響應面法優化大腸桿菌異源合成番茄紅素

茍宗芹，音提扎爾·吐爾遜買買提，田園，戴健欣，艾連中，熊智強

(上海理工大學 健康科學與工程學院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

番茄紅素(lycopene)是一種脂溶性天然色素，具有強抗氧化和清除自由基的活性，能抗衰老、調血脂和預防各種癌癥，已被用于健康食品和功能性飲料的開發。番茄紅素屬于四萜類化合物，其生物合成通過異戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)作為前體，由香葉基香葉基二磷酸合成酶(CrtE)生成香葉基二磷酸酯，在八氫番茄紅素合成酶(CrtB)作用下合成八氫番茄紅素，然后由八氫番茄紅素去飽和酶(CrtI)作用產生番茄紅素。IPP和DMAPP來源于甲羥戊酸(mevalonate, MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(methyl-D-erythritol 4-phosphate, MEP)途徑，微生物中酵母和其他真菌通常存在MVA途徑，而大多數細菌如大腸桿菌只存在MEP途徑[1]。番茄紅素主要通過植物天然提取、化學合成和微生物合成獲取，但植物天然提取法成本高，化學合成法有化學殘留且易造成環境污染。相比而言，微生物合成具有無污染、生產周期短等優勢，是較為理想的生產方式。

利用微生物作為細胞工廠異源合成番茄紅素已成為當前研究熱點，特別是大腸桿菌作為常用萜類合成底盤細胞，具有MEP途徑為異源合成番茄紅素直接提供前體，有明顯的天然優勢和研究前景。目前微生物異源生產番茄紅素主要依賴于代謝工程改造來提高其產量。ALPER等[2]采用基因組尺度代謝流平衡分析，組合敲除谷氨酸脫氫酶(△gdhA)、丙酮酸脫氫酶(△aceE)和甲醛脫氫酶(△fDhE)，增強E.coli內源MEP途徑的前體物質DMAPP和IPP合成，使番茄紅素產量提高37%。XIE等[3]對番茄紅素合成酶(CrtYB)進行修飾，與來源于紅發夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)crtI和crtE及釀酒酵母MVA途徑中限速酶HMG1催化區tHMG1共表達，使番茄紅素單位細胞產量達到24.41 mg/g菌體干重(dry cell weight,DCW)。

培養基成分和發酵條件優化也是提高微生物異源生產番茄紅素的通用策略。KIM等[4]對產番茄紅素工程菌的培養基進行碳源優化，將葡萄糖和L-阿拉伯糖作為輔助碳源補充到以甘油為碳源的培養基中，使番茄紅素的濃度和得率顯著提高，終產量達到1.35 g/L，比優化前提高了約7倍。JIN等[5]構建異源合成番茄紅素重組菌株，以LB培養基作對照，另外選取2×YT+G培養基和SM培養基進行優化，優化后2×YT+G培養基的產量最高，相比優化前提高1.12倍。本研究基于已構建的大腸桿菌番茄紅素異源合成質粒pACLYC，首先篩選出高產番茄紅素的大腸桿菌菌株，在LB培養基基礎上，通過單因素試驗和響應面法優化大腸桿菌生產番茄紅素的培養條件，進一步提高番茄紅素合成效率，為大腸桿菌異源生產番茄紅素奠定基礎，進而促進番茄紅素相關益生制劑及功能性食品開發。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌DH5α、JM110、Top10和BL21(DE3)及pACLYC質粒，本實驗室保存。pACLYC攜帶番茄紅素合成酶基因crtE、crtB和crtI，氯霉素抗性。由大腸桿菌異源合成番茄紅素途徑可知，大腸桿菌以內源IPP和DMAPP合成FPP為前體，通過CrtE、CrtB和CrtI 3個異源酶連續催化合成番茄紅素。

1.1.2 培養基和抗生素

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母浸出粉5、NaCl 10。LB固體培養基需加入20 g/L瓊脂粉。本研究添加的抗生素為氯霉素，其工作濃度為50 μg/mL。

