克倫生葡萄內(nèi)生菌Acremonium sclerotigenum的分離鑒定及致腐能力研究

李培謙，藥震，馮寶珍，師守國

(運城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運城，044000)

克倫生(Crison)是常見的鮮食無核葡萄品種，因其品質(zhì)好，抗病性強，儲藏期長等優(yōu)點倍受農(nóng)戶青睞，然而在采后儲藏過程中仍有腐爛病發(fā)生。植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)廣泛存在，具有豐富的多樣性[1-2]，它們與植物長期共存，在植物生命過程中發(fā)揮著多種功能[3]。內(nèi)生菌能夠誘導(dǎo)寄主植物的抗性產(chǎn)生，目前人們已經(jīng)證實菌根菌[4]、植物內(nèi)生細(xì)菌[5]及線蟲[6]通過激發(fā)寄主系統(tǒng)獲得性抗性以增強對病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)。比如Colletotrichumtropicale能誘導(dǎo)可可葉片內(nèi)幾百個防御基因表達(dá)，增強植物免疫力[7]。另一方面，內(nèi)生菌也能夠抑制寄主植物防御反應(yīng)，侵染寄主植物，同時也為其他病原菌共同侵染提供條件[8-9]。內(nèi)生菌還通過與病原菌直接相互作用的方式調(diào)節(jié)宿主植物病害的發(fā)生[3]。如內(nèi)生菌可以通過過度寄生、競爭或抗菌來拮抗病原體?？傊壳暗难芯勘砻鲀?nèi)生菌能夠通過拮抗作用減弱植物病害發(fā)生，也能通過協(xié)助作用加重病害發(fā)生[3]。

葡萄內(nèi)生菌包括真菌、細(xì)菌、放線菌，主要分布在根、莖、葉和藤條內(nèi)，而果實內(nèi)生菌報道很少。在樹干、藤條、根部、葉片主要分離到細(xì)菌和放線菌[10]。葡萄內(nèi)生菌以芽胞桿菌(Bacillusspp.)、假單胞菌(Pseudomonasspp.)、彎曲桿菌(Curtobacteriumspp.)、葡萄球菌(Staphylococcusspp.)和鏈霉菌(Streptomycesspp.)居多[10-11]。PANCHER等[12]對意大利北部112個葡萄園的葡萄莖稈內(nèi)生真菌群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鏈格孢(Alternariasp.)和黑附球菌(Epicoccumnigrum)分布最廣。國內(nèi)學(xué)者從赤霞珠分離到73個菌株，包括23個細(xì)菌，14個放線菌，36個真菌，其中從根部分離的內(nèi)生菌最多，占比34%，而從果實分離的內(nèi)生菌最少，占比12%[13]。GUARNACCIA等[14]對歐洲和以色列葡萄植株內(nèi)生菌進(jìn)行調(diào)查，分離鑒定了間作殼屬(Diaporthe)的175個菌株，絕大多數(shù)為D.eres和D.ampelina，并且D.baccae,D.celeris,D.hispaniae和D.hungariae菌株對葡萄均具有強致病性。然而，鮮食葡萄儲藏期內(nèi)生菌的種類及致病性罕見報道。

本研究對儲藏期鮮食克倫生葡萄內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定，并測定其致腐能力，為葡萄采后病害防控提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基及樣品

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。克倫生葡萄果實于2020年10～12月取自運城夏縣葡萄冷庫。

1.1.2 試劑及設(shè)備

2×TaqPCR MasterMix II PCR擴增試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker DL2000，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒，艾德萊生物科技公司；引物ITS1/ITS4、NL1/NL4，生工生物工程(上海)股份有限公司；葡萄糖、NaCl、瓊脂粉等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

BMJ-250型培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Olympus CX43顯微鏡，日本奧林巴斯公司；T100TMThermal Cycler PCR儀，美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄內(nèi)生菌的分離鑒定

1.2.1.1 內(nèi)生菌的分離純化

選取健康的克倫生葡萄果實15 g，先在自來水下沖洗晾干，再用75%酒精充分浸泡5 min，無菌水沖洗3～5次，然后用5.4% 的NaClO溶液浸泡5 min，無菌水沖洗4～5次，最后于無菌吸水紙上晾干。置于無菌研缽內(nèi)加10 mL無菌水研碎，取組織液100 μL均勻涂布在PDA平板上。將平板置于25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)20 d，每天觀察菌落的生長情況，根據(jù)菌落的顏色以及形態(tài)挑取單菌落，將菌株(K1～K13)進(jìn)行純化后保存，以供后續(xù)實驗。

