燕麥耐消化肽納米載體的制備表征及其對咖啡酸苯乙酯的包埋作用研究

靳祖瓏，馮思怡，胡亞雯，宋洪東，管驍*，孫注，戴智華

1(上海理工大學 健康科學與工程學院/國家糧食產業(城市糧油保障)技術創新中心，上海，200093) 2(內蒙古燕谷坊生態農業科技(集團)股份有限公司， 內蒙古 呼和浩特，011700) 3(麥稻智慧糧食有限公司，上海，200241)

近年來，科學家們持續關注植物資源的開發利用，谷物和豆類中含有豐富的蛋白質，約占其質量的7%～15%，是蛋白質的良好來源。在谷類和豆類作物的深加工中，蛋白質因未被有效利用而產生極大的浪費。蛋白質基的納米載體是目前的研究熱點，高效、低毒、廉價、實用的新納米材料具有廣闊的應用前景[1]。白蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆分離蛋白已被證明是實用的蛋白納米載體。燕麥年產量高，但燕麥蛋白在納米領域的應用研究相對較少。燕麥是一年生禾本科植物，種子中蛋白質含量約為12%～20%，為蛋白質含量最高的谷類[2]，且燕麥蛋白有較高的生物活性，十分適合食品領域的應用。

蛋白質基納米載體是一種有效的運載體系，能夠提高小分子活性物質的溶解性和生物利用度，同時具有高安全性和容易制備的特點，因此在食品和醫學領域有著廣泛的應用。然而在實際應用中一部分蛋白具有很強的疏水性，難以在水中穩定分散且表面活性較低，使其應用價值大打折扣[3]。蛋白質水解是一種操作簡便且效果顯著的改良方法，能夠大大增加納米載體的水溶性[4-5]。蛋白質經過人體消化酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)水解后得到的肽具有耐消化的特點，不容易在消化道中進一步分解[6]。同時，作為壁材的肽也具有一定的生物活性，能做為營養補劑達到高效利用的效果。

咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester, CAPE)來源于蜂膠，是其中的主要活性成分之一。CAPE具有多種功能活性，抗炎、抗癌、抗氧化和抗病毒效果顯著。然而CAPE的苯環結構使其極難在水中分散，同時苯環上的酚羥基也容易氧化，這使得CAPE難以在人體中有效發揮功效。通過構建肽納米顆粒可增大CAPE在水中的溶解性，同時保護其化學結構完整[7-8]。研究肽納米顆粒的組成模式并對耐消化肽納米載體進行評估，可為深入研究和探索耐消化肽應用價值提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料試劑

燕麥米，河北省淶水縣金谷糧油食品有限公司，產地為淶水縣。

正己烷、NaOH、鹽酸、二硫蘇糖醇、尿素、正十六烷、磷鎢酸，國藥集團化學試劑有限公司；葡聚糖凝膠G-75，源葉生物科技有限公司；胃蛋白酶(P-7000)、胰酶(P-1750)、胰蛋白酶(93615)，Sigma-Aldrich公司；咖啡酸苯乙酯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 儀器設備

KjeltecTM8400型全自動凱氏定氮儀，丹麥FOSS分析儀器有限公司；NanoBrook 173Plus多角度動態光散射儀，美國Brookhaven儀器公司；VCA Optima接觸角測量儀，美國AST產品股份有限公司；JEM-2100透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；F7000熒光分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 燕麥分離蛋白提取

采用堿溶酸沉法提取燕麥分離蛋白。取脫脂燕麥粉，以料液比1∶10(g∶mL)加入去離子水，調節pH至10.0，攪拌提取1 h。以4 000 r/min轉速離心10 min，取上清液調節pH至4.5，在4 ℃下靜置30 min待蛋白析出，離心以沉淀蛋白，用去離子水分散蛋白并調節pH至中性后離心，冷凍干燥即得到燕麥分離蛋白，在-20 ℃下密封保存。

1.2.2 燕麥分離蛋白組分測定

蛋白含量測定采用凱氏定氮法，蛋白含量換算系數為5.83。油脂含量測定采用甘油三酯測試盒法。多糖含量測定采用苯酚-硫酸法。

1.2.3 蛋白水解度評估

以pH-Stat法對蛋白酶解過程進行監測并計算最終水解度[9-10]。

胃蛋白酶酶解：將200 mg燕麥分離蛋白分散于20 mL水中，用鹽酸調節pH至2.0，升溫至37 ℃，加入1 mL 5 mg/mL的胃蛋白酶鹽酸溶液(pH 2.0)，并用3 mol/L的鹽酸維持pH在2.0。分別在10、30、60、90、120 min統計鹽酸的總消耗量，計算燕麥分離蛋白在胃消化中水解度(degree of hydrolysis，DH)，如公式(1)所示：

