明日葉可培養內生真菌分離鑒定及功能性篩選

劉雯雯，馮瑞章，魏琴，周萬海*，王虹，杜永華

1(宜賓學院 四川省油樟工程技術研究中心，四川 宜賓，644007)2(宜賓學院 農林與食品工程學部，四川 宜賓，644007)

內生真菌是一類定殖于植物組織細胞間隙且對宿主無不利影響的一類微生物，特別是一些富含次生代謝物質的植物組織[1]。研究表明，一些內生真菌能產生種類多樣、活性強且結構新穎的活性功能物質[2]，作用于植物生長、品質形成和環境適應等方面[3]，甚至直接或間接的參與植物的次生代謝，影響次生代謝產物的合成和積累[4]。植物內生真菌是挖掘新型活性成分以及化合物的重要潛在資源，篩選功能性內生真菌、研究作用品質影響、與宿主的互作關系等是當前植物學、藥學的熱點研究領域[5-6]。

明日葉(Angelicakeiskei)為傘形科當歸屬藥食兼用型的稀有植物，因具有強盛生命力，“今天摘葉明天長新芽”而得名[7]，其莖葉富含黃酮、泛酸、維生素B12、膽堿等物質，特別是以查爾酮為代表的黃酮類活性物質含量較高，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、改善炎癥等作用[8-9]，在保健品、飲料、日化品中應用較多。根據共生理論[10]，明日葉不同器官內生真菌的種類和功能可能較為豐富，目前還未見關于明日葉內生真菌相關報道，基于此，本研究以明日葉為材料，研究不同器官中可培養內生真菌的多樣性和分布情況，篩選具有產黃酮和抑菌功能的菌株，為明日葉各器官內生真菌多樣性及提供可應用的功能菌株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

明日葉采自宜賓學院農場基地，采用隨機取樣法收集健康新鮮的莖、葉、花、果實于無菌取樣袋中，24 h內分離各組織的內生真菌。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)、馬鈴薯葡萄糖液體培養基(potato dextrose broth，PDB)，國藥集團化學試劑北京有限公司；鎂粉、HCl、NaOH、FeCl3、乙醇、Al(NO3)3、NaClO，均為分析純，成都市科隆化學品有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司。

AR2130電子分析天平，德國賽多利斯集團；LDZX-75KBS高溫蒸汽滅菌鍋，中國上海申安醫療器械廠；JJ060387超凈工作臺，中國吳江市凈化設備總廠；Pico-21臺式離心機，Thermo Fisher；DHG-9620A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；DHP-9082生化培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；HH-S數控恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫療儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 明日葉內生真菌的分離

采用經典三步消毒法(乙醇-NaClO-乙醇)對明日葉各器官消毒，即分別用體積分數75%乙醇消毒40 s和30 g/L NaClO消毒3 min，期間無菌水沖洗多次。空白對照：最后一次沖洗的無菌水涂布在分離培養基上，28 ℃培養并觀察，未見任何菌長出則說明表面消毒徹底。將消毒后組織放在無菌濾紙上，吸干水分，利用解剖刀切取植物組織，葉片和花切成0.5 cm×0.5 cm小片，莖和果實切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm小塊，接種到PDA平板上，28 ℃恒溫培養。待菌落長出后，挑取不同形態菌落的菌絲接種到新的平板上。經多次純化，得到明日葉內生真菌[11]。

1.2.2 內生真菌屬種分子鑒定

參考耿直等[12]的方法并加以改進，利用無菌接種環挑取真菌純培養物少許，混懸于PCR裂解液中，80 ℃裂解15 min，裂解產物作為PCR擴增模板。采用通用引物ITS1和ITS4進行擴增，最后擴增目標產物用1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格后送上海生工測定序列。利用NCBI網站BLAST程序在線進行序列的同源性比對。