消毒可靠性檢驗采用漂洗液培養(yǎng)法和組織印記檢查法。漂洗液培養(yǎng)：取最后一次漂洗液100 μL均勻涂在PDA平板上，按上述條件進(jìn)行培養(yǎng)。組織印跡檢查：葡萄晾干后，用無菌的鑷子夾住葡萄，在PDA平板上滾動印記，置于相同條件下培養(yǎng)。在無菌操作和實驗材料的嚴(yán)格消毒滅菌下，組織印記與漂洗液培養(yǎng)的培養(yǎng)基上無任何微生物生長。

1.2.1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

內(nèi)生菌株純化后，觀察其菌落特點，用顯微鏡觀察菌絲及孢子形態(tài)并拍照。

1.2.1.3 基因組DNA提取及分子生物學(xué)鑒定

將菌株在PDA平板上培養(yǎng)10 d，用直徑7 mm的打孔器打取菌餅，置于150 mL液體PDA中，搖瓶培養(yǎng)5 d，收集菌絲。液氮研磨后，采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。采用真菌通用引物進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系為：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各1 μL，ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(internal transcribed spacer)序列擴增引物為ITS1和ITS4[15];核糖體28S rDNA D1/D2區(qū)序列引物為NL1(TGCGTTGATTACGTCCCTGC)和NL4(GGTCCGTGTT-TCAAGACGG)[16]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步檢測后，送到楊凌天潤奧科生物科技有限公司進(jìn)行測序，并上傳至美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GenBank。

1.2.1.4 進(jìn)化樹構(gòu)建

測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行在線BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比對分析，并下載模式菌株序列用CLUTALX 1.83軟件進(jìn)行多重序列比對。使用MEGA-X 軟件以鄰接法(neighbor-joining methods，NJ)對ITS、28 S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，分析該菌與其他菌株的親緣關(guān)系，以確定其分類地位[17-18]。

1.2.2 葡萄儲藏期病原菌分離鑒定

將明顯病變的克倫生葡萄果實用75%酒精處理1 min，然后用無菌水沖洗4～5次；用鑷子取病健交界處置于PDA平板上，于25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)2～3 d；待出現(xiàn)菌落后，再次轉(zhuǎn)接PDA平板，然后將菌株保存。結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS序列進(jìn)行鑒定，具體方法同上。

1.2.3 致腐能力測定

選取健康青提葡萄維多利亞、櫻桃番茄千禧、蘋果藤木一號果實，先用無菌水沖洗干凈，再經(jīng)75%酒精消毒，無菌水沖洗后晾干備用。用消毒打孔器在果實赤道處制造輕微傷口，深度約2 mm；用直徑7 mm的打孔器取得菌餅，菌絲面貼于傷口。每個菌株處理6個果實，內(nèi)生菌和致病菌均進(jìn)行致病性測定。于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，接種1 d后開始觀察發(fā)病癥狀，記錄癥狀。實驗重復(fù)3次，對照組用無菌水處理。

1.2.4 對峙培養(yǎng)

將純化的內(nèi)生菌、腐爛病原菌在PDA平板上于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，用直徑7 mm打孔器分別在菌落邊緣打孔，然后將菌餅同時接種于新的PDA平板(間距2 cm)，置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，檢測內(nèi)生菌對病原菌是否具有拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄內(nèi)生菌的分離純化

在健康克倫生葡萄果實內(nèi)共分離到20個真菌菌株，其中K1～K13菌落培養(yǎng)性狀基本一致，菌株在25 ℃ PDA平板上生長緩慢，大約30 d能長滿平板。在PDA培養(yǎng)基上菌落呈白色絨狀，菌落表面平展，菌絲分生孢子單胞，透明，圓柱狀，直或彎，表面光滑，尺寸為(3.0～5.0) μm×(0.7～1.8) μm。其形態(tài)特征與菌核枝頂孢(Acremoniumsclerotigenum)形態(tài)特征吻合(圖1-a)。

a-PDA上菌落生長特征；b-菌絲；c-分生孢子圖1 葡萄內(nèi)生菌形態(tài)特征Fig.1 Morphology of endophytes from grape

