紫貽貝(Mytilus edulis)蛋白計算機模擬消化物活性的生物信息學分析

陳艷楠，邱智軍，劉學強，任國艷，李文潔，張夢圓，趙淵，張彬*

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471000)2(河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊，050000) 3(河南科技大學 農(nóng)學院/牡丹學院，河南 洛陽，471000)

貽貝(Mytilussp.)是一種營足絲附著生活的雙殼類軟體動物，屬軟體動物門(Mollusca)，瓣鰓綱(Lanellibranchia)，異柱目(Anisomyaria)，貽貝科(Mytidea)[1]。作為貽貝養(yǎng)殖大國之一，我國2019年的貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)量達87.07萬t，占全球產(chǎn)量的42.09%，其中紫貽貝(Mytilusedulis)、厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)、加州貽貝(Mytiluscalifornianus)等是我國常見的貽貝養(yǎng)殖品種[2]。貽貝本身具有很高的食用價值，其富含蛋白質(zhì)、多聚不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，以及人體所需的8種必需氨基酸，素有“海中雞蛋”的美稱[3]。然而，目前除少量作為凍品、罐頭和干品外，我國大部分貽貝產(chǎn)品仍作為活鮮品銷售，產(chǎn)品單一，資源利用不足[4]。

近年來，對于貽貝來源的生物活性肽的研究越來越受到關注。目前已從貽貝蛋白制備獲得了抗氧化肽[5]、血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme, ACE)抑制肽[4]、抗血栓肽[6]、抗骨質(zhì)疏松肽[7]、抗菌肽[8]、免疫調(diào)節(jié)肽[3]等。然而，從貽貝制備生物活性肽的過程通常依賴于天然蛋白的酶促水解結合多肽混合物的分離和鑒定，整個過程費時、費力、技術難度較大[9]。相比之下，計算機輔助酶解和多肽活性的生物信息學篩選能克服傳統(tǒng)方法中的缺陷，并已逐步應用于指導生物活性多肽的制備和鑒定[10-11]。

基于此，本研究以我國常見的紫貽貝蛋白作為研究對象，使用計算機模擬蛋白消化過程并對消化物中的多肽活性進行了生物信息學分析，以期為紫貽貝蛋白生物活性的闡釋及活性肽的研發(fā)提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 紫貽貝蛋白的選擇

從美國國家生物技術信息中心(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫搜索紫貽貝相關蛋白，選擇其中4種主要蛋白質(zhì)：前膠原蛋白P(Precollagen P，GenBank：AAB80 719.1)、前膠原蛋白D(Precollagen D，GenBank：AAB96 638.1)、肌球蛋白(Myosin heavy chain, partial，GenBank：AAA82 260.1)和肌動蛋白(Actin, partial，GenBank：AAD48 064.1)作為目標蛋白進行模擬消化。

1.2 模擬消化

通過BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫，選擇胃蛋白酶和胰蛋白酶的組合對以上4種目標蛋白進行計算機模擬消化，對消化后的多肽序列進行后續(xù)分析，使用的胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)和胃蛋白酶(pH 1.3，EC 3.4.23.1)的性質(zhì)如表1所示[12]。

表1 所使用的蛋白酶的性質(zhì)Table 1 Properties of proteases

1.3 消化產(chǎn)物中生物活性肽的篩選

使用PeptideRanker程序(https://bioware.ucd.ie/compass/biowareweb/Serverpages/peptideranker.php)對以上收集的多肽中的寡肽(二肽至五肽)進行生物活性預測，并以預測得分的形式表示其生物活性的相對大小[13]。以0.5作為活性預測的閾值，當多肽預測得分大于該值時，認為其具有潛在生物活性。

1.4 消化產(chǎn)物的理化性質(zhì)評價

通過Peptide Property Calculator(http://www.innovagen.com/proteomics-tools)，計算模擬消化后所得寡肽的分子質(zhì)量、等電點、pH 7時的凈電荷和水溶性。以水溶性強弱為依據(jù)，選擇用于后續(xù)研究的肽。

