超聲波協同低鹽處理對蘿卜泡菜水菌群分布和特征風味的影響

高蘇敏，吳丹璇，高子武，劉宗振，吳鵬,2,3，姜松松,2,3，王恒鵬,2,3*，孟祥忍,2,3*

1(揚州大學 食品科學與工程學院，江蘇 揚州，225127)2(中餐非遺技藝傳承文化和旅游部重點實驗室，江蘇 揚州，225127) 3(江蘇省淮揚菜工程中心，江蘇 揚州，225127)

作為一種古老且應用廣泛的加工技術，發酵工藝在新鮮蔬菜的加工、保鮮和貯存過程中具有重要意義。發酵過程中產生的獨特風味物質，有助于蔬菜口味、香氣和質地的發展[1]。在中國，發酵泡菜歷史悠久，可以追溯到3 000年前[2]。如今，泡菜因其豐富的維生素、益生菌、礦物質和有機酸含量而受到越來越多的關注[3]。在傳統的發酵過程中，蔬菜經過預處理，浸泡在泡菜鹵水中，然后在室溫下自然發酵。泡菜鹵水通過連續繁殖的方式含有穩定的乳酸菌，以及豐富的風味和營養代謝物，可以長時間使用。然而，傳統發酵制作的泡菜通常在高鹽條件下進行，前期使用含鹽量高達15%～20%的鹽水進行腌漬，后期脫鹽工藝產生大量鹽漬廢水，易造成環境污染[4]，而長期高鹽飲食則會引起高血壓、動脈硬化等疾病，嚴重危害人體健康。HARRIS等[5]用能生產Nisin的乳酸球菌和有Nisin抗性的腸膜狀明串珠菌產酸發酵來降低腌菜的含鹽量，利用有益菌對微生物的抑制作用可減少泡菜含鹽量。曾希珂等[6]總結辣椒發酵中的有益菌，使用防腐劑、低溫管理等也可改進低鹽腌制工藝。因此，為符合當前的低鹽飲食標準，有必要改變傳統腌漬工藝，開發新型低鹽腌漬工藝，減少高鹽腌漬對人體健康的危害。

泡菜發酵體系是一個動態的微生態環境，各種微生物在發酵過程中不斷變化。CAO等[7]認為發酵由乳酸菌輔助，而變質更可能與真菌相關。當產生乳酸菌時，發酵過程開始，蔬菜原料中植物糖轉化為乳酸或醋酸。此過程會導致酸度達到一個較高水平，并維持數天時間。在這一時期，微生物群落不斷生產、降解，并轉化為有機酸、游離氨基酸和揮發性風味化合物等滋味和氣味成分。當泡菜出現酸度下降，風味劣變等現象時，表明泡菜已變質。此外，發酵過程中泡菜體系中亞硝酸鹽的形成和積累，會在一定程度上導致食品安全問題。

研究表明，泡菜的微生物群落和風味品質取決于多種因素，尤其是原材料[8]。蘿卜是最為常見的用于泡菜制作的蔬菜原料，屬十字花科，可食性強，也是我國四川盆地種植的主要作物之一，用于發酵已有1 500多年的歷史。蘿卜泡菜是一類廣受國內外消費者歡迎的發酵產品，其色澤光亮，質地脆嫩，且具備較高的營養價值。

超聲波浸漬技術是一種新型食品加工技術，能快速提高產品的浸漬速率。超聲輔助微生物發酵，可以有效提高發酵效率，促進細胞的生長與代謝[9]；適當的超聲波處理可顯著加速和改善液態發酵食品風味物質的形成[10]。目前該技術較多應用于肉類腌制過程中，在發酵類蔬菜產品中的應用較少。因此，為改善傳統泡菜含鹽量過高、發酵周期長的問題，本實驗選擇白蘿卜作為制作泡菜的主要原料，將超聲波浸漬技術與低鹽腌制相結合，分析不同鹽含量的泡菜水在超聲波輔助浸漬和傳統浸漬條件下理化性質、揮發性風味化合物和微生物多樣性，探究新型低鹽加工技術對傳統四川泡菜品質的影響，明確制作高品質、低風險泡菜的新型工藝條件，對提升泡菜產品的加工品質具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白蘿卜、新鮮小米椒、大蒜頭、青蒜、生姜、白酒、小米泡椒等，揚州大潤發超市，品質為優級。