隨機選取3個菌株K2、K7、K8提取基因組DNA，PCR擴增后測序，序列上傳GenBank(ITS序列：MW64452～MW644524，28S rDNA D1/D2區(qū)序列：MW644777～MW644779)。經(jīng)過NCBI在線BLAST分析后下載CBS模式菌株序列，利用Mega-X構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖2-a所示，ITS序列進(jìn)化樹分析顯示，K2、K7、K8與A.sclerotigenum聚為一支；圖2-b所示，28S rDNA D1/D2區(qū)序列分析顯示K2、K7、K8與A.sclerotigenum聚為一支，結(jié)合形態(tài)學(xué)特點將K2、K7、K8鑒定為菌核枝頂孢(A.sclerotigenum)。

a-基于ITS序列構(gòu)建NJ進(jìn)化樹；b-基于28 S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建NJ進(jìn)化樹圖2 基于ITS序列和28S rDNA序列構(gòu)建NJ樹Fig.2 Neighbor joining tree constructed with sequences of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) regions and 28S rRNA gene

2.2 葡萄儲藏期腐爛病菌分離鑒定

由病變克倫生果實上分離純化得到菌株LK4和LK7，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定。LK7菌落灰色至黑灰色，分生孢子梗叢生，不分枝或分支，直立，有分隔，分隔處縊縮，青灰色至灰色，頂端簇生分生孢子，頂端的產(chǎn)孢細(xì)胞膨大；分生孢子橢圓形或倒卵形至近圓形，表面光滑無凸起，無色，單胞，成堆時呈現(xiàn)淡黃色，其特征與灰葡萄孢(Botrytiscinerea)特征吻合(圖3-b和圖3-c)。LK4菌落初期正面為灰白色后漸變?yōu)榘瞪燎嗪稚槐趁姘岛稚梁诤稚＞z無色、無隔膜，分生孢子梗叢生，有分支，直立或彎曲；分生孢子深褐色，倒梨形、卵形或倒棍棒形，棕褐色，有3～8個橫隔，1～4個縱隔，分隔處略隘縮，有柱狀短喙，其形態(tài)特征符合鏈格孢(Alternariasp.)(圖3-d和圖3-e)。

將菌株LK7的ITS序列(GenBank no：MZ882168)在NCBI進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其與B.cinerea同源性達(dá)99%，下載同源序列構(gòu)建NJ進(jìn)化樹進(jìn)一步證實為B.cinerea。將菌株LK4的ITS序列(GenBank no：MZ882167)在NCBI進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)與Alternariasp.同源性達(dá)99%，構(gòu)建NJ進(jìn)化樹進(jìn)一步證明該菌株為Alternariasp.。

a-病變克倫生果實；b-灰葡萄孢LK7菌落；c-菌株LK7菌絲及分生孢子；d-鏈格孢LK4菌落；e-菌株LK4菌絲及分生孢子圖3 腐爛克倫生葡萄病原菌Fig.3 Pathogen from rot Crison fruits

2.3 致腐能力測定

將菌株K7分別接種于青提、番茄和蘋果，并以無菌水、灰葡萄孢LK7作為參照。接種7 d后，無菌水處理組果實完好無損；灰葡萄孢LK7處理組果實完全腐爛，果實發(fā)病率100%(圖4-b)；而K7處理組，葡萄果實發(fā)病緩慢，發(fā)病區(qū)域僅局限于接種部位(圖4-c)，甚至放置20 d，處理果實發(fā)病部位仍然局限于接種區(qū)域(圖4-d)。由此可見，K7對葡萄果實致腐性明顯，致腐能力弱于灰葡萄孢。

a-無菌水接種7 d；b-灰葡萄孢LK7接種7 d；c-菌株K7接種7 d；d-菌株K7接種20 d圖4 內(nèi)生菌K7對葡萄的致腐作用Fig.4 Saprogenicity of endophyte K7 on grape

圖5顯示，內(nèi)生菌K7對番茄具有明顯致腐性，但致腐能力弱于灰葡萄孢。K7也能夠引起蘋果腐爛，致腐能力弱于灰葡萄孢(圖6)。

a-灰葡萄孢LK7接種7 d；b-菌株K7接種7 d；c-無菌水處理圖5 內(nèi)生菌K7對番茄的致腐作用Fig.5 Saprogenicity of endophyte K7 on tomato

a-灰葡萄孢LK7接種7 d；b-菌株K7接種7 d；c-無菌水處理圖6 內(nèi)生菌K7對蘋果致腐作用Fig.6 Saprogenicity of endophyte K7 on apple