(1)

式中：V，滴定消耗的鹽酸體積，mL；c，鹽酸的摩爾濃度，mmol/mL；m，蛋白質質量，g；htot，單位質量蛋白質中的肽鍵摩爾數，取8.33 mmol/g；αCOOH(pH)，羧基的平均解離度。

胰酶/胰蛋白酶酶解：將200 mg燕麥分離蛋白分散于20 mL水中，用NaOH溶液調節pH至7.4并升溫至37 ℃，將10 mg胰酶/胰蛋白酶分散在1 mL pH 7.4的Na2CO3緩沖液中并加入酶解體系，用0.5 mol/L的NaOH溶液維持pH在7.4。分別在10、30、60、90、120 min統計NaOH溶液的總消耗量，計算燕麥分離蛋白在腸消化中的DH，如公式(2)所示：

(2)

式中：V，滴定消耗的NaOH溶液體積，mL；c，NaOH溶液濃度，mmol/mL；αNH2(pH)，氨基的平均解離度。

1.2.4 燕麥分離蛋白體外消化

為確保燕麥蛋白被胃蛋白酶和胰蛋白酶完全水解，參考1.2.3中酶與底物比例和酶解時間，消化時間定為2 h，此時得到耐消化肽納米顆粒，不會被消化酶進一步水解。

模擬胃液(simulated gastric fluid, SGF)：將250 mg胃蛋白酶分散在100 mmol/L的PBS中，調節pH至2.0并定容至500 mL。

模擬腸液(simulated intestinal fluid, SIF)：將500 mg胰酶分散在100 mmol/L的PBS中，調節pH至7.4并定容至500 mL。

模擬體外消化：將1 g燕麥分離蛋白分散在50 mL 100 mmol/L的PBS中并調節pH至2.0，并另取50 mL SGF同時在37 ℃下溫育5 min。將SGF加入蛋白分散液，在37 ℃下水浴振蕩2 h。模擬胃消化結束后調節pH至7.4，并加入100 mL SIF，模擬腸消化2 h，并在消化結束后水浴煮沸5 min。離心除去不溶成分后，將上清液凍干得燕麥耐消化肽，于-20 ℃下密封保存。

1.2.5 燕麥肽納米顆粒尺寸測定

將燕麥肽凍干粉分散在去離子水中，配成質量濃度1 mg/mL的溶液。靜置0.5 h后，用動態光散射儀測定納米顆粒的尺寸和多分散系數。

1.2.6 燕麥肽納米顆粒形貌觀測

通過透射電子顯微鏡觀察，將燕麥肽配成質量濃度1 mg/mL的溶液，滴加10 μL納米顆粒溶液于碳支持膜上，靜置2 min后用質量分數1%的磷鎢酸溶液染色，并在室溫下自然干燥。在200 kV場加速電壓下對納米顆粒進行成像觀察。

1.2.7 內部相互作用力分析

分別將1 mg燕麥肽溶解于十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)和尿素(Urea)的單一溶液和復合溶液中(SDS+DTT,DTT+Urea，SDS+Urea和SDS+DTT+Urea)，其中SDS質量分數為0.5%、DTT濃度為30 mmol/L、Urea濃度為6 mol/L[11-12]。以去離子水為溶劑作為對照。

1.2.8 燕麥肽納米顆粒表面活性評估

通過接觸角測量儀測定水表面張力并對納米顆粒的表面活性進行評估，測定方法為懸滴法。

1.2.9 燕麥肽-CAPE納米顆粒制備及包封效果評估

制備：稱取20 mg CAPE溶于1 mL乙醇中制成母液。配制10 mL燕麥肽溶液，加入100 μL CAPE乙醇溶液后，在超聲細胞破碎儀中以240 W功率超聲波處理5 min[12-13]。在1 000×g下離心2 min并重復5次，除去未被包封的CAPE。過飽和CAPE水溶液通過離心法制備。

包封率及載藥量計算：取制備的燕麥肽-CAPE納米顆粒溶液100 μL，用乙醇定容至1 mL。以CAPE乙醇母液配制1、5、10、15、20 μg/mL的CAPE乙醇溶液制作標準曲線。使用酶標儀測定載藥納米顆粒在323 nm波長下的吸光度值，根據標準曲線計算CAPE的包封率及載藥量。同時測定并計算飽和CAPE水溶液中CAPE濃度。空載體溶液吸光度作為空白對照。包封率及載藥量的計算如公式(3)、(4)所示：