1.1.3 主要試劑和儀器

番茄紅素(HPLC級，≥90%，CAS#502-65-8)標準品，上海源葉生物有限公司；Trizol、氯霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；二氯甲烷、丙酮為分析純，甲醇為色譜純，國藥集團；質粒提取試劑盒，Axygen公司；Nanodrop 2000c超微量核酸蛋白定量儀，美國Thermo公司；冷凍離心機，德國Sigma公司；DU-800型分光光度計，美國Beckman公司；生化培養箱，上海博迅實業有限公司；Lightcycle96實時PCR系統，瑞士Roche公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組大腸桿菌構建

分別取1 μL pACLYC質粒轉化至100 μLE.coliDH5α、JM110、Top10和BL21(DE3)感受態細胞，冰上靜置30 min，42 ℃水浴90 s后冰上靜置5 min，加入900 μL LB液體培養基于37 ℃下200 r/min搖床復蘇1 h，取100 μL菌液涂布于含氯霉素的LB固體培養基，倒置于37 ℃恒溫箱培養16 h挑取轉化子。

1.2.2 宿主菌發酵

挑取1.2.1中平板上長出的單菌落接種于含4 mL LB培養基的試管中，37 ℃、200 r/min振蕩培養12 h，然后按2%(體積分數)接種量轉接至250 mL錐形瓶(含50 mL LB培養基)中，37 ℃、200 r/min發酵24 h后收集菌體用于番茄紅素提取和測定產量。

1.2.3 標準曲線的制備

稱取2 mg番茄紅素標準品，加入丙酮進行溶解，定容至10 mL容量瓶，配制成200 μg/mL母液。將其用丙酮稀釋成150、100、50、25、12.5 μg/mL溶液后在波長472 nm處測定吸光值。以番茄紅素質量濃度X(μg/mL)對吸光值Y進行線性回歸，回歸方程為Y=0.002 8X-0.015，R2為0.996。

1.2.4 生物量和番茄紅素檢測

將發酵液稀釋5倍后，用分光光度計測定OD600，菌體總OD600值為稀釋倍數乘以稀釋菌液的OD600讀數。取10 mL發酵液于已稱重的離心管中，離心收集菌體后置于65 ℃烘干至恒重，稱量獲得發酵液中菌體干重，建立OD600與菌體干重的線性關系。

用1 mL丙酮進行番茄紅素萃取，置于55 ℃水浴鍋中萃取15 min，其間每隔5 min渦旋振蕩20 s，然后12 000×g離心10 min取上清液用分光光度計在472 nm下檢測番茄紅素含量，代入1.2.3中的回歸方程[6]。

1.2.5 單因素實驗

基于LB培養基，分別添加葡萄糖、果糖、蔗糖和甘油等碳源(6 g/L)及不同濃度(0、2、4、6、8、10 g/L)的果糖，檸檬酸氫二銨、NH4Cl、(NH4)2SO4和尿素等無機氮源(5 g/L)及不同NH4Cl質量濃度(0、5、10、15、20 g/L)，正己烷、正庚烷、正十二烷和正十六烷等氧載體(10%，體積分數)和不同正十二烷體積分數(0%、5%、10%、15%、20%)對番茄紅素產量的影響，確定最佳條件。

1.2.6 響應面優化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面設計，對大腸桿菌異源生產番茄紅素的關鍵因素進一步優化，以獲得番茄紅素高產。

1.2.7 RNA提取和q-PCR反應

大腸桿菌工程菌培養后收集菌體，參照生工Trizol法提取RNA，Nanodrop 2000c測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整度。然后依據TaKaRa公司反轉錄試劑盒的方法制備cDNA。q-PCR通過Lightcycle96實時PCR系統進行測定。用2-ΔΔCT方法分析每個基因的數據，以clpB基因作為內參基因，基因引物由華大基因股份有限公司合成(表1)。

表1 本研究使用的引物序列Table 1 Primers used in this study

續表1

1.3 數據處理

所有實驗數據為3次重復實驗平均值，采用Origin 2019作圖，SPSS Statistics 26.0、Design-Expert 10.0.0進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 不同大腸桿菌菌株對番茄紅素生產的影響

