究結果一致，窖泥中梭菌屬的產丁酸途徑具有種間特異性。此外，全基因組的注釋結果顯示互營球菌N.902可以通過丙酮酸氧化途徑、Wood-Ljungdahl乙酰化途徑產乙酸、乙醇等代謝物，但不具備逆β-氧化途徑，無法進行碳鏈的進一步延伸(圖4)。

圖4 互營球菌基因組中的產乙酸代謝途徑Fig.4 Metabolic pathway of acetic acid production in the genome of N.902

這和下文中N.902純培養中主要檢測到乙酸，檢測不到2C以上的羧酸的結果一致。基因組的注釋結果中互營球菌N.902和梭菌的代謝途徑存在一定互補，N.902產生的乙酸、乙醇等是梭菌碳鏈延伸途徑中的底物。7株梭菌都具有編碼乙酰CoA(acetyl-CoA)生成丙二酰CoA(malonyl-CoA)，進一步生成丙酰CoA(propionyl-CoA)的相關基因。丙酰CoA作為重要的前體物質，可以進一步代謝生成丙酸、戊酸等奇數鏈脂肪酸。除上述途徑外，嗜酸梭菌Claci01、路氏梭菌Clu07和糞味梭菌Cls01也可以利用葡萄糖產生甘油磷酸(glycerone phosphate)，然后代謝產生丙酰CoA進入逆β-氧化途徑。綜合基因組注釋結果來看，互營球菌N.902和梭菌都可以利用葡萄糖產生短鏈脂肪酸，這可能導致共培養中互營球菌和梭菌對葡萄糖的競爭，進而影響短鏈脂肪酸的產生。

2.4 互營球菌和梭菌純培養和共培養中的生長代謝差異

窖泥中的微生物不是獨立存在的，它們之間會發生復雜的交互作用。實驗室前期在分離篩選窖泥微生物時發現互營球菌N.902具有促進梭菌屬微生物短鏈脂肪酸產生的潛力[20]。為了進一步研究互營球菌N.902和梭菌之間的交互作用，我們將互營球菌N.902與7株梭菌屬微生物進行共培養。如圖5所示，互營球菌N.902和7株梭菌共培養中的生長、葡萄糖代謝和pH的變化存在較大差異。

a-N.902和C.901共培養；b-N.902和Claci01共培養；c-N.902和Clb01共培養；d-N.902和Clgx01共培養；e-N.902和Clu07共培養；f-N.902和Cls01共培養；g-N.902和Clt01共培養圖5 互營球菌和梭菌純培養和共培養中的生長代謝差異Fig.5 Differences in growth and metabolism of N.902 and Clostridium in mono- and co-culture

互營球菌N.902和老窖梭菌C.901共培養顯著促進生長，生長延滯期縮短，OD值的最大變化速率也高于純培養，發酵結束時共培養的OD值(0.80)高于C.901(0.39)和N.902(0.39)純培養的OD值之和。共培養促進了葡萄糖的消耗，48 h利用了3.38 g/L。此外，共培養48 h后pH值為5.58，介于C.901(7.09)和N.902(4.95)之間(圖5-a)。互營球菌N.902和嗜酸梭菌Claci01共培養對生長、葡萄糖的消耗及pH的影響不大，但是共培養OD值的最大變化速率高于Claci01純培養。這可能和Claci01的生長速度快，在共培養中占據優勢地位有關(圖5-b)。互營球菌N.902和拜式梭菌Clb01共培養前期(12 h之前)對生長有一定的抑制作用，但是12 h之后隨著N.902在共培養中逐漸開始生長，共培養的OD值開始超過Clb01純培養。發酵終點時，純培養和共培養的OD值都為1.0左右，但生長的最大變化速率遠高于Clb01純培養，此外，共培養的葡萄糖消耗量也更高(圖5-c)。互營球菌N.902和廣西梭菌Clgx01共培養的延滯期比Clgx01純培養提前6 h，發酵結束時共培養(1.1)中OD值高于純培養(0.9)。此外，共培養的葡萄糖最大消耗速率和pH最大變化速率出現時間比Clgx01純培養更早(圖5-d)。