(3)

(4)

1.2.10 燕麥肽-CAPE納米顆粒胃腸消化特性

按1.2.9中的方法制備新鮮的燕麥肽-CAPE納米顆粒，以體積比1∶1分別與SGF和SIF混合，取1 mL混合液置于10 kDa的透析袋，在9 mL不含酶的SGF和SIF中連續透析2 h，每隔30 min從外側透析液中取1 mL并補充1 mL新透析液，測定釋放出的CAPE質量。整個體外模擬消化在37 ℃振蕩水浴中進行。胃腸消化各做3組平行，CAPE累計釋放率計算如公式(5)所示：

(5)

1.2.11 燕麥肽-CAPE納米顆粒穩態熒光光譜

配制多份10 mL質量濃度為2 mg/mL的燕麥肽納米顆粒溶液，將濃度10 mmol/L的CAPE乙醇母液加入肽納米顆粒溶液中，配制成CAPE濃度為0、5、10、20、40、60、80、100 mmol/L的燕麥肽-CAPE納米顆粒溶液，并用超聲法輔助包埋。設置激發波長為280 nm，激發光狹縫5 nm，發射光狹縫10 nm，掃描速度2 000 nm/min，掃描范圍為300～450 nm，對各個濃度的燕麥肽-CAPE納米顆粒溶液進行熒光光譜掃描，分別在25和37 ℃下以同樣參數掃描。

1.2.12 統計分析

每次實驗做3個平行，圖表中的數據均以平均值±標準差的形式表示。顯著性分析(P<0.05)由 SPSS 20.0軟件分析后得到，不同的字母代表差異顯著。用GraphPad Prism軟件進行擬合分析并繪制成圖。

2 結果與分析

2.1 燕麥分離蛋白組成成分分析

經測定，燕麥分離蛋白純度為(75.69±0.14)%，殘存油脂含量約為(10.57±0.00)%，多糖含量為(10.04±0.16)%。

2.2 燕麥分離蛋白水解度評估

用胃蛋白酶、胰酶和胰蛋白酶對燕麥分離蛋白進行水解并測定水解度，結果見圖1。由于pH值在1.5 h后趨于穩定，選擇2 h為體外模擬消化時間。胃蛋白酶酶解最終水解度為3.1%，胰酶為16.9%，胰蛋白酶為10.7%。由于胰脂肪酶水解油脂也會導致pH降低，這會導致蛋白在小腸的水解度計算值偏高。因此認為10.7%為燕麥分離蛋白腸消化的水解度。

圖1 燕麥分離蛋白水解曲線Fig.1 Hydrolysis curve of oat protein isolate

2.3 燕麥肽納米顆粒的尺寸分析

大豆分離蛋白、玉米醇溶蛋白和乳清蛋白已被廣泛研究證明通過酶解法制備納米載體是合理且可靠的手段。DONG等[14]使用堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白并通過超聲輔助法制備了大豆聚集肽-EGCG納米顆粒，尺寸約為87 nm。JIANG等[15]酶解α-乳清蛋白并用水解肽構建了具有pH響應性的納米載體。本研究中燕麥耐消化肽被證明具有自組裝能力，能夠形成具有一定尺寸和結構的納米顆粒。如圖2所示，動態光散射結果顯示燕麥蛋白消化后，自發形成尺寸為(51.80±1.62) nm的納米結構。CHITHRANI等[16]的研究表明，納米顆粒直徑在50 nm左右被腸細胞攝取量最高。

圖2 燕麥肽納米顆粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of oat peptide nanoparticles

圖3中透射電子顯微鏡(1 μm尺度)可以觀察到主要含有2種微粒結構。其中10～100 nm的納米顆粒數量較多，可歸類為膠束。小尺寸的納米顆粒具有極高的比表面積，易吸附于大尺寸的納米顆粒表面或者聚集成簇。同時可以觀察到另一種囊泡結構，數量較少，但形狀均勻，直徑在500 nm以上。一般認為，小尺寸的膠束能夠較順利地穿過小腸黏液屏障，而大尺寸的囊泡難以進入黏液網絡結構因而吸附在黏液表面。

