高滲適應德爾卑沙門氏菌對交叉環境脅迫抗性分析

翟立公，李港回,周紫潔,黃菊,蔡秋慧,王俊穎,楊劍婷

(安徽科技學院 食品工程學院，安徽 滁州，233100)

沙門氏菌作為一種全球重要的人獸共患病食源性致病菌，以人類和動物為宿主，引發各種疾病。最常表現為胃腸炎，易引起惡心、嘔吐、腹痛等癥狀，過量時能夠危及人們的生命安全，嚴重時可導致死亡[1]。據統計在世界范圍內，全球每年有超過1億人感染沙門氏菌。而在中國有接近70%～80%細菌性食物中毒是由沙門氏菌感染所引起的[2]。德爾卑沙門氏菌(Salmonellaentericasubsp.entericaDerby,S.Derby)是沙門氏菌中對豬具有宿主適應性的重要血清型[3]，豬肉中的沙門氏菌是導致沙門氏菌感染的第二大來源，經檢測，歐洲等26個國家豬源沙門氏菌的主要血清型主要有鼠傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌和腸炎沙門菌，而且德爾卑沙門菌的分離率也在日漸增長。近幾年，我國各地區也相繼在豬肉中檢測出德爾卑沙門氏菌[4]。沙門氏菌的爆發不僅對食品制造業造成巨大的經濟損失，對消費者的安全威脅也逐漸增加。

沙門氏菌在外界環境中會受到多種脅迫因子的交叉協同作用，造成其對環境耐受性的改變。在食品加工及貯存過程中，常常會使用高溫、有機酸、NaOH、消毒劑等殺菌措施。有研究表明，沙門氏菌在45 ℃下處理30 min(亞致死)后，菌體的耐受性出現增強的現象；當沙門氏菌在較為干燥的環境中，它的熱適應能力也會隨著增強，對紫外輻射也有著較強的耐受力[5]。沙門氏菌經過亞致死的高溫脅迫后，毒力基因發生了改變，對宿主的感染率也隨之提高。在貯藏過程中，由于多種因子的交叉脅迫作用，造成了沙門氏菌對環境耐受性的變化。另外，具有酸適應能力的沙門氏菌在受到溫度及高滲環境的脅迫后，存活率反而高于一般性的沙門氏菌，但對NaClO的應激脅迫更為敏感[6]。為控制沙門氏菌的污染傳播，本文以檢出率較高的德爾卑沙門氏菌為對象，主要研究在高滲應激與其他環境溫度(高溫、低溫、pH、NaClO、膽鹽等)交叉脅迫對其生存的影響，以期為食品工業針對高滲耐受沙門氏菌選擇合適滅菌及保藏技術提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 培養基及試劑

胰酪大豆胨液體培養基(tryptose soya broth,TSB)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(tryptose soya agar,TSA)，北京陸橋技術有限公司；NaCl、無水乙醇、NaOH、膽鹽、30%H2O2(分析純)、檸檬酸(分析純，≥99%)，上海麥克林生化科技有限公司；NaClO(分析純，有效氯≥5.5%)，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 菌株及活化保藏

德爾卑沙門氏菌(Salmonellaentericasubsp.entericaDerby)CMCC 50719標準菌株，購自中國醫學微生物菌種保藏中心。細菌在TSB中活化培養或在TSA培養基上斜面畫線培養，37 ℃下培養18 h，并在-80 ℃冰箱中保藏備用。

1.1.3 儀器與設備

LDZX-50 KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；752型紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；DHG-9030 A型電熱恒溫鼓風干燥箱、SHP-160型智能生化培養箱、ZHP-100F型恒溫培養振蕩器、DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海三發科學儀器有限公司；DHG-9030 A型高速冷凍臺式離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；BSC-1100ⅡA2-X型生物安全柜、BDF-86V50型-80超低溫冰箱，濟南鑫貝西生物技術有限公司；ME403E型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 德爾卑沙門氏菌高滲適應性誘導