互營球菌N.902和路氏梭菌Clu07共培養顯著促進了生長，48 h時OD值為0.7左右，遠高于純培養。共培養中葡萄糖的消耗量最高，發酵至42 h左右就已耗盡。Clu07純培養中pH逐漸上升，在42 h左右達到最高點6.4左右，而N.902和共培養的pH均呈下降趨勢，這可能是由于共培養中N.902大量產酸所致(圖5-e)。互營球菌N.902和糞味梭菌Cls01共培養的生長曲線和葡萄糖消耗曲線與Cls01純培養基本一致。發酵結束時，Cls01的pH維持在5.5左右，共培養的pH低至5.2左右(圖5-f)。互營球菌N.902和酪丁酸梭菌Clt01共培養生長延滯期縮短至6 h，但是最大生長速率低于純培養。N.902，Clt01和共培養三者的pH都呈現下降趨勢，分別在發酵結束達到4.7、5.0和5.2左右(圖5-g)。綜上，N.902和不同梭菌共培養對生長產生不同的影響，這可能和多種因素有關。YAO等[31]研究表明不同葡萄糖濃度下，C.bovifaecis的代謝流會發生變化，進一步影響生長。共培養中兩株菌對葡萄糖的競爭性利用可能會改變代謝流。除此之外，微生物代謝產生的酸類也會改變環境pH造成菌株的生長壓力[32]。

2.5 互營球菌和梭菌純培養和共培養中的短鏈脂肪酸代謝差異

進一步研究了互營球菌N.902和不同梭菌互作對短鏈脂肪酸積累的影響。除嗜酸梭菌Claci01外，6株梭菌都可以產生丁酸，只有老窖梭菌C.901中檢測到己酸存在(表3)。此外，嗜酸梭菌Claci01、路氏梭菌Clu07和糞味梭菌Cls01中都檢測到奇數碳戊酸的積累，這和基因組的注釋結果一致，它們都具備利用葡萄糖代謝產生的甘油醛三磷酸途徑生成丙酰CoA的能力，丙酰CoA可以進入逆β-氧化途徑產生奇數碳脂肪酸。比較純培養和共培養中短鏈脂肪酸的代謝差異，結果表明互營球菌N.902與老窖梭菌C.901、路氏梭菌Clu07和糞味梭菌Cls01共培養能夠促進中短鏈脂肪酸的積累。互營球菌N.902與老窖梭菌C.901共培養對培養基中乙酸的利用減少，但是丁酸和己酸的積累量分別增加0.44倍和0.63倍左右；互營球菌N.902與路氏梭菌Clu07共培養后，丁酸和戊酸的產量分別增加了0.77倍和2.63倍；互營球菌N.902和糞味梭菌Cls01共培養丁酸的產量變化不大，但戊酸的積累量略有增加0.12倍。互營球菌N.902的主要代謝產物是乙酸和乙醇，前期的研究表明乙醇和乙酸可以作為逆β-氧化途徑的底物，因此共培養中的代謝物的交叉喂養可能是促進短鏈脂肪酸積累的原因之一[29]。共培養也會對短鏈脂肪酸的積累產生負作用，互營球菌N.902和嗜酸梭菌Claci01共培養中戊酸的積累量比純培養中降低0.63倍左右。互營球菌N.902和3株主要產丁酸的拜式梭菌Clb01、廣西梭菌Clgx01和酪丁酸梭菌Clt01共培養中丁酸的積累量都發生不同程度的下調。互營球菌N.902與梭菌共培養對丁酸代謝影響不一致可能與生長、碳源的利用、葡萄糖的消耗及中間代謝物等多種因素有關[33-34]。

表3 互營球菌和梭菌純培養和共培養中短鏈脂肪酸代謝差異Table 3 Difference of short-chain fatty acid metabolism between mono-and co-culture of N.902 and Clostridium

3 結論

本研究通過比較基因組和培養的方法，證明了窖泥中不同梭菌屬微生物產短鏈脂肪酸的多樣性。通過兩兩菌株共培養體系表明，窖泥中的互營球菌和不同梭菌屬微生物之間存在正、負相互作用(圖6)。N.902與老窖梭菌C.901或路氏梭菌Clu07共培養對生長和短鏈脂肪酸的代謝都表現出顯著的促進作用。N.902與Cls01共培養僅對單一短鏈脂肪酸的積累有促進作用。N.902與嗜酸梭菌Claci01、拜式梭菌Clb01、廣西梭菌Clgx01或酪丁酸梭菌Clt01共培養時對生長的影響表現出多樣化，但都對短鏈脂肪酸的積累產生抑制作用。本研究加深了對窖泥中梭菌屬功能多樣性的理解，對互營球菌和梭菌互作關系的研究拓寬了對窖泥微生物群落復雜互作網絡的認識。

圖6 互營球菌和不同梭菌的交互作用類型Fig.6 Types of interaction between N.902 and different Clostridium species