木瓜蛋白酶聯合沙蒿籽膠對面團的增筋作用及機理研究

衛曉怡，蘇婷婷，司曉晶，張路遙，韓梅，崔琳琳

(上海商學院 酒店管理學院食品系，上海，200235)

隨著食品工業水平的發展，對耐機械加工和發酵穩定性高的高筋小麥粉的需求量持續增高[1]。我國小麥品種眾多，受限于種植水平、種植環境和管理難度，其品質差異較大，變異系數高達75.6[2]。針對這種面團流變特性及加工品質變異范圍大以及優質高筋粉欠缺等問題，亟待開發安全有效的面筋強化劑。

目前常用面粉增筋劑為偶氮甲酰胺(azoformamide)，據報道，偶氮甲酰胺可能危害呼吸系統以及導致皮膚敏感反應，其安全性在日本及歐盟地區受到質疑而被禁用，我國和美國將其列為限量添加(<0.045 g/kg)。更安全的食用膠體在當下逐漸成為一個熱門話題，這類物質在面團形成初期就以緊密的三維網狀結構包裹面粉中存在的細小淀粉顆粒，并在發酵產氣內部體積擴張后，避免脆弱的面筋網絡受影響而破裂，仍然能夠維持聯結結構[3]。沙蒿籽膠(ArtemisiasphaerocephalaKrasch gum，ASKG)提取自植物，是一種高安全性、高吸水性和高黏性的食用膠[4]，具有抗糖尿病、肥胖和降血糖等生理功效，但沙蒿籽膠過多添加會使得面筋蛋白之間交聯過于緊實而彈性不足，影響口感[5]。

木瓜蛋白酶(papain，巰基蛋白酶)具有酶活力高、熱穩定性好及天然安全等特點，常用于面制品減筋，使面團具有良好的可塑性和延伸性[6]。然而，酶水解的蛋白也可產生連接作用，如木瓜蛋白酶可以使大豆蛋白—SH、—S—S—和疏水性氨基酸殘基暴露，隨即通過疏水、二硫鍵等作用促使蛋白形成凝膠[7-8]。本研究團隊在前期實驗中發現，木瓜蛋白酶對面團形成具有潛在的增筋效果，輕度水解時濕面筋含量下降，但面筋指數反而升高，其作用機理亟待探討。

復配添加劑的使用往往對改良小麥粉品質有較好的效果。本研究探討木瓜蛋白酶聯合沙蒿籽膠添加對面團的增筋作用與機理，以期為探究替代偶氮甲酰胺的天然增筋劑提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售面粉(蛋白質10%)，濰坊風箏面粉有限責任公司；酵母粉，安琪酵母股份公司；木瓜蛋白酶(60 000 U/g以上)，南寧龐博生物工程有限公司；沙蒿籽膠(含量98%，食品級)、偶氮甲酰胺(含量99%，食品級)，河北百味生物科技有限公司。彩色預染蛋白質分子質量標準(10～180 kDa)，BeyoColorTMP0069。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

2200型面筋儀，波通瑞華科學儀器(北京)有限公司；5425型臺式離心機，德國Eppendorf；FD-1D-50A型真空冷凍干燥機，上海歐蒙；MX-S型旋渦式振蕩器，美國Scilogex；Multiskan SkyHigh型紫外/可見光分光光度計、Apreo型掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)，賽默飛；Bio-Rad型電泳儀，美國伯樂；ZF288型全自動凝膠成像分析，上海嘉鵬科技ZF288。

1.3 實驗方法

1.3.1 木瓜蛋白酶水解