NaOH、鄰苯二甲酸氫鉀、鉻酸鉀、硝酸銀、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、NaCl、NaNO2、三氯乙酸、色氨酸等，國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設備

Ag 1100型安捷倫液相色譜儀，美國安捷倫公司；H2050R型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；721N型可見光分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；Trace ISQ氣相色譜質譜聯用儀，天津三方環科檢測科技有限公司；Waters 2695型高效液相色譜儀，譜質分析檢測技術(上海)有限公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一儀器廠；Supelco 75 μm固相微萃取頭，上海楚定分析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

配方(以40 g/L鹽為例)：白蘿卜450 g，泡菜鹽32 g，冰糖16 g，水800 mL，青花椒2 g，紅花椒2 g，生姜32 g，大蒜32 g，新鮮小米椒3個，小米泡椒3個，青蒜1根，白酒15 mL。其中冰糖和泡菜鹽的質量比控制在1∶2(g∶g)，其余保持不變。

工藝流程：

分組：CK4、CK6為傳統浸漬組，鹽質量濃度分別為40和60 g/L；U2、U3、U4為超聲波輔助浸漬組，鹽質量濃度分別為20、30和40 g/L。

取樣：發酵過程中，每隔2 d取泡菜水樣品1次，冷凍離心(4 ℃, 12 000 r/min, 10 min)后，取上清液分別存放于-80 ℃條件，分析時取樣測定。

1.3.2 酸度的測定

參照GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》，采用酸堿滴定法進行泡菜水酸度的測定。

1.3.3 亞硝酸鹽含量的測定

參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中的亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》，采用鹽酸萘乙二胺法進行泡菜水中亞硝酸鹽含量的測定。

1.3.4 有機酸的測定

參照GB 5009.157—2016《食品安全國家標準 食品中有機酸的測定》，采用Waters 2695 高效液相色譜儀，配備Diamonsil C184.6 mm×250 mm色譜柱，流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測：UV210 nm；進樣量：5 μL。

1.3.5 游離氨基酸的測定

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》，采用Ag1100型安捷倫液相色譜儀，配備(250 mm×4.6 mm,5 μm)ODS HYPERSIL色譜柱，OPA FMOC柱前衍生化分析，流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃，紫外檢測器：338和262 nm(Pro,Hypro)，使用外標法定量。

1.3.6 揮發性風味化合物的測定

參考RAO等[11]的方法，略作修改。將5.0 mL泡菜水樣品置于20 mL頂空瓶中，以10 μL 2-甲基-3-庚酮(200 μg/mL)為內標，在45 ℃下平衡15 min后，將萃取頭在45 ℃下頂空暴露30 min。解吸在250 ℃的非劈裂模式下，5 min內完成。色譜柱為DB-Wax，載氣為He，流速為1.0 mL/min，不分流，掃描范圍：m/z30～500，掃描方式：全掃描，離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：180 ℃；開溫程序：起始溫度50 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至210 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃保持10 min。利用NIST 2014標準質譜數據庫，根據保留時間和質譜相似性(>85%)對揮發性有機化合物進行鑒定。定量方法:根據2-甲基-3-庚酮內標峰面積，計算待測樣品中揮發性風味物質含量，計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.7 高通量測序