高滲馴化：德爾卑沙門氏菌經TSB及固體平板活化后，挑取單菌落，接種于TSB，37 ℃、180 r/min培養18 h。再取0.1 mL菌懸液劃線接種至含質量分數4% NaCl的TSA中，37 ℃恒溫培養24 h。如此反復進行10輪馴化。將馴化后的耐滲菌株與對照菌株分別接種至TSB中，37 ℃、180 r/min培養18 h，平板菌落計數法獲得以上菌株的初始濃度。各取1 mL培養液于滅菌后的1.5 mL離心管中，120 r/min離心3 min，棄上清液，分別加入1 mL飽和NaCl溶液重懸菌體。將2管菌液常溫下處理2、4、8 h，用無菌生理鹽水梯度稀釋，取適宜稀釋度平板菌落計數。存活率計算如公式(1)所示，評價德爾卑沙門氏菌高滲適應性菌株的耐受性。

(1)

高滲適應性抗性評價實驗：將耐滲菌株與對照菌株分別接種于TSB中，37 ℃、180 r/min培養2 h后，加入不同濃度已過濾除菌的NaCl溶液，調節其濃度依次為0.1、0.5、1 mol/L NaCl的TSB。每間隔1 h進行取樣，應用紫外分光光度計OD600 nm評價菌株的生長狀況，并繪制生長曲線。

1.2.2 高滲適應德爾卑沙門氏菌環境脅迫抗性分析

將德爾卑沙門氏菌耐滲菌株與對照菌株分別經TSB中，37 ℃培養18 h，取1 mL培養液于滅菌后的離心管中，120 r/min離心3 min，棄上清液。使用移液槍加入1 mL飽和NaCl溶液重懸菌體并在常溫下處理4 h后，120 r/min離心3 min棄上清液。

參考劉佳玫等[7]的方法進行高滲適應德爾卑沙門氏菌抗脅迫能力實驗。高溫處理：用1 mL滅菌生理鹽水重懸菌體，混合均勻后制成細胞懸液，分別置于50、55、65 ℃水浴鍋中處理30 min，在60 ℃水浴鍋中處理15、30、45、60 min后，快速置于冰上短暫冷卻；低溫處理：用1 mL滅菌生理鹽水重懸菌體后，置于4 ℃冰箱冷藏；酸脅迫：用檸檬酸將無菌生理鹽水的pH調整為1.5、2.0、2.5，使用移液槍各取1 mL加入離心管中重懸菌體(處理30 min)；堿脅迫：用NaOH將無菌生理鹽水的pH調整為11、12、13，使用移液槍各取1 mL加入離心管中重懸菌體(處理15 min)；膽鹽處理：將菌體分別重懸于0.22 μm濾膜除菌的質量分數15%、20%、25%膽鹽溶液中處理30 min；紫外燈照射處理：用1 mL滅菌生理鹽水重懸菌體，混合均勻后制成細胞懸液，分別置于距離紫外燈70 cm處照射5、10、15 min；NaClO溶液處理：將菌體分別重懸于無菌水與NaClO制成的質量分數0.3%、0.5%、1% NaClO溶液中處理30 min，用過量的Na2S2O3終止反應；H2O2脅迫：將菌體分別重懸于用體積分數30%的H2O2溶液與無菌水配制成的25、75、125 mmol/L H2O2溶液中處理30 min；乙醇處理：將菌體分別重懸于無菌水與無水乙醇配制成的體積分數65%、70%的乙醇溶液中處理5 min。

以上菌體在脅迫環境下處理一定時間后，120 r/min離心3 min，棄上清液。沉淀用1 mL生理鹽水重懸，振蕩混勻后梯度稀釋，取適宜稀釋度細胞懸液涂布TSA平板計數。根據脅迫前后的菌體數計算存活率大小。

1.2.3 數據分析

每個實驗重復3次，實驗數據利用SAS(V8)軟件進行單因素方差分析，結果用Origin 8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 德爾卑沙門氏菌高滲適應性