1.5 消化產(chǎn)物的毒性分析

使用ToxinPred程序(http://crdd.osdd.net/raghava//toxinpred/)預測所得寡肽的潛在毒性[14]。

1.6 消化產(chǎn)物的ADMET評價

ADMET(absorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity；吸收、分配、代謝、排泄和毒性)評價是藥物設計和篩選中的重要方法，它對識別具有強藥代動力學譜的新型化合物至關重要[15]。本研究使用admetSAR(http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/)程序對所選寡肽進行在線評價，其中選擇人體腸道吸收(human intestinal absorption, HIA)來確定吸收特性，選擇血腦屏障(blood brain barrier, BBB)穿透率和細胞色素P450(CYP 450)2D6相互作用來分析其分布特征[16]。

1.7 消化產(chǎn)物的活性預測

使用BIOPEP-UWM(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)程序，預測消化后所產(chǎn)生寡肽的潛在生物活性。

1.8 ACE抑制肽的篩選

使用SwissDock(http://www.swissdock.ch/)，將所選寡肽與ACE進行在線分子對接以比較這些寡肽的ACE抑制活性大小[17]。ACE蛋白的晶體結構(人血管緊張素轉換酶與賴諾普利的復合物，1O86.pdb)得自RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)。使用Chemdraw軟件(19.0版)繪制多肽結構，并作為sybyl MOL2格式保存。通過比較寡肽與ACE蛋白對接的結合能大小，選擇潛在的ACE抑制劑。

1.9 二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV, DPP-IV)抑制肽的篩選

使用iDPPIV-SCM程序(http://camt.pythonanywhere.com/iDPPIV-SCM)預測DPP-IV抑制活性并對以上所選寡肽的相對DPP-IV抑制活性打分，其中當寡肽得分大于294時，認為該寡肽是潛在的DPP-IV抑制劑[18]。

1.10 分子對接

使用Discovery Studio(DS)2016軟件進行分子對接研究。從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)獲取ACE(PDB：1O86)和DPP-IV(PDB：5 J3 J)的蛋白晶體結構，并且在對接前除去晶體結構中的水分子并進行結構優(yōu)化。使用Chemdraw軟件(19.0版)繪制多肽結構，以結合能最低的對接構象顯示對接結果。

2 結果與分析

2.1 In silico水解

本研究通過BIOPEP-UWM程序，使用胃蛋白酶(pH 1.3，EC 3.4.23.1)和胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)的組合對4種紫貽貝蛋白進行模擬消化。經(jīng)消化后，4種蛋白均能夠被較好地水解，其中肌球蛋白和肌動蛋白水解度相對較高，分別達到30.85%和22.11%，而前膠原蛋白P、前膠原蛋白D水解度相對較低，均在10%左右。通過水解，前膠原蛋白P、前膠原蛋白D、肌球蛋白和肌動蛋白分別釋放出87、97、64、43條片段(包括氨基酸)，其中二肽至五肽總計分別為30、45、27、25條，占所釋放的總多肽數(shù)的34.48%、46.39%、42.19%、58.14%(圖1)，表明經(jīng)消化后，紫貽貝蛋白釋放出大量短肽，因此對于提供生物活性肽具有良好潛力。

圖1 紫貽貝蛋白模擬水解所釋放的肽段數(shù)和水解度Fig.1 Number of fragments released from M.edulis proteins after in silico digestion and the degree of hydrolysis

2.2 消化產(chǎn)物中寡肽的生物活性評價及理化性質(zhì)分析

通過PeptideRanker程序對消化產(chǎn)生的小分子寡肽打分。除去重復序列后，得分大于0.5的二肽有5條，三肽、四肽均有7條，五肽有6條(表2)，表明這些寡肽具有良好生物活性。隨后，對這25條寡肽進行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)這些多肽的分子質(zhì)量較小，普遍分布在200～500，這使它們在胃腸道內(nèi)能夠被快速吸收，并進一步有利于其生物活性的發(fā)揮。這些多肽的等電點在1.0～11.0廣泛分布，這與它們所含的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數(shù)量比例有關。

表2 紫貽貝蛋白水解肽的活性評價及理化性質(zhì)分析Table 2 Activity evaluation and physical and chemical property analysis of the selected oligopeptides

水溶性是藥物在機體內(nèi)轉運分布的基礎，并且是多肽在生物、食品等領域中應用時需要考慮的重要指標。因此，本研究進一步預測了所得25條寡肽的水溶性情況。在所分析的寡肽中，共獲得9條水溶性寡肽，即YR、DF、GR、GPR、HMR、PGNR、PGPK、PGPR、QYGGR。從這些寡肽的氨基酸序列來看，大部分水溶性寡肽的C末端包含堿性氨基酸賴氨酸(K)和精氨酸(R)，表明C末端堿性氨基酸的存在對多肽水溶性具有重要影響。基于此，對上述9條具有良好生物活性的水溶性寡肽進行下一步分析。