NAM等[7]采用4種不同大腸桿菌異源合成β-胡蘿卜素，發現不同宿主生產β-胡蘿卜素具有明顯差異，不同大腸桿菌異源合成番茄紅素可能存在明顯差異。本研究采用4株大腸桿菌DH5α、JM110、Top10和BL21(DE3)作為番茄紅素異源生產宿主。結果表明Top10番茄紅素產量和得率高于其他菌株，達到124.8 mg/L和12.43 mg/g。BL21(DE3)發酵產量僅次于Top10(118.4 mg/L)，其次是DH5α和JM110，表明不同菌株異源合成番茄紅素確實存在顯著差異(圖1)。4株菌株都是常用的大腸桿菌菌株，但只有BL21(DE3)是最常用蛋白表達宿主菌，能高效表達各種異源蛋白，其余3種菌株都為常見的基因工程克隆宿主。Top10得率也顯著高于其他3株菌，可能是由于其MEP途徑合成前體IPP和DMAPP最強。

圖1 不同大腸桿菌菌株對番茄紅素生產的影響Fig.1 Effect of different E.coli strains on lycopene production注：番茄紅素得率均通過測定菌體干重(DCW)得到(下同)

李文[8]在選擇異源合成番茄紅素的大腸桿菌時，BL21(DE3)合成番茄紅素的產量也不是最高，與本研究結果相似。因此，E.coliTop10/pACLYC為生產番茄紅素的最優重組菌株用于后續研究。

2.2 單因素試驗優化大腸桿菌異源合成番茄紅素

LB培養基是大腸桿菌培養使用最普遍的培養基，它可以促使微生物以較高生長率快速生長。為進一步提高大腸桿菌異源合成番茄紅素產量，通過單因素試驗對LB培養基進行優化，分析碳源、無機氮源和氧載體對大腸桿菌異源合成番茄紅素的影響。

2.2.1 碳源對番茄紅素生產的影響

微生物生長與代謝產物積累受培養基顯著影響，在LB培養基中添加碳源能改善菌株生長和影響目標代謝物合成。本研究選取的4種常見碳源中，添加果糖的番茄紅素產量和得率最高，達到326 mg/L和15.8 mg/g，而添加蔗糖和甘油的番茄紅素產量和得率與LB培養基(空白)相比差異不大，添加蔗糖產量和得率為80.6 mg/L和7.6 mg/g，添加甘油產量和得率為83.6 mg/L和5.1 mg/g。添加葡萄糖得到的番茄紅素產量及得率最低，僅為22.5 mg/L和1.8 mg/g(圖2-a)。李文[8]也發現添加果糖后番茄紅素產量最高，與本研究結果一致，這可能與E.coliTop10/pACLYC對果糖的利用效率有關。DU等[9]比較分別添加葡萄糖和果糖的大腸桿菌工程菌轉錄情況，發現果糖吸收代謝、丙酮酸分解代謝、三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循環和氧化磷酸化相關的基因轉錄差異顯著(P<0.05)。MEP途徑需要消耗大量的NADPH和ATP，增強胞內還原力和能量供給是提高異源萜類合成的關鍵[4]。果糖添加后提高TCA循環和磷酸戊糖途徑模塊基因表達，增加NADH和NADPH供給和加強MEP途徑的前體物3-磷酸甘油醛和丙酮酸的合成代謝。TCA循環中基因轉錄水平顯著變化也暗示細胞的NADH和NADPH還原力供給增加，為菌體生長和番茄紅素合成提供豐富的輔助因子和能量[10]。

確定果糖是大腸桿菌異源合成番茄紅素最佳碳源后，進一步對果糖最適添加濃度進行優化。當果糖質量濃度為6 g/L時，番茄紅素產量和得率最高，達到445.8 mg/L和23.35 mg/g，顯著高于其他濃度組(P<0.05)；隨著果糖濃度進一步增加，番茄紅素合成趨勢顯著下降，當果糖質量濃度為10 g/L時，番茄紅素產量和得率僅為119.1 mg/L和6.04 mg/g。研究表明果糖質量濃度為6 g/L時，大腸桿菌生長達到穩定，且番茄紅素產量最高，而過高濃度果糖對番茄紅素合成不利(圖2-b)。

a-碳源種類；b-果糖圖2 不同碳源對番茄紅素生產的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on lycopene production