2.1.1 高滲馴化

德爾卑沙門氏菌在含有4% NaCl 的TSA中經過10輪馴化后，在飽和NaCl脅迫培養下的存活率如圖1所示。隨著高滲處理時間的延長，德爾卑沙門氏菌的存活率逐漸降低，但耐滲菌株的存活率顯著高于對照菌株。飽和NaCl脅迫處理2 h時，耐滲菌株的存活率為105.94%，高于未處理菌落數。在脅迫處理8 h時，耐滲菌株的存活率降低至93.53%，而對照菌株的存活率僅有65.32%。此時耐滲菌株與對照菌株的存活率相差最大。以上結果表明，德爾卑沙門氏菌經質量分數4% NaCl脅迫環境馴化后，具有高滲耐受性，對于高滲環境存活率顯著提高。與劉密等[8]的研究結果一致，在4% NaCl的BMM培養基中循環馴化使得沙門氏菌抗高滲脅迫的能力增強，證明馴化成功。

圖1 德爾卑沙門氏菌耐滲菌株在飽和NaCl脅迫下的存活率Fig.1 Survival rate of osmotic tolerant strains of S.Derby under saturated NaCl stress注：“*”表示不同組間在同一處理下差異顯著(P<0.05);“** ”表示差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.1.2 耐滲菌株的高滲適應

高滲適應德爾卑沙門氏菌耐滲菌株與未適應對照菌株在含有不同濃度NaCl的TSB中生長狀況如圖2所示。前5 h屬于德爾卑沙門氏菌的快速繁殖期。在0.1 mol/L與0.5 mol/L NaCl脅迫下(圖2-a、圖2-b)，耐滲菌株與對照菌株的生長趨勢與對照實驗菌株相同，隨時間的延長逐漸上升，在18 h左右達到穩定期。德爾卑沙門氏菌耐滲菌株基本未受NaCl影響，細菌數量與對照組幾乎相同。對照菌株受NaCl限制，細胞數量降低了15%。而在1 mol/L NaCl脅迫下(圖2-c)，耐滲菌株與對照菌株的生長趨勢明顯受到影響。但耐滲菌株的細菌增殖速率仍高于對照菌株。在18 h時，耐滲菌株還處于不斷繁殖的狀態，接近正常水平，而對照菌株因受到NaCl脅迫，細菌數量降低了50%。由此可見，經過馴化后的德爾卑沙門氏菌耐滲菌株能夠適應高滲環境，不影響細菌正常繁殖水平。

a-0.1 mol/L NaCl處理;b-0.5 mol/L NaCl處理;c-1 mol/L NaCl處理圖2 德爾卑沙門氏菌耐滲菌株的高滲適應性分析Fig.2 Analysis of hypertonic adaptability of S.Derby osmotic resistant strains