采用DNA試劑盒提取泡菜水中細菌和真菌基因組DNA，以338 F-806R為引物擴增細菌16S DNA V3-V4區序列，擴增片段大小500 bp，采用547 F-V4 R為引物擴增標準真核18S V4區序列，擴增片段大小420 bp，測序策略為NovaSeq-PE250。對高通量測序的原始下機數據根據序列質量進行初步篩查；對問題樣本進行重測、補測。通過質量初篩的原始序列按照index和Barcode信息，進行文庫和樣本劃分，并去除Barcode序列。按照QIIME2 dada2分析流程或Vsearch軟件的分析流程進行序列去噪或OTU聚類。對各樣本(組)在不同物種分類學水平的具體組成進行展示，了解整體概況。根據ASV/OTU在不同樣本中的分布，評估每個樣本的α-多樣性水平，并通過稀疏曲線反映測序深度是否合適。在物種分類學組成層面，通過各種非監督、監督的排序、聚類和建模手段，結合相應統計學檢驗方法，進一步衡量不同樣本(組)間的物種豐度組成差異，并嘗試尋找標志物種。

1.4 數據處理

使用Origin 2019、Excel及SPSS19.0軟件構建群落分布柱狀圖、數據分析表，對試驗數據進行整理和顯著性分析等。利用QIIME軟件計算樣品的各種多樣性指數。所有實驗重復3次，數據以平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 超聲協同低鹽處理對泡菜水酸度、亞硝酸鹽的影響

酸度是衡量泡菜是否發酵完全的重要指標之一。由圖1-a可知，隨著發酵時間的增加，不同處理組的泡菜水酸度在發酵0～6 d快速上升，6～12 d趨于穩定，這可能與發酵后期，泡菜體系酸度升高，微生物的代謝受到抑制，產酸能力下降，酸度逐漸處于平衡狀態有關[12]。

通常將酸度達0.5%(酸度5 g/kg)作為泡菜發酵成熟的判斷依據。結果表明，發酵至第6天，所有處理組泡菜均發酵成熟。其中CK4、U2、U3處理組泡菜水酸度在6～8 g/kg，口感最佳。對比傳統和超聲波輔助處理組，發現酸度與鹽含量呈負相關，初始鹽含量越高，泡菜水的酸度越低，超聲波輔助浸漬后的泡菜水酸度均顯著高于傳統處理組(P<0.05)。

由圖1-b可知，在發酵過程中，不同處理組泡菜水的亞硝酸鹽含量呈先上升后下降趨勢，與RAO等[13]的研究結果較為一致。在發酵至第2天，各處理組泡菜水的亞硝酸鹽含量均達到峰值，其中U2處理組的泡菜水中的亞硝酸鹽含量高達54.122 mg/kg，U3處理組則達到35.524 mg/kg，遠超食品安全國家限量標準，其余處理組未超標。U2、U3處理組泡菜水雖在發酵第2天達到“亞硝峰”，但發酵成熟后并不存在亞硝酸鹽風險，建議發酵4 d后食用，確保食用安全。

a-酸度；b-亞硝酸鹽圖1 不同處理組泡菜水的酸度和亞硝酸鹽含量Fig.1 Acidity and nitrite content of pickle water in different treatment groups

分析發現,初始鹽含量越低，泡菜水中的亞硝酸鹽含量則相對越高，比較同一鹽含量處理組，經超聲波輔助浸漬后的樣品中亞硝酸鹽含量比傳統處理組顯著降低(P<0.05)，表明超聲波輔助浸漬對抑制泡菜在發酵過程中亞硝酸鹽的生成具有一定作用。

2.2 超聲波協同低鹽處理對泡菜水有機酸的影響

在發酵過程中，有機酸對泡菜體系的酸味和整體風味的形成有著重要影響。由圖2可知，共檢測出乳酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、草酸、琥珀酸6種有機酸，這與陳卓等[14]的結果一致。乳酸菌是泡菜發酵的主要菌種，其代謝產物主要為乳酸和乙酸，隨著發酵時間的延長，有機酸總量增加，乳酸含量最高，其次為乙酸、檸檬酸和琥珀酸。U4處理組泡菜水有機酸含量高于CK4處理組，可見相同鹽含量下，經超聲波輔助浸漬的泡菜水有機酸含量高于傳統發酵組。超聲波輔助浸漬后，鹽含量越高，有機酸總量越低，乳酸、乙酸和檸檬酸含量也越低。結果表明，高鹽環境會抑制有機酸的產生，而超聲波輔助浸漬有利于提高泡菜水的乳酸和有機酸總量，促進泡菜發酵成熟，與酸度的結果一致。