2.4 內(nèi)生菌與致病菌關(guān)系

為探討內(nèi)生菌與病原菌的相互作用，將內(nèi)生菌K7與病原菌LK4、LK7對峙培養(yǎng)。如圖7所示，內(nèi)生菌K7生長緩慢，而病原菌LK4、LK7在PDA上生長迅速，占領(lǐng)了絕大部分的營養(yǎng)和空間，因此內(nèi)生菌K7與病原菌LK4、LK7之間無拮抗作用，它們均能引起果實腐爛。

a-K7與灰葡萄孢LK4；b-K7與鏈格孢LK7圖7 內(nèi)生菌與病原菌對峙培養(yǎng)Fig.7 Endophytes and pathogens confrontation culture

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定了克倫生葡萄果實內(nèi)生菌A.sclerotigenum，證明了該菌能夠引起葡萄、番茄和蘋果腐爛；明確了儲藏期克倫生葡萄致腐菌主要為灰葡萄孢(B.cinerea)和鏈格孢(Alternariasp.)。本研究首次報道了克倫生葡萄內(nèi)生菌A.sclerotigenum，豐富了葡萄內(nèi)生菌多樣性，也為克倫生采后病害防治提供了重要理論依據(jù)。

Acremonium屬種類繁多，大約有150個種，該屬真菌大多在土壤中腐生或者寄生在植物、昆蟲等生物體內(nèi)，有些種類還能引起人類和哺乳動物疾病[19]。Acremonium屬鑒定除了需要形態(tài)學(xué)特征，還需要結(jié)合ITS序列和28S序列等基因進(jìn)行鑒定。PARK等[20]從土壤中分離到該屬真菌，利用形態(tài)學(xué)及ITS序列分析鑒定為A.sclerotigenum。GIRALDO等[21]從西班牙土壤內(nèi)分離到Acremonium屬真菌，利用形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合ITS和28S序列進(jìn)行鑒定，鑒定了該屬2個新種。BURRUANO等[22]從葡萄根、葉、芽、種子內(nèi)分離到94株Acremonium屬內(nèi)生菌；LO+PICCOLO等[16]利用ITS和28S rDNA將這94個菌株進(jìn)行鑒定，其中有68個為A.persicinum和26個為A.sclerotigenum[16]。本研究首次從克倫生葡萄果實中分離到了13株A.sclerotigenum菌株，其形態(tài)特征與前人[16,20-21]研究基本一致。

儲藏期葡萄腐爛由黑曲霉、黑根霉、灰葡萄孢、白腐病菌、炭疽病菌、青霉菌、交鏈孢霉等病菌侵染引起，并且灰霉和交鏈孢霉在低溫條件下具有較強的致病性，是低溫貯運中的主要致腐菌[23]。本研究中，在儲藏期克倫生葡萄果實上分離到的致腐爛菌主要為灰葡萄孢和鏈格孢，說明克倫生葡萄儲藏期應(yīng)該加強對這2種病原菌的防治。此外，筆者也發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌K7能夠引起果實腐爛，說明內(nèi)生菌引起的植物病害值得深入研究。

目前植物內(nèi)生菌焦點在于拮抗菌的報道，而內(nèi)生菌A.sclerotigenumK1菌株對克倫生葡萄儲藏期致病菌B.cinerea和Alternariasp.均無抑制作用。HUANG等[24]分析了葫蘆科植物的1044株內(nèi)生菌，發(fā)現(xiàn)有84株對葫蘆科主要致病菌無拮抗活性。體外對峙培養(yǎng)內(nèi)生菌的拮抗作用表現(xiàn)為營養(yǎng)競爭、抗生物質(zhì)及重寄生。在PDA平板上A.sclerotigenumK7菌株生長速率遠(yuǎn)小于病原菌，對病原菌無抑制作用。Acremonium屬真菌大多為土壤和植物腐生菌，有些種能夠引起人類、動物疾病和植物病害[25]。前人對94株Acremonium屬葡萄內(nèi)生真菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有的A.persicinum菌株對葡萄霜霉菌(Plasmoparaviticola)游動孢子萌發(fā)具有不同程度的抑菌作用，而部分A.sclerotigenum菌株卻對葡萄霜霉病菌無任何抑制作用[16]。A.sclerotigenum可能參與寄主生長過程，提高寄主對環(huán)境脅迫的抗性，這些需要進(jìn)一步的試驗驗證。本文首次報道了儲藏期克倫生葡萄內(nèi)生菌A.sclerotigenum，明確了腐爛病菌的主要種類，為葡萄采后病害防治提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。