2.2 高滲適應性德爾卑沙門氏菌抗環境脅迫能力

2.2.1 高滲適應性德爾卑沙門氏菌高溫抗性

分別以50、55、60、65 ℃熱水浴處理高滲適應性德爾卑沙門氏與非適應性對照的菌懸液，結果如圖3所示。在50 ℃水浴條件下(圖3-a)，耐滲菌株與對照菌株都保持著非常高的存活率。50 ℃ 1 mol/L NaCl脅迫條件下，耐滲菌株的存活率為90.45%，高于對照菌株的82.71%。當溫度達到55 ℃時(圖3-b)，耐滲菌株的存活仍然高于對照菌株。但隨著NaCl濃度從0增加到1 mol/L時，耐滲菌株的存活率從92.62%降低為63.95%，減少了28.67%。而對照菌株只減少了17.09%(從68.85%降低至51.76%)。耐滲菌株存活率的減少量相對于對照菌株增加了1.68倍，存活率顯著降低。當溫度達到60 ℃時(圖3-c)，耐滲菌株的存活率開始隨著NaCl濃度的升高逐漸低于對照菌株。在0.5 mol/L NaCl脅迫下，耐滲菌株與對照菌株的存活率基本相同(56.39%、54.03%)，NaCl濃度達到1 mol/L時，耐滲菌株存活率降低為40.16%，低于對照菌株的48.04%。在65 ℃熱水浴處理下時，耐滲菌株的存活率已經明顯低于對照菌株。在1 mol/L NaCl脅迫下，耐滲菌株的存活率與對照菌株相差3.11倍(13.41%、41.73%)，此時差距最大。在溫度從50 ℃上升到65 ℃過程中，耐滲菌株在同一濃度NaCl脅迫下(0、0.1、0.5、1 mol/L)存活率分別降低了60.52%、58.14%、78.28%、77.04%，其中，當溫度從55 ℃升高到60 ℃時，耐滲菌株的存活率減少量最為明顯(23.24%、22.61%、19.57%、21.71%)且逐漸低于對照菌株。因此，針對60 ℃高溫脅迫下高滲適應性德爾卑沙門氏菌的耐受性做進一步分析。

a-50 ℃;b-55 ℃;c-60 ℃;d-65 ℃圖3 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在高溫條件下的存活率Fig.3 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under high temperature

2.2.2 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在60 ℃條件下的存活率

根據2.2.1實驗結果，選擇在60 ℃溫度下水浴加熱處理15、30、45、60 min進一步探究耐滲菌株的高溫耐受性。如圖6所示，在60 ℃、15 min時(圖4-a)，耐滲菌株的存活率仍高于對照菌株。在此條件下，耐滲菌株的存活率隨NaCl濃度的增加降低了11.52%(從76.42%降低至64.90%)。在30 min時(圖4-b)，耐滲菌株存活率逐漸低于對照菌株。

a-15 min;b-30 min;c-45 min;d-60 min圖4 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在60 ℃條件下不同處理時間的存活率Fig.4 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby at 60 ℃ for different treatment times

當水浴時間延長至45 min以上時(圖4-c、圖4-d)，耐滲菌株在高滲/高溫交叉脅迫下存活率明顯低于對照菌株。在60 ℃、60 min、1 mol/L NaCl脅迫下耐滲菌株存活率僅為36.48%，顯著低于對照菌株的45.22%。這與翟立公等[9]的研究結果存在差異。這可能與細胞膜的感知溫度系統及細胞膜的作用有關。在4組實驗中未經NaCl脅迫時耐滲菌株的存活率(76.42%、69.38%、68.02%、61.79%)都高于對照株(73.05%、54.77%、51.31%、50.9%)。高滲適應性誘導的細胞高溫抗性與rpoS基因表達量有關[10]。RpoS轉錄因子能夠通過溫度的改變控制核糖體結合部位的轉錄，同時RopS不僅是大多數致病菌穩定壓力的因子也是調控外膜蛋白表達量的重要影響因子[11]。暗示其可能參與高滲適應性誘導的沙門氏菌高溫交叉抗性。

2.2.3 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在4 ℃低溫條件的存活率

低溫保鮮是延長及儲存食品常用的保藏技術，耐滲菌株與對照菌株在4 ℃低溫冷藏條件下存活狀況良好(圖5)，2種菌株均呈現出緩慢下降的趨勢。高滲適應德爾卑沙門氏菌在7～19 d的存活率明顯高于對照菌株。在19 d內，耐滲菌株的存活率下降了17.25%，對照菌株降低了27.15%，但2種菌株的存活率整體均在70%以上，說明高滲適應性使德爾卑沙門氏菌對4 ℃低溫環境產生抗性。低溫儲藏可作為某些食品保鮮的方法。包文智等[20]研究發現，環境脅迫誘導不改變細菌在低溫條件下的存活情況，這些細菌對低溫條件的不同反應，可能與微生物種類和環境脅迫處理條件不同有關，食品加工過程中沙門氏菌常處于多種脅迫因子的共同作用，同時也代表了沙門氏菌中廣泛存在著與低溫條件的交叉抗性[12]。