1.2.3 內生真菌功能菌株篩選

產黃酮功能篩選參考楊夢莉等[13]的方法，選擇NaOH溶液、FeCl3乙醇溶液、濃鹽酸-鎂粉溶液初步篩選產黃酮菌株，利用硝酸鋁顯色法測定菌株黃酮含量。抑菌功能初步篩選采用平板對峙培養法，將分離純化的明日葉菌株分別接種于PDA平板中心位置，再以內生真菌為中心將病原菌(細菌：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌；真菌：黃曲霉、赭曲霉、禾谷鐮刀霉)接種于平板四周，以僅接病原菌的平板作為陰性對照，實驗和對照均設3次重復，27 ℃恒溫培養，觀察待測菌對病原菌的拮抗作用[14]。將初篩后菌株采用濾紙片法進行復篩，將3種真菌指示菌菌液和4種細菌指示菌菌液各0.2 mL分別均勻涂布在固體培養基上，把直徑1 cm的無菌濾紙片浸泡在明日葉內生真菌菌液中1 min，無菌鑷子取出，分別貼在涂布有不同病原指示菌的平板上，每個平板貼3張濾紙片呈等邊三角形排列，37 ℃恒溫培養，觀察內生真菌對各種病原菌的抑制作用[15]，確定菌株的抑菌性能。

1.2.4 最佳菌株發酵條件的優化

參考柏倩等[16]的方法對篩選的菌株進行發酵條件優化。以黃酮產量為標準設置單因素和正交試驗。單因素試驗：設置基本發酵條件為起始pH自然，將目的菌株接入到裝液量為60 mL/150 mL的發酵培養基中，于28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養7 d。以此為基礎，調整各因素水平，研究不同發酵時間(d)、發酵溫度(℃)、轉速(r/min)、裝液量(mL/150 mL)、起始pH對黃酮含量的影響，因素與水平見表1。正交試驗：根據單因素試驗結果，選取對試驗結果影響大的因素進行正交試驗設計。

表1單因素試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of single factor tests

2 結果與分析

2.1 明日葉內生真菌分離

明日葉的不同器官共分離可培養內生真菌34株，對其進行分子鑒定，發現25株內生真菌的ITS基因序列與數據庫中的模式菌株的相似性介于99%～100%。根據設定的ITS基因序列同源性>97%作為同一分類單元，由表2可知，34株內生真菌劃分屬于1門、4綱、8目、10科、10屬、22種，優勢綱為Dothideomycetes(64.7%)，優勢目Cladosporiales(32.4%)，優勢科Cladosporiaceae(32.4%)，優勢屬Cladosporium(32.4%)，優勢種為Alternariaalternata(11.8%)，其中，果實的12株菌鑒定為5屬8種，分別為Alternariaalternata、Alternariabrassicae、Aspergillusfumigatus、Aspergillusjaponicus、Cladosporiumcladosporioides、Cladosporiumanthropophilum、Epicoccumnigrum、Pyronemadomesticum，優勢種屬為Alternariaalternata；莖的11株菌鑒定為5屬10種，分別為Cladosporiumsp.、Cladosporiumtenuissimum、Cladosporiumperangustum、Cladosporiumanthropophilum、Cladosporiumcladosporioides、Cladosporiumcolocasiae、Epicoccumnigrum、Colletotrichumboninense、Myxosporacrassiseta、Cercosporacanescens，優勢種屬為Cladosporiumtenuissimum；葉的9株菌鑒定為5屬8種，分別為Cladosporiumtenuissimum、Colletotrichumkarsti、Fusariumgraminearum、Fusariumasiaticum、Fusariumsp.、Phyllostictacf.capitalensis、Cercosporaapii、Cercosporacanescens，優勢種屬為Colletotrichumkarsti；花的2株鑒定為1屬2種，分別為Aspergillusuvarum、Aspergillusjaponicus。果實和莖的共有屬為Epicoccum，莖和葉的共有屬為Cercospora、Colletotrichum，果實、莖和葉共有屬為Cladosporium，果實和花共有屬為Aspergillus，果實、莖、葉和花未見共有屬(圖1)。

表2 明日葉不同器官內生真菌分布及ITS序列 BLAST 比對結果Table 2 Distribution of endophytic fungi in different organs of A.keiskei and the results of ITS sequence BLAST comparison