圖3 燕麥肽納米顆粒的TEM照片Fig.3 TEM photographs of oat peptide nanoparticles

2.4 燕麥肽納米顆粒內部相互作用

氫鍵、疏水相互作用、靜電作用、范德華力是肽自發聚集形成納米結構的主要驅動力[17]，二硫鍵在蛋白/肽結構中也有著重要作用。如圖4所示，單獨或復合使用3種蛋白變性劑得到的結果顯示，疏水作用是燕麥肽納米顆粒形成的主要驅動力[18-20]。變性劑誘導的納米顆粒尺寸變化可分析顆粒內部相互作用(P<0.05),單獨使用SDS變性劑使得納米顆粒尺寸略微變大但并不顯著，而單獨使用尿素變性劑納米顆粒尺寸沒有變化。SDS和尿素復配使用時納米顆粒尺寸顯著變大，這是因為2種變性劑對疏水作用的破壞效果疊加，原本納米顆粒內部較為致密緊湊的結構變得松散。當SDS、DTT和尿素共同作用時，相比于SDS和尿素復配使用納米顆粒的尺寸顯著變小。這可能是因為當SDS和尿素破壞疏水作用后，二硫鍵依然存在并阻止整個納米顆粒分裂成較小的顆粒。進一步添加DTT破壞二硫鍵后，得到的納米顆粒碎片雖然和原始納米顆粒尺寸相當，但這些碎片結構更加松散。因此可以初步判斷，整個納米顆粒形成的主要驅動力為疏水相互作用，而二硫鍵對結構穩定也起一定作用。

1-水；2-十二烷基硫酸鈉；3-二硫蘇糖醇；4-尿素；5-十二烷基硫酸鈉+二硫蘇糖醇；6-二硫蘇糖醇+尿素；7-尿素+十二烷基硫酸鈉；8-十二烷基硫酸鈉+二硫蘇糖醇+尿素圖4 不同變性劑處理后燕麥肽納米顆粒尺寸Fig.4 Size of oat peptide nanoparticles treated with different denaturants

2.5 燕麥肽納米顆粒表面性質

納米顆粒的表面性質對其應用具有重要的參考價值[21]。燕麥肽溶液中一部分表面疏水的納米顆粒和一些具有疏水性的多肽在液滴中難以相對穩定地做布朗運動，這些溶質趨向于逃逸，因此會在短時間內吸附在氣-液表面。這種逃逸行為產生的力與表面張力相反，因此可以認為疏水性越強，其降低表面張力的能力越強。圖5-a表明，燕麥肽溶液隨著肽濃度的增大，其空氣-水表面張力逐漸減小，在肽質量濃度1 mg/mL時表面張力約為53 mN/m。燕麥蛋白溶液在蛋白質量濃度1 mg/mL時表面張力為41 mN/m，顯然酶解后燕麥肽納米顆粒的親水性大大增強。水解增強了肽的柔性，使納米顆粒表面的親水氨基酸增多。燕麥肽納米顆粒表面具有一定疏水性，能夠降低水的表面張力，這可能是由于納米顆粒在界面吸附時誘發表層肽的去折疊[22-24]。而圖5-b中，隨著燕麥肽濃度的逐漸增大十六烷-水界面張力逐漸減小，顯然燕麥肽納米顆粒對油脂類有一定親和性。總體來說，燕麥肽納米顆粒具有優良的表面活性，其親疏水性適中，作為天然無毒的材料有著較廣泛的使用前景。

a-燕麥蛋白、燕麥肽納米顆粒空氣-水表面張力;b-燕麥肽納米顆粒十六烷-水界面張力圖5 燕麥肽納米顆粒的界面吸附Fig.5 Interfacial adsorption of oat peptide nanoparticles

2.6 燕麥肽-CAPE納米顆粒包載力評估

CAPE中的酯鍵在一定條件下會自發水解，而酚羥基則容易誘導氧化反應。作為壁材的燕麥肽具有一定抗氧化性，能夠保護內部的CAPE。經計算得燕麥肽-CAPE納米顆粒的包封率為(71.71±3.21)%，載藥量為(3.59±0.16)%。包封后CAPE在水中分散質量濃度能達到140 μg/mL，而測定CAPE在水中的溶解度為(1.80±0.11)μg/mL，因此燕麥肽納米顆粒可以有效提升CAPE在水中的分散性。這可能與CAPE中苯環的結構有關，一般認為苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸3種芳香族氨基酸具有最強的疏水性，CAPE中的苯環和燕麥肽中的苯環能夠在相互接近時形成π-π共軛結構，增強燕麥肽-CAPE納米顆粒的結構穩定性[25]。