圖5 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在低溫條件下的存活率Fig.5 Survival rate of hypersonic adapted S.Derby under low temperature

2.2.4 高滲適應性德爾卑沙門氏菌酸脅迫抗性

如圖6所示，2種菌株在檸檬酸脅迫下存活率都比較低且存活率差異顯著。在pH 2.5脅迫條件下，耐滲菌株的存活率最高，但僅有49.75%。當處于pH 2環境下時，耐滲菌株與對照菌株的存活率相差35.76%(46.87%、11.11%)，差異最大。在pH 1.5極酸性環境下時，對照菌株無法適應酸性環境，存活率為0，但此時耐滲菌株仍有5.46%的存活率。以上結果表明，高滲適應性誘導的德爾卑沙門氏菌對酸性環境產生交叉抗性。在食品加工階段有機酸常常被用作殺菌劑，對蔬果、肉品表面微生物具有良好的殺菌效果[13]。而高滲適應性的德爾卑沙門氏菌能夠抵抗酸性環境，無法被徹底消滅，因此在使用有機酸對腌制類食品殺菌時，應充分考慮到高滲誘導的細胞酸脅迫抗性，建立高效、徹底的殺菌條件，保證高滲適應性菌完全滅活。

圖6 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在酸脅迫下的存活率Fig.6 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under acid stress

2.2.5 高滲適應性德爾卑沙門氏菌堿脅迫抗性

如圖7所示，當德爾卑沙門氏菌在低堿性環境時，耐滲菌株與對照菌株的存活率均較高。在pH 11脅迫條件下，耐滲菌株的存活率(94.63%)僅高于對照菌株(89.97%)的4.66%，在pH 12脅迫條件下耐滲菌株(93.51%)與對照菌株(83.95%)只相差9.56%，差異都不明顯。但當pH增大到13，在強堿環境時，耐滲菌株與對照菌株存活率急劇降低。耐滲菌株存活率降低為55.33%仍高于對照菌株的21.86%。以上結果表明，德爾卑沙門氏菌高滲適應性使其對堿脅迫抗性增強。因此，在對腌制類等高鹽類食品進行殺菌時，無法使用有機酸以及強堿起到滅菌效果。

圖7 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在NaOH脅迫下的存活率Fig.7 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under NaOH stress

翟立公等[9]研究發現，高溫耐受性德爾卑沙門氏菌對于強堿的敏感性提升。而高滲適應性德爾卑沙門氏菌對于高溫抗性降低，因此，建立多種脅迫共同作用下的滅菌方式是一種新穎的選擇。

2.2.6 高滲適應性德爾卑沙門氏菌膽鹽抗性

膽鹽是肝臟分泌的膽汁的重要成分，主要參與脂類食物在小腸的分解和吸收[14]，因此在細菌通過胃部酸性屏障后，其依賴于膽鹽抗性的腸道定殖、存活能力也是研究的一大熱點。據報道沙門氏菌具有膽汁鹽環境脅迫適應性[15]，本實驗采用質量分數15%、20%、25%的膽鹽溶液模擬沙門氏菌可能面臨的宿主膽鹽環境，結果如圖8所示，不同濃度的膽鹽對于德爾卑沙門氏存活率影響較大。在15%膽鹽脅迫下，耐滲菌株的存活率為83.77%，高于對照菌株的73.63%，此時2種菌株的存活率均在70%以上，處于較高水平。當膽鹽濃度增大到20%時，耐滲菌株的存活率(43.90%)降低了39.87%，對照菌株存活率(31.37%)降低了42.26%。而在25%膽鹽溶液中，耐滲菌株的存活率僅有19.65%，但高于對照菌株的15.90%。高滲適應性明顯增強了菌株對膽鹽的耐受性，也意味著高滲適應性德爾卑沙門氏菌一旦被誤食進入人體腸道后，其致病率也顯著提高了。