圖1 明日葉內生真菌的Venn 圖Fig.1 The venn diagram of endophytic fungi strains in A.keiskei

2.2 明日葉可培養內生真菌系統發育分析

采用BioEdit軟件全序列比對，MEGA X軟件聚類分析，以鄰接法構建明日葉果實(圖2-a)、莖(圖2-b)和葉(圖2-c)、花(圖2-d)器官分離的可培養內生真菌的系統發育樹，其中bootstrap檢驗值≥50%，重復1 000次。以綱為類群單位，系統發育樹將果實器官中分離的5個屬分為4個不同的類群，將莖器官中分離的5個屬分為3個不同的類群，將葉器官中分離的4個屬分為2個不同的類群，將花器官中分離的1個屬分為1個不同的類群，說明明日葉不同器官分離的可培養內生真菌系統發育存在一定多樣性。

a-果實；b-莖；c-葉；d-花圖2 明日葉果實、莖、葉、花器官內生真菌群進化樹Fig.2 Endophytic fungi phylogenetic tree in organs of fruit, stem, leaf and flower in A.keiskei

2.3 明日葉內生真菌功能菌篩選分析

由表2可知，34株內生真菌中9株能產黃酮，1株分離自莖、3株分離自葉、1株分離自花、4株分離自果實，共歸類于6屬，分別是Alternaria、Aspergillus、Cladosporium、Colletotrichum、Cercospora和Epicoccum。菌株產黃酮強弱依次為MRY-1、MRY-9、MRY-34、MRY-12、MRY-32、MRY-18、MRY-30、MRY-6和MRY-4，其中MRY-1黃酮產量為1.194 mg/g。根據病原細菌抑菌性能檢測，34株可培養內生真菌中8株抑制大腸桿菌、5株抑制金黃色葡萄球菌、5株抑制志賀菌、5株抑制沙門氏菌。對至少1種病原細菌顯示抑制效果的有15株(44.1%)，其中對2種及以上病原細菌有抑制作用的菌株8株，占總菌株23.5%。根據病原真菌抑菌性能測定結果顯示，20株抑制黃曲霉、19株抑制赭曲霉、3株抑制鐮刀霉。26株內生真菌(76.5%)對至少1種真菌指示菌有抑制效果，對2種及以上病原真菌顯示抑制作用有13株，占總菌株38.2%。某些菌株抑菌效果較好，同時對病原真菌和病原細菌表現出抑菌效果的有12株(35.3%)。利用濾紙片法復篩，整體表現較強抑菌作用的菌株分別是MRY-1、MRY-13、MRY-28、MRY-34、MRY-26，包括5屬：Alternaria、Cladosporium、Myxospora、Aspergillus、Fusarium。可知MRY-1具有較好的產黃酮和抑菌能力，其形態圖見電子增強出版附件(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029994)。

2.4 發酵條件優化單因素試驗

由圖3可知，MRY-1黃酮產量在第7天時達最高，原因可能是菌株新陳代謝與黃酮類物質呈正相關，發酵時間越長，菌株繁殖越快，黃酮產量越多。但時間過長，營養物質無法滿足菌株生長代謝，黃酮變少，基于此，后期正交試驗選擇培養時間分別為5、7、9 d。當溫度低于26 ℃時，菌株生長被限制，溫度28 ℃時菌株產黃酮量最佳，溫度過高，黃酮產量緩慢下降。基于此，后期正交試驗選擇培養溫度分別為26、28、30 ℃。轉速方面，黃酮產量在120 r/min時最高，轉速的增加黃酮產量逐漸降低，基于此，選擇90、120、150 r/min較合適。裝液量在75 mL時菌株產黃酮最多，超過后總黃酮量有明顯下降趨勢。因此正交試驗選擇裝液量為45、60、75 mL(150 mL錐形瓶)較為合適。內生真菌在pH為7時黃酮產量達到最高，pH過酸和過堿都會降低菌株黃酮產量，因此確定正交試驗培養基起始pH值為7。

圖3 MRY-1菌株發酵條件的單因素試驗結果Fig.3 Single factor test results of fermentation conditions of MRY-1 strain

2.5 發酵條件優化正交試驗

在單因素試驗基礎上，設計了關于發酵時間、發酵溫度、轉速、裝料量4個因素的L9(34)正交試驗，結果見表3。可知影響菌株MRY-1黃酮產量的主次因素順序分別為發酵時間>轉速>發酵溫度>裝液量，以菌株黃酮產量為指標，得出MRY-1最優培養基條件為A2B1C2D2，即時間7 d、溫度26 ℃、轉速120 r/min、裝液量60 mL/150 mL，MRY-1黃酮質量分數為1.598 mg/g。