圖2 不同處理組泡菜水6種有機酸含量Fig.2 Contents of 6 organic acids in pickle water of different treatment groups

2.3 超聲波協同低鹽處理對泡菜水游離氨基酸的影響

游離氨基酸的種類和含量對產品的滋味與風味形成具有重要影響。XIAO等[15]發現江西鹽菜、四川泡菜和東北酸菜中都富含氨基酸，包括天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸等。泡菜中的氨基酸在乳酸菌作用下可以生成苯乳酸、苯乙酸等風味物質[16]。圖3-a顯示了不同處理組泡菜水發酵第6天和第12天的游離氨基酸水平的變化，結果共檢測出20種游離氨基酸。在各處理組中，谷氨酰胺含量最多。發酵第6天時，CK4和U3處理組前5位氨基酸分別為谷氨酰胺、組氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和天冬氨酸，其余處理組在發酵第6天和第12天前5位氨基酸分別為谷氨酰胺、組氨酸、天冬酰胺、精氨酸和谷氨酸。

不同種類的氨基酸具有不同的呈味特點，根據SCHOENBERGER等[17]對呈味氨基酸的分類，可將氨基酸種類分為甜味氨基酸、鮮味氨基酸和苦味氨基酸，這些呈味氨基酸共同構成了泡菜獨特的風味，并作為前體物質參與泡菜發酵過程的各種代謝反應，影響泡菜色、香、味的形成[18]。如圖3-b所示，不同處理組樣品在發酵第6天和第12天時均檢出17種呈味游離氨基酸，其中谷氨酸和天冬氨酸含量較高，是泡菜鮮味的主要來源[19]。發酵第6天時，泡菜成熟，此時甜味氨基酸主要以絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸為主，有研究顯示谷氨酸和氯化鈉的結合會使鮮味增強，因此可推測咸味和鮮味物質共同主導了泡菜的滋味。由圖3-b可知，泡菜水中的苦味氨基酸含量較高，受閾值的影響，其對泡菜滋味的形成貢獻較小，苦味的呈味效果也會受NaCl和酸的抑制。已有研究表明，經多輪發酵的泡菜水中的苦味氨基酸含量相對較低[20]，而本結果中苦味氨基酸含量較高的原因也可能與采用新鹽水發酵有關。

a-游離氨基酸熱圖；b-鮮味、甜味和苦味氨基酸含量圖3 不同處理組泡菜水的游離氨基酸和呈味氨基酸含量Fig.3 Free amino acid and flavor amino acid content of pickle water in different treatment groups

對比不同處理組泡菜水發酵第6天和第12天的氨基酸含量，鮮味氨基酸，甜味氨基酸和苦味氨基酸大都呈上升趨勢。總的來說，隨著發酵時間的延長，各呈味氨基酸含量增多，且經過超聲波輔助浸漬的處理組氨基酸含量較傳統浸漬增加更明顯，說明超聲波輔助浸漬有助于呈味氨基酸的形成。

2.4 超聲波協同低鹽處理對泡菜水揮發性風味的影響

由電子版增強出版附表1可知，對不同處理組泡菜水發酵第6天和第12天的揮發性風味物質進行SPME-GC-MS分析，共鑒定出89種揮發性風味化合物。各處理組泡菜水共有成分為芳樟醇、(-)-4-萜品醇、香葉醇、橙花醇、香芹醇、月桂烯、γ-松油烯、二烯丙基二硫、烯丙基甲基二硫、二烯丙基硫醚、乙酸芳樟酯、乙酸香葉酯、乙酸松油脂等。