圖8 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在膽鹽環境下的存活率Fig.8 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby in bile salt environment

2.2.7 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在紫外燈照射條件下的存活率

紫外燈通過利用汞燈發出的紫外線，來實現殺菌消毒功能[16]。在生化實驗室中，經常要對生物安全柜等儀器進行紫外光照射殺菌消毒，以防止雜菌污染。圖9為德爾卑沙門氏菌耐滲菌株與對照菌株在距紫外燈70 cm處照射下的存活率。可以看出，耐滲菌株的存活率明顯高于對照菌株。在照射5 min時，耐滲菌株與對照菌株的存活率均較高(64.95%、54.73%)。照射15 min時，耐滲菌株的存活率降低為46.32%。15 min照射下，耐滲菌株存活率只降低了18.63%。由此可見，在使用生物安全柜等儀器進行高滲適應性沙門氏菌生化實驗時，應使用紫外燈長時間殺菌，同時配合多種消毒劑以達到徹底殺菌的目的。

圖9 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在紫外燈照射環境下的存活率Fig.9 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under ultraviolet irradiation

2.2.8 高滲適應性德爾卑沙門氏菌對氧化類消毒劑抗性

高滲適應性德爾卑沙門氏菌在食品及加工器械消毒劑NaClO、H2O2溶液中的存活率如圖10所示。

a-NaClO溶液處理;b-H2O2溶液處理圖10 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在氧化類消毒劑脅迫下的存活率Fig.10 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under oxidative disinfectant stress

由圖10可知，2種消毒劑對德爾卑沙門氏菌的殺菌效果完全不同。明顯能夠看出德爾卑沙門氏菌對于NaClO的更為敏感。在質量分數0.3% NaClO溶液中(圖10-a)耐滲菌株的存活率為66.64%，高于對照菌株的54.55%，兩者存活率相差不大。當NaClO溶液濃度增大為0.5%時，耐滲菌株的存活率只降低為51.61%，但此時對照菌株已經被完全滅菌，在1%NaClO溶液中，耐滲菌株的存活率為49.11%，仍處于較高水平。然而與NaClO不同，在125 mmol/L高濃度H2O2溶液中，耐滲菌株的存活率雖然高達58.03%，卻低于對照菌株的69.50%。

H2O2和NaClO都是氧化類消毒劑，但高滲適應性德爾卑沙門氏菌對二者的反應不同，一方面與處理時間不同有關，也反映出它們與細胞的作用方式不同。H2O2產生活性氧作用于細胞DNA、脂質和蛋白質[17]，而NaClO強烈的殺菌效果與其破壞細胞膜滲透性、能量代謝等有關[18]。

2.2.9 高滲適應性德爾卑沙門氏菌對乙醇溶液敏感性

如圖11所示，與NaClO與H2O2作用不同，德爾卑沙門氏菌在乙醇溶液環境中，存活率都處于低水平狀態，但耐滲菌株對于乙醇的抗性明顯強于對照菌株。當暴露于65%乙醇溶液時，耐滲菌株的存活率為44.33%高于對照菌株的39.94%。當乙醇體積分數增大5%時，耐滲菌株的存活率降低了2.85%(41.48%)。雖然在65%～70 %乙醇溶液中，耐滲菌株的存活率較低但仍未達到殺菌要求。CHIANG等[19]報道的酸適應性副溶血弧菌在8%乙醇溶液中的存活率顯著提高，與本研究中高滲適應性德爾卑沙門氏菌對乙醇抗性增強結果一致。這說明乙醇、NaClO無法作為高滲適應沙門氏菌的有效消毒劑。高濃度H2O2或許能夠起到殺菌效果，但H2O2屬于易燃易爆物，不適用于廣泛的消毒手段。綜上所述，高溫與高鹽協同消除食品及加工環境沙門氏菌污染及傳播是最為有效的方式。