表3 正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests

3 結論與討論

植物內生真菌資源十分豐富，大部分植物體內含有1種或以上的內生真菌。目前菌株種類數量已超過100萬種[17]，由于其長期寄生植物，直接或間接地參與植物的次生代謝，影響次生代謝產物的合成和積累，因此內生真菌可產生與寄生植物相同或相似的物質，是探索新的且有意義的活性物質的重點方向[18]。已報道的植物內生真菌絕大多數屬于Alternaria、Fusarium、Ascomycetes、Penicillium等真菌[19]。徐全智[20]以寧夏枸杞為材料，獲得363株內生真菌分屬14個屬，其中Alternaria(46%)、Thielavia(14%)和Aspergillus(13%)為優勢屬。宋海燕等[21]從4個地區棉花樣本中分離出79個菌株16個屬，包括Alternaria、Setosphaeria、Fusarium等。本研究篩選得到的34株明日葉可培養內生真菌分屬于1門、4綱、8目、10科、10屬、22種，果實的12株優勢種屬為Alternariaalternata；莖的11株菌優勢種屬為Cladosporiumtenuissimum，葉的9株優勢種屬為Colletotrichumkarsti，花僅有屬Aspergillussp.，與絕大多數藥用被子植物內生真菌菌株多樣性結果相似[6]。

銀杏、青錢柳、燈盞花、甘草等各種植物中分離篩選產黃酮類物質的內生真菌包括Alternariasp.、Aspergillussp.、Fusariumsp.、Sirosporiumsp.、Eupenicilliumsp.等，其產黃酮能力各有差異。如楊志軍等[22]從甘草中篩選得到內生菌的代謝物總黃酮量1.13 mg/g；周寧[23]篩選到甘蔗葉2株產黃酮類化合物的內生真菌GZ-4(Aspergillusniger)和GZ-5(Aspergillusaculeatus)，總黃酮量分別為1.21和4.03 mg/g；趙曉璐等[24]從荷葉篩選的棘孢曲霉Aspergillusaculeatus總黃酮量為8.2 mg/g；何福林等[25]分離的銀杏內生真菌PhomaglomerateEnf 7黃酮產量最高達0.7 mg/g。本研究分離的9株明日葉產黃酮內生真菌產黃酮量為0.745～1.195 mg/g，其中菌株MRY-1(Alternariaalternata)優化發酵條件后黃酮產量提高至1.598 mg/g，產黃酮能力中等，后期將進一步優化黃酮類物質的提取方法，提高黃酮獲得量。

內生真菌抑菌機理主要通過分泌產生具有抑菌功能的物質，從空間和營養上抑制病原菌繁殖，或誘導植物產生抗病性能力。從植物中篩選抑菌能力的內生真菌對生物防治具有現實意義。施文廣等[26]從檀香紫檀植物根、莖、葉組織分離的337株內生真菌中，16株(35.56%)對金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌和痢疾桿菌具有抑制活性，36株(80.00%)可抑制白色念珠菌和黑曲霉，15株(33.33%)對6種測試細菌和真菌均具抑制活性。本研究同樣顯示明日葉內生真菌對病原指示真菌具有抑制作用的菌株數量多于抑制細菌指示菌，其中6株有較強的抑菌性能，包括鏈格孢屬、枝孢屬、粘孢子屬、曲霉屬、鐮刀霉屬。趙梓伊等[27]研究發現桑葚總黃酮對5種病原指示菌有不同程度的抑制作用，其中對大腸桿菌、白色假絲酵母及金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強，表明桑葚總黃酮可以作為天然活性成分用作抑菌劑。本實驗篩選的9株產黃酮菌株中7株具有抑菌能力，且6株菌株可抑制2種以上指示病原菌，說明產黃酮與抑菌作用存在正相關性，后續將提取產黃酮內生真菌的黃酮類產物，檢測提取物的抑菌能力。

內生真菌作為一種潛在的自然資源，具有廣闊的應用前景。本研究從明日葉果實、莖、葉、花分離的34株內生真菌，對其進行產黃酮和抑菌活性測定，結果表明明日葉存在較高比例的功能性菌株，為全面挖掘明日葉內生真菌代謝物研究提供了菌株資源，同時也為解決科學利用藥食兼用的明日葉活性物質資源提供了新思路，但具體的活性成分的化學結構及生理功能有待進一步探究，特別是MRY-1菌株，后續將對其深入探討。同時還可以通過培養基配方的改良、微生物誘變育種等手段，增強菌株的穩定性。