傳統發酵蘿卜泡菜水與超聲波輔助浸漬的蘿卜泡菜水在揮發性成分上存在差異。自然發酵的泡菜主體風味成分以二甲基硫化物、月桂烯、酯類等為主，蔬菜原料或香辛料自帶的氣味成分會隨著發酵時間的延長而逐漸消失[21]，在發酵過程中，醇類、烯烴類、含硫化合物類含量較高，占總量的85%以上，醇類的含量較多，但閾值較大，對主體風味的影響較小，其中含量較高的醇類物質為芳樟醇、(-)-4-萜品醇、α-松油醇等，芳樟醇是泡菜中重要的香氣活性物質，具有綠茶清香與玫瑰花香，α-松油醇具有樟腦氣味、辛辣味[22]。

酯類一般以含硫酯類為主，如三芥子酸甘油酯、3-(甲硫基)丙基異硫氰酸酯等，異硫氰酸酯具有芥末的辛辣氣味，是蘿卜泡菜的特征風味物質。另外，乙酸和酯類反應會生成乙酸酯類，如乙酸香葉酯具有玫瑰和熏衣草香氣，乙酸芳樟酯具有類似鈴蘭、薰衣草等精油的幽雅香氣等。

二甲基硫化物含量較小，閾值也較小，對主體風味的影響較大，已有研究表明，二甲基三硫香氣閾值低，香味濃郁，具有肉樣和洋蔥蔬菜味香氣[23]，由附件表1所示，二甲基三硫僅存在于經超聲輔助浸漬的蘿卜泡菜水中，且在U3處理組泡菜水的含量最高，是泡菜的重要風味物質，表明超聲波輔助浸漬有利于突出泡菜的整體風味。其他香氣物質如酸類、醚類等，由于含量過低，閾值過高，對蘿卜泡菜整體風味的形成貢獻很小。

2.5 超聲波協同低鹽處理對泡菜水微生物多樣性的影響

2.5.1 物種組成分析

分別對不同處理組泡菜水細菌在門水平、屬水平上的群落組成進行分析。由圖4-a和圖4-c可知，細菌在門水平上，樣品中檢測出前5位為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍藻菌門(Cyanobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)。真菌在門水平上，樣品中檢測出前五位為輪藻門(Streptophyta)、子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、卵菌門(Oomycetes)和綠藻門(Chlorophyta)。其中厚壁菌門、輪藻門為優勢菌門，變形菌門、子囊菌門和擔子菌門為第二優勢菌門。由圖4-b和4-d可知，在屬水平上，細菌相對豐度前3位的屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、假單胞菌屬(Pseudomonas)，真菌可檢測出真菌屬相對豐度低，前5位為耶氏酵母屬(Yarrowia)、土生假絲酵母屬(Cutaneotrichosporon)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅酵母屬(Rhodotorula)和路德酵母屬(Lodderomyces)，但在U4處理組樣品中未檢出，這可能是超聲和高鹽濃度共同作用的結果。

a-細菌在門水平上的相對豐度；b-細菌在屬水平上的相對豐度；c-真菌在門水平上的相對豐度；d-真菌在屬水平上的相對豐度圖4 不同處理組泡菜水細菌、真菌在門水平和屬水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria and fungi in pickle water of different treatment groups at phylum level and genus level

腐敗菌是能引起食品腐敗變質的各種微生物的總稱，往往引起色、香、味等感官性狀的異常，其代謝過程還會破壞食物的營養組分，產生毒性。如圖4-b所示，CK處理組中存在較多的腐敗菌屬，如假單胞菌屬、拉烏爾菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬等[24]，在發酵第6天時，CK4處理組中腐敗菌的相對豐度最高，超聲處理組中腐敗菌相對豐度明顯降低，表明采用超聲輔助浸漬處理有利于減少腐敗菌的生成，提高泡菜品質，降低食用風險，提升貯藏穩定性。