圖11 高滲適應性德爾卑沙門氏菌在乙醇條件下的存活率Fig.11 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under ethanol conditions

3 討論

關于腸炎和鼠傷寒沙門氏菌在環境脅迫下的抗性研究已有很多，如海德爾堡沙門氏菌能夠在酸性環境中產生適應性、鴨沙門氏菌的多重耐藥性等[7，26]。本實驗主要針對德爾卑沙門氏菌在高滲環境下的適應性以及脅迫環境下的耐受性。研究發現，在經過高滲馴化后，耐滲菌株只在膽鹽、高溫以及低pH脅迫環境下生存能力顯著降低。而乙醇、強堿、NaClO、紫外光照射等都是對沙門氏菌有效的殺菌方式，但在本實驗中，高滲適應性德爾卑沙門氏菌對以上脅迫環境的抗性明顯增強。在以上環境脅迫時耐滲菌株的存活率是膽鹽環境下的2～3倍、高溫的4～5倍、極酸環境下的9～12倍。產生這種差異性的原因或許與沙門氏菌體內的轉錄因子有關。據報道RpoS轉錄調控因子是沙門氏菌體內穩定壓力的因子，能夠調控特異性基因的表達，在細菌中發揮著至關重要的作用[20]。在高溫、高滲、膽鹽及酸適應性，rpoS基因表達量均上調[14-15]。暗示其可能同時參與高滲適應性誘導的沙門氏菌高溫、膽鹽或低pH環境的交叉抗性。

細胞滲透壓抗性與甜菜堿、脯氨酸、海藻糖等滲透壓保護劑以及與滲透壓相關的外膜蛋白誘導表達量和種類有關[19,21]。大多數食源性致病菌是通過氨基酸脫羧酶系統來維持體內pH的穩定，涉及的氨基酸主要為賴氨酸、精氨酸、谷氨酸[22]。有研究發現，在細菌的細胞壁中谷氨酰胺和賴氨酸能夠有效提高對膽鹽的抗性[23]。細菌感知溫度的方式一是通過信號運輸交換系統，二是通過RNA介導的反饋通道改變調節區域的結構[24]。沙門氏菌在適應以上4種環境脅迫的誘導基本都與基因調控蛋白質的表達量有關。RpoS蛋白是RNA聚合酶的一種σ因子，而RNA聚合酶是DNA逆轉錄合成RNA翻譯蛋白質的重要產物[25]。因此，RpoS很有可能是細菌在受到環境脅迫時起到主要調節作用的轉錄因子。關于RpoS的調控機制仍有待進一步研究，這對于控制細菌耐受性的產生，以及徹底消滅具有環境抗性的食源性致病菌起到至關重要的作用，對于生物學研究也具有重要的意義。

4 結論

本實驗主要針對德爾卑沙門氏菌單一菌種進行研究。發現德爾卑沙門氏菌在質量分數4% NaCl環境條件下馴化誘導后會產生高滲適應性，不僅能夠使其在高濃度NaCl下正常存活，還具有良好的遺傳穩定性。同時，能夠誘導低溫、NaOH、乙醇、雙氧水、NaClO、紫外燈照射脅迫環境的交叉抗性。當高鹽與這些措施協同殺菌時，會顯著降低殺菌效果，產生的交叉保護也是食品安全一大隱患。但是高滲適應性也使得德爾卑沙門氏菌對某些壓力環境的敏感性增強，如在高溫、膽鹽、極酸環境下，高滲適應性德爾卑沙門氏菌的存活率明顯受到抑制，顯著降低。研究結果表明以上措施可以與食用鹽聯合作用，采用較溫和的手段提高食品殺菌效果，保證可能產生的高滲適應性菌快速滅活。由于高滲適應性德爾卑沙門氏菌對于多種消毒滅菌手段的抗性都顯著提升，食品加工業還應加大開發新的有效殺菌措施，并通過對沙門氏菌對環境脅迫的反應機制研究，建立有效的食品安全系統，阻止疾病的傳播。