2.7 燕麥肽-CAPE納米顆粒耐消化性評估

消化酶水解制備的燕麥耐消化肽納米載體具有耐消化性。如圖6所示，燕麥肽-CAPE納米顆粒在模擬胃腸液中連續消化2 h，CAPE的累計釋放率較小，其中在模擬胃液中釋放23%，在模擬腸液中釋放7%。由于絕大部分可被胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的肽鍵已被水解，燕麥肽-CAPE納米顆粒在模擬消化液中受消化酶影響較小。在模擬胃液中累計釋放率比模擬腸液中的累計釋放率高，主要原因可能是pH較低引起納米顆粒內部靜電相互作用的改變，整體結構變得更疏松。通常胃排空所需時間為15 min～4 h，燕麥耐消化肽納米顆粒將消化酶對蛋白質基納米載體的結構破壞作用最小化。

圖6 燕麥肽-CAPE納米顆粒體外模擬消化Fig.6 Simulated digestion of oat peptide nanoparticles loading CAPE in vitro

2.8 燕麥肽-CAPE納米顆粒熒光光譜分析

蛋白質/多肽的內源性熒光主要來自苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸3種含有苯環的芳香族氨基酸殘基。如圖7所示，隨著猝滅劑CAPE含量的增大，燕麥肽納米顆粒的最大熒光值減小且最大吸收波長紅移，這是由于氨基酸殘基微構像發生了變化，芳香族氨基酸殘基轉向納米顆粒內部。

圖7 激發波長280 nm條件下不同濃度CAPE對燕麥肽納米顆粒熒光發射光譜的影響Fig.7 Effects of different concentrations of CAPE on fluorescence emission spectra of oat peptide nanoparticles

CAPE猝滅熒光的方式可分為靜態猝滅和動態猝滅2種，具體猝滅類型可通過Stern-Volmer方程擬合分析[8]，如圖8所示。

圖8 不同溫度下CAPE與燕麥肽納米顆粒相互作用的Stern-Volmer擬合曲線Fig.8 Stern-Volmer fitting curve of interaction between CAPE and oat peptide nanoparticles at different temperatures

由表1看出，Kq高出最大值2×1010L/(mol·s)兩個數量級，據此判讀猝滅類型為靜態猝滅，燕麥肽和CAPE形成了不發熒光的復合物。使用雙對數Stern-Volmer模型分析小分子與蛋白質的結合常數KA和結合位點數n，如表2所示，經計算n值均接近1，這表明CAPE分子與肽有一個結合位點。表3結果顯示，ΔS和ΔH均大于0，表明疏水作用是分子結合的主要驅動力，并且ΔG的值越大，相互作用越強[26]。

表1 不同溫度條件下CAPE與燕麥肽結合的Stern-Volmer的KSV和KqTable 1 Stern-Volmer constant KSVand biomolecular quenching constant Kqfor the interaction between CAPE and oat peptide nanoparticles at different temperatures

表2 不同溫度下CAPE與燕麥肽結合的KA和nTable 2 Binding constant KA and numbers of binding sites n for interaction between CAPE and oat peptides at different temperatures

表3 不同溫度下CAPE與燕麥肽結合的熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters of interaction between CAPE and oat peptides at different temperatures

3 結論

本研究以燕麥蛋白為研究對象，通過酶水解法改性燕麥蛋白增強水溶性，透射電子顯微鏡照片和動態光散射結果表明制備的燕麥肽納米顆粒主要為尺寸50 nm的球形膠束。燕麥蛋白經過胃蛋白酶消化水解度為3.1%，胰蛋白酶消化水解度為10.7%。進一步研究其結構特征，接觸角測試結果表明燕麥肽納米顆粒表面具有一定的疏水性和親油性，具有較好的乳化特性。通過分析變性劑破壞納米顆粒后的尺寸變化，結果顯示燕麥肽自組裝形成納米顆粒的主要驅動力為疏水相互作用。以咖啡酸苯乙酯為模型藥物評估燕麥肽納米顆粒的包封效果，包封率為71%，載藥量為3.5%，體外模擬消化表明該納米顆粒具有良好的耐消化特性。燕麥肽-CAPE納米顆粒的穩態熒光光譜分析表明疏水相互作用是CAPE與肽分子結合主要作用力。本研究為探索肽自組裝的機制問題提供了一定理論依據，且驗證了燕麥肽作為一種新型納米載體的潛力。