2.3 消化產(chǎn)物的毒性和ADMET評價

本研究首先通過toxinPred程序對上述9條水溶性寡肽進行毒性評價，結果表明其SVM得分大都在-0.8左右，表明其無毒，因而具有良好的應用安全性。

在此基礎上，本研究進一步使用admetSAR2程序預測了這些多肽的ADMET性質(zhì)(表3)。HIA預測結果表明9條水溶性寡肽的HIA值分布在0.4～0.8，表明這些寡肽均具有較好的腸道吸收，其中四肽PGPK(HIA值：0.816 4)、PGPR(HIA值：0.787 0)和二肽GR(HIA值：0.728 4)的腸道吸收概率相對較大。除PGPK外，這些寡肽的BBB滲透性值均大于0.9，表現(xiàn)出良好的BBB滲透性，這可能與所選寡肽的分子質(zhì)量較小有關。CYP450酶顯著影響包括活性肽和其他膳食產(chǎn)品在內(nèi)的多種內(nèi)源性和外源性化合物的代謝。因此，本研究進一步比較了這些寡肽與CYP450 2D6之間的相互作用。預測結果表明這些寡肽均不是CYP450 2D6的底物或抑制劑，與該酶發(fā)生相互作用的概率較低。此外，其他CYP450酶(CYP450 2C9、CYP450 3A4和CYP450 1A2)也表現(xiàn)出類似的預測結果。

表3 所篩選的寡肽的ADMET分析和活性預測Table 3 ADMET analysis and activity prediction of the selected oligopeptides

2.4 消化產(chǎn)物的活性預測

本研究使用BIOPEP程序進一步預測了9種寡肽的具體生物活性(表3)。結果表明，在這些寡肽中，DF、GR、GPR、PGNR、PGPK、PGPR、QYGGR顯示出ACE抑制活性，YR、HMR、GPR、PGNR、PGPK、PGPR、QYGGR顯示出DDP-IV抑制活性，YR、GPR、HMR、PGPR、QYGGR顯示出DDP-III抑制活性，GPR、PGNR、PGPK、PGPR顯示出抗血栓和抗失憶活性，PGNR顯示出腎素抑制活性，YR顯示出神經(jīng)肽活性等。這些結果表明，紫貽貝蛋白在消化后產(chǎn)生了大量生物活性肽，因而具有良好的營養(yǎng)價值和生物學功能。

2.5 ACE抑制肽的篩選

本研究使用SwissDock分子對接比較了7條預測具有ACE抑制活性寡肽的抑制能力(表4)。7條寡肽與ACE蛋白對接時的吉布斯自由能均為負值，表明這些寡肽均能與ACE發(fā)生良好相互作用，從而發(fā)揮抑制活性。根據(jù)文獻檢索，發(fā)現(xiàn)其中GR已有報道，其IC50值為3 110 μmol/L，而GPR和DF作為寡肽序列的N末端(GPRGF)或C末端(KPAGDF)部分報道，其余4條寡肽均為尚未報道的新型ACE抑制肽。在這4條新型寡肽中，五肽QYGGR的ΔG值最小(-11.19 kcal/mol)，該對接結果優(yōu)于大西洋鮭膠原蛋白(ΔG值最小為四肽GPEG，ΔG：-9.87 kcal/mol)[19]和黃花魚肌聯(lián)蛋白(ΔG值最小為三肽WAR，ΔG：-10.40 kcal/mol)[20]模擬水解多肽中ACE抑制肽的篩選結果，表明QYGGR具有良好的ACE抑制能力和開發(fā)潛力。

表4 ACE抑制肽的篩選Table 4 Screening of ACE inhibitory peptides

在所篩選出的7條潛在的ACE抑制肽中，QYGGR、PGPR和GPR來源于前膠原蛋白D，PGNR、GPR、PGPK和GR來源于前膠原蛋白P，而DF來源于肌動蛋白，由此可以看出膠原蛋白在獲得新型ACE抑制肽方面具有重要研究價值。從另一方面考慮，紫貽貝中膠原蛋白含量約為干重的8%[21]，而肌球蛋白和肌動蛋白分別約占干重的20%和30%[22]。因此，對于單一多肽，肌動蛋白來源的多肽豐度可以大致估算為膠原蛋白來源多肽的4倍，表明盡管通過模擬消化從肌動蛋白所獲得的ACE抑制肽的條數(shù)較少，但由于其相對高的豐度，因而在紫貽貝消化物的ACE抑制活性方面仍具有一定作用。