2.5.2 多樣性分析

分析不同處理組泡菜水細菌和真菌微生物多樣性，其α-多樣性指數分析如表1所示。Chao1指數可以衡量物種的豐富度，Goods-coverage指數可以衡量文庫中序列的覆蓋度，Shannon指數和Simpson指數可以衡量物種的多樣性。所有樣品的Goods-coverage指數均為0.99或1.00，說明樣品文庫中的序列覆蓋率高。隨著發酵時間的延長，Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數均減小，物種豐富度降低，多樣性降低，優勢菌群含量上升。對比細菌和真菌的α-多樣性指數，可以發現細菌的多樣性明顯比真菌多樣性豐富，這與朱琳等[25]的研究結果一致。

表1 不同處理組泡菜水細菌α-多樣性指數分析Table 1 Analysis of α-diversity index of bacteria in pickle water of different treatment groups

總體看來，在細菌和真菌α-多樣性指數分析中，發酵第6天時，傳統處理組泡菜水的物種豐富度和多樣性比超聲輔助處理組泡菜水高，且鹽質量分數越高，泡菜水的物種豐富度和多樣性降低。因此，可以推測，超聲處理會在一定程度上，減弱細菌和真菌多樣性，低鹽會增強細菌和真菌的多樣性。

2.5.3 物種差異分析

為進一步比較樣品間的物種組成差異，對平均豐度為前20位的屬進行聚類分析，如圖5所示。

圖5 不同處理組泡菜水細菌(a)、真菌(b)在屬水平上的物種聚類熱圖Fig.5 Heat maps of species composition of bacteria(a)and fungi(b) in pickle water of different treatment groups at genus level

根據圖5-a可進行如下分組：CK4_6構成集群I，U4_6構成集群α，U2_6、U2_12構成集群β，CK4_12、U3_6、U3_12構成集群χ，U4_12、CK6_6、CK6_12構成集群δ；根據圖5-b可進行如下分組：CK4_6構成集群I，U4_12構成集群α，CK4_12構成集群β，U2_12、CK6_6、U2_6構成集群χ，CK6_12、U3_12、U3_6、U4_6構成集群δ，同集群之間物種差異較小，相隔越遠物種差異越大。其中，U3_6、U3_12和U2_6、U2_12在細菌屬和真菌屬聚類中分別屬于同一集群，表明U2和U3處理組發酵第6 d成熟(酸度達0.5%)后，微生物新陳代謝產物差異不大，物種組成變化小，表明采用超聲輔助浸漬處理可有效使泡菜體系在發酵期間的品質保持穩定。

3 結論

對蘿卜泡菜進行不同處理發酵，各組亞硝酸鹽含量未見超標。相同鹽含量下，超聲波處理組發酵成熟后酸度更高、更快，達到0.05%，說明超聲波浸漬有利于加速泡菜酸化，縮短泡菜的成熟時間。超聲波輔助浸漬還能提高有機酸和游離氨基酸含量。

揮發性風味分析顯示，芳樟醇、乙酸香葉酯、二甲基硫化物等對主體風味影響較大，僅存于超聲波浸漬組中的二甲基三硫在U3組泡菜水中含量最高，說明超聲波可促進生成新的揮發性物質，有效增強泡菜的風味。

超聲波輔助浸漬可有效降低腐敗菌的種類和含量，達到滅菌保藏效果。α-多樣性分析數據顯示細菌多樣性較真菌更為豐富，且物種數量更多，其中U3組多樣性更為豐富。聚類分析結果表明U3、U4組在細菌與真菌多樣性中關系更近。

綜上，鹽的質量濃度為30 g/L并輔助超聲波浸漬的蘿卜泡菜水體系更有助于提高泡菜發酵品質，表明低鹽條件下超聲波輔助浸漬對蘿卜泡菜的發酵有較大影響，有利于突出泡菜主體特征風味，減少有害微生物的產生。該研究可為未來健康安全型“低鹽四川泡菜”產品的加工與生產奠定理論基礎。