2.2.2 無機氮源對番茄紅素生產的影響

氮源對微生物生長同樣不可或缺，用于細胞大分子物質(如蛋白質、核酸等)和含氮代謝物的合成，充足的氮源是實現高效合成的必要條件。MUSSAGY等[11]研究添加氮源對紅酵母CCT-2186生產類胡蘿卜素的影響，發現無機氮源NH4NO3的補給能進一步促進目標代謝物胡蘿卜素合成和積累。本研究選取的4種無機氮源中，添加NH4Cl的番茄紅素產量和得率最高，達到562.4 mg/L和24.03 mg/g。添加檸檬氫二銨后番茄紅素產量和得率與空白LB培養基相比顯著下降(P<0.05)，可能是檸檬氫二銨會使發酵液的pH值顯著降低，在酸性條件下酶的催化活性顯著降低，抑制菌體生長和色素合成(圖3-a)。李一萌[12]選擇5種氮源對產番茄紅素工程菌株的培養基進行優化，發現不同氮源對菌體生長和類胡蘿卜素合成存在顯著差異(P<0.05)，與本研究類似。

隨著NH4Cl濃度增加，番茄紅素產量和單位細胞得率隨之增加，在添加質量濃度為5 g/L時，番茄紅素產量和得率最高，達到537.4 mg/L和24.4 mg/g，顯著高于其他NH4Cl添加濃度(P<0.05)，表明NH4Cl質量濃度為5 g/L時細胞活力旺盛，環境適應能力強，能夠使番茄紅素發酵體系發揮最大功效，而過高濃度NH4Cl對菌體番茄紅素合成有抑制作用，反而降低產量(圖3-b)。與只添加果糖相比，NH4Cl添加使番茄紅素產量和得率進一步增加，表明添加NH4Cl后促進大腸桿菌異源合成番茄紅素能力。

a-無機氮源種類；b-NH4Cl圖3 不同無機氮源對番茄紅素生產的影響Fig.3 Effect of different inorganic nitrogen sources on lycopene production

2.2.3 氧載體對番茄紅素生產的影響

發酵工程中添加氧載體后可以減少氣液傳遞阻力，提高氧傳質效率[13]。任東雪等[14]采用添加氧載體的策略，選擇正己烷、正庚烷和正十二烷等氧載體，顯著提高前體L-谷氨酸轉化效率。因此本研究選用正己烷、正庚烷、正十二烷和正十六烷作為氧載體[15]，探討氧載體對番茄紅素生產影響。正十二烷發酵得到的番茄紅素產量和得率高于其他氧載體，分別為457.5 mg/L和26.18 mg/g；正己烷發酵的番茄紅素產量和得率卻顯著低于其他氧載體(P<0.05)，僅為80 mg/L和5.87 mg/g，可能是由于10%正己烷的添加抑制菌體生長，顯著影響番茄紅素前體的合成和能量供給，造成產量和得率明顯降低(圖4-a)。與對照不添加氧載體相比，選用正庚烷、正十二烷和正十六烷都能促進番茄紅素積累。ZHANG等[16]發現正十二烷是富馬酸酶表達的最適氧載體，可以增加ATP濃度，改變能量代謝途徑，為富馬酸酶蛋白折疊提供充足的能量，與本研究結果相一致，選用正十二烷能更好促進番茄紅素合成。

氧載體添加量對番茄紅素合成也有明顯差異，產量和得率隨正十二烷含量的增加先升高后降低，添加量10%時番茄紅素產量和得率達到最大值，且顯著高于其他氧載體(P<0.05)，達到512 mg/L和27.03 mg/g，說明氧載體正十二烷可提高番茄紅素產量，且相較于添加果糖和NH4Cl，番茄紅素得率最高(圖4-b)。

a-氧載體種類；b-正十二烷添加量圖4 不同氧載體對番茄紅素生產的影響Fig.4 Effect of different oxygen carriers on lycopene production

2.3 響應面法優化大腸桿菌生產番茄紅素的條件

上述單因素試驗結果發現果糖、NH4Cl和氧載體對番茄紅素產量影響較為顯著，本研究在此基礎上利用響應面法采用Box-Behnken響應面設計對其進一步優化(表2)。

利用Design Expert軟件對表2結果進行方差分析及二次多項回歸擬合，得到大腸桿菌生產番茄紅素得率對果糖、NH4Cl和正十二烷的多元回歸方程為：

Y=84.29-14.76A-2.12B+3.08C+7.84AB+0.175 9AC-7.98BC-23.66A2-8.26B2-4.19C2

表2 響應面試驗設計和結果Table 2 Box-Behnken design and results

方差分析中的顯著性檢驗可以判斷自變量對因變量的影響。果糖、NH4Cl和氧載體3個因素對響應值都有極顯著影響(P<0.01)；其中交互項果糖和NH4Cl，NH4Cl和氧載體影響極顯著(P<0.01)，果糖和NH4Cl不顯著(P>0.05)；各因素的平方項對響應值也具有極顯著影響(P<0.01)。3個因素對大腸桿菌生產番茄紅素得率的影響程度為：果糖添加量>正十二烷添加量>NH4Cl添加量。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance of response surface experiment