2.6 DPP-IV抑制肽的篩選

DPP-IV參與腸促胰島素激素加工過程并在血糖調(diào)節(jié)中起關鍵作用[26]。基于此，本研究根據(jù)表5中的篩選結果，使用iDPPIV-SCM程序對具有潛在DPP-IV抑制活性的7條寡肽打分。除PGPR和QYGGR外，5條寡肽的預測得分大于閾值294，表明其具有DPP-IV抑制活性，其中HMR的抑制活性最高，其預測得分達到380.5，優(yōu)于已報到的大部分植物來源(大豆、羽扇豆、藜麥)的DPP-IV抑制肽[27]。同時，通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)以上5條寡肽均無相關文獻報道，表明它們是具有良好研究價值的新型DPP-IV抑制肽。由于HMR的預測打分最高，因此將其用作潛在的DPP-IV抑制劑進行后續(xù)研究。

表5 DPP-IV抑制肽的篩選Table 5 Screening of DPP-IV inhibitory peptides

在所篩選出的5條潛在的DPP-IV抑制肽中，GPR來源于前膠原蛋白D，PGPK、GPR和PGNR來源于前膠原蛋白P，而HMR、YR來源于肌球蛋白，由此可見膠原蛋白和肌球蛋白在獲得新型DPP-IV抑制肽方面具有重要價值。同樣，從多肽豐度角度考慮，膠原蛋白和肌球蛋白來源的多肽均在紫貽貝消化物的DPP-IV抑制活性方面發(fā)揮著重要作用。

2.7 分子對接

為了進一步闡明多肽與目標蛋白之間的相互作用，本研究進一步將QYGGR(ACE抑制活性)和HMR(DPP-IV抑制活性)分別與ACE蛋白和DPP-IV蛋白進行分子對接。

在QYGGR與ACE的分子對接中，QYGGR能夠結合ACE的活性殘基，形成穩(wěn)定復合物，其-CDOCKER能值為-156.078 kcal/mol，表明兩者之間具有良好的結合親和力(圖2-a)。對接結果顯示QYGGR主要通過與ACE蛋白分子的Tyr523、Glu411、Ala356、Ala354、Ser355、His513、His353、Glu376、Gln281、Asn277、Thr166形成11個氫鍵，與Trp357、Glu384、Asp415、Glu376、Glu162形成靜電吸引來形成穩(wěn)定復合物(圖2-b)。ACE蛋白分子的活性位點主要包括12個氨基酸殘基，即Gln281、Glu411、His513、His383、Glu384、His387、Tyr523、His353、Glu162、Tyr520、Lys511和Ala354[17]。QYGGR通過與Tyr523、Glu411、Ala354、His513、His353、Gln281、Glu384、Glu162發(fā)生相互作用而產(chǎn)生抑制。

a-ACE-QYGGR復合物的預測3D結構;b-ACE-QYGGR分子相互作用的2D圖圖2 ACE-QYGGR的分子對接圖Fig.2 Molecular docking diagram of ACE-QYGGR

在HMR與DPP-IV的分子對接中，HMR能夠結合DPP-IV的活性殘基，形成穩(wěn)定復合物，其-CDOCKER能值為-92.410 kcal/mol，表明兩者之間具有良好的結合親和力(圖3-a)。HMR主要通過與DPP-IV蛋白分子中的Tyr547、Tyr662和Glu205形成氫鍵、與His740形成π-烷基鍵、與Ser630、Tyr666和Tyr662形成π-π或酰胺-π鍵、與Tyr666、Asp663、Glu205、Glu206、Arg669和Arg358形成電荷吸引進行結合(圖3-b)。DPP-IV分子包含3個活性口袋：S1、S2和S3，其中S1含有Tyr547、Ser630、Tyr631、Val656、Trp659、Tyr662、Tyr666、Asn710、Val711和His740；S2含有Glu205、Glu206和Tyr662；S3含有Ser209、Arg358和Phe357[18]。因此，HMR通過與S1中的Tyr547、Tyr662、His740、Ser630和Tyr666、S2中的Glu205、Glu206和Tyr662以及S3中的Arg358發(fā)生相互作用而產(chǎn)生抑制。