如圖5所示，NH4Cl和正十二烷曲面斜度較為平緩，等高線圖接近圓形，說明交互作用不顯著(P>0.05)；果糖和NH4Cl、果糖和正十二烷的曲面均較為陡斜，其等高線圖偏橢圓形，表明交互作用顯著(P<0.05)，與方差分析結果一致。響應面最高點在模型設計范圍之內，說明此響應面變量設計較好，可以用于后續分析。與傳統方法相比通過響應面法建立模型，測試不同變量之間的整體關系，在多變量系統中能快速篩選關鍵因素。郭燕等[17]同樣采用單因素試驗和Box-Behnken試驗優化發酵條件，使濃香型白酒中己酸乙酯和丁酸乙酯的含量分別增加1.68倍和1.38倍。張博等[18]采用響應面方法對腸桿菌MCYS-7生產L-半胱氨酸發酵條件進行優化，使得搖瓶發酵產量提高169%。

a-果糖與NH4Cl；b-果糖與正十二烷；c-NH4Cl與正十二烷圖5 各因素交互作用對大腸桿菌生產番茄紅素的影響Fig.5 Effect of the factors on lycopene production in E.coli

根據Design-Expert 10.0軟件分析得出最優理論條件：果糖4.22 g/L、NH4Cl 0.89 g/L、正十二烷體積分數15%，預測產量為29.25 mg/g。按此條件生產番茄紅素，實際產量達到29.3 mg/g，與預測值非常接近，說明模型能夠較好預測大腸桿菌生產番茄紅素的得率。與優化前相比，優化后的菌體和丙酮萃取液在顏色上明顯加深，表明優化后的番茄紅素產量更高(圖6)。

a-離心菌體；b-發酵萃取液圖6 優化前后的大腸桿菌菌體和萃取液Fig.6 Cells and acetone extract of E.coli before and after optimization注：左為優化前，右為響應面優化后

2.4 優化培養基對E.coli異源合成番茄紅素轉錄水平的影響

本研究通過q-PCR分析番茄紅素合成途徑和相關基因在培養基優化前后的表達水平變化，結果表明優化后IspG、IspD、IspF、idi和crtE的mRNA表達量顯著上調(圖7)。大腸桿菌自身MEP途徑代謝流量很弱，相關中間代謝物積累較少[19]，基因表達量上調可促使更多的代謝通路流向番茄紅素前體DMAPP和IPP的合成。DMAPP和IPP積累后進一步流向番茄紅素合成，與crtE、crtB和crtI基因密切相關，優化后crtE的轉錄水平顯著上調4.4倍，最終使番茄紅素合成顯著提高(P<0.05)。而部分基因(dxs和IspE)表達出現下調，可能是優化后中間代謝物積累使MEP途徑產生反饋抑制[20]。異源生物合成模塊與內源前體合成模塊之間的代謝通量平衡是提高目標代謝物產量的關鍵因素和有效方法。本試驗優化前后的關鍵基因轉錄水平差異也表明在異源合成過程中，調控前體和合成模塊中關鍵基因表達，能顯著促進目標代謝產物的合成。

圖7 優化培養基后大腸桿菌異源合成番茄紅素的基因的表達水平Fig.7 The transcription of E.coli heterologous synthesizing lycopene gene through the optimized medium

3 結論

本研究篩選出大腸桿菌Top10為最佳番茄紅素生產菌株，基于LB培養基，通過單因素試驗和響應面法分析得出，果糖、NH4Cl和正十二烷對于番茄紅素的產量影響極顯著(P<0.01)。最佳培養基配比：LB培養基中添加4.22 g/L果糖、0.89 g/L NH4Cl和15%(體積分數)正十二烷。最優條件下番茄紅素得率達到29.3 mg/g，相比優化前提高了138%。本研究顯著提高番茄紅素異源合成效率，為大腸桿菌生產番茄紅素奠定基礎。