盡管本研究未對預測結果進行體外實驗驗證，但先前研究表明通過生物信息學方法對多肽分子生物活性的預測具有較好的可信性。例如，YU等[28]在對來源于卵轉鐵蛋白的ACE抑制三肽的研究中比較了分子對接過程中-CDOCKER能值最大的2種三肽EWL(106.486 kcal/mol)和KDF(103.876 kcal/mol)的體外抑制活性，結果顯示-CDOCKER能值更高的三肽EWL同時也具有更強的體外抑制活性，表明分子對接方法能夠在一定程度上指示小分子配體對目標蛋白的抑制效果。同時，本研究中所發(fā)現(xiàn)的ACE抑制肽QYGGR與ACE的-CDOCKER能值達到156.078 kcal/mol，遠大于上述研究中的EWL，表明其具有較好的潛在ACE抑制活性和研究價值。同時，本研究中所發(fā)現(xiàn)的DPP-IV抑制肽HMR與DPP-IV的-CDOCKER能值達到92.410 kcal/mol，其高于雞蛋來源的水溶性DPP-IV抑制肽CDR(-CDOCKER能值為81.371 3 kcal/mol，IC50=24.49 mmol/L)[29]，表明其具有較好的潛在DPP-IV抑制活性。另一方面，盡管體外、體內(nèi)和隨機對照試驗能夠直接指示食源性多肽的生物活性，但這些肽對健康的有益作用仍需研究證實，而本研究提供了對紫貽貝源多肽活性的快速篩選，這為其長期研究提供了參考[30]。

a-DPP-IV-HMR復合物的預測3D結構;b-DPP-IV-HMR分子相互作用的2D圖圖3 DPP-IV-HMR的分子對接圖Fig.3 Molecular docking diagram of DPP-IV-HMR

另外，本研究使用胃蛋白酶和胰蛋白酶的組合對紫貽貝蛋白進行模擬消化，獲得了具有高ACE抑制活性的五肽QYGGR和高DPP-IV抑制活性的三肽HMR。然而，胰凝乳蛋白酶同樣是人腸道中存在的一種重要的絲氨酸蛋白酶，因此對本研究中所篩選出的多肽存在潛在的酶切可能。基于上述考慮，使用胰凝乳蛋白酶(EC 3.4.21.1)分別對QYGGR和HMR進行模擬水解，發(fā)現(xiàn)兩者均能被其進一步酶切。這提示當在人體中使用時，應進一步確認2種功能性多肽在體內(nèi)的實際消化穩(wěn)定性，從而為其廣泛應用提供更完備的依據(jù)。

3 結論

本論文研究了紫貽貝主要蛋白的模擬消化情況，其中肌球蛋白和肌動蛋白水解度相對較高，分別達到30.85%和22.11%，而前膠原蛋白P、前膠原蛋白D水解度相對較低，均在10%左右，消化后4種蛋白均釋放出大量寡肽(二肽至五肽)。通過PeptideRanker活性評分以及理化性質(zhì)分析，從這些寡肽中篩選出9條具有潛在研究價值的多肽。通過ADMET分析和生物活性預測，發(fā)現(xiàn)9條寡肽中，DF、GR、GPR、PGNR、PGPK、PGPR、QYGGR具有ACE抑制活性，YR、HMR、GPR、PGNR、PGPK、PGPR、QYGGR具有DPP-IV抑制活性。對具有潛在ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性的寡肽進行篩選，將QYGGR和HMR分別確定為具有潛在研究價值的ACE抑制肽和DPP-IV抑制肽。通過分子對接發(fā)現(xiàn)，QYGGR和ACE蛋白以及HMR和DPP-IV蛋白能夠形成穩(wěn)定復合物，其-CDOCKER能值分別為-156.078和-92.410 kcal/mol，其中QYGGR通過與ACE分子中的Tyr523、Glu411、Ala354、His513、His353、Gln281、Glu384、Glu162發(fā)生相互作用而產(chǎn)生抑制，而HMR通過與DPP-IV的S1中的Tyr547、Tyr662、His740、Ser630和Tyr666、S2中的Glu205、Glu206和Tyr662以及S3中的Arg358發(fā)生相互作用而產(chǎn)生抑制。本研究為紫貽貝營養(yǎng)價值的闡釋以及紫貽貝來源的生物活性肽的開發(fā)提供了理論依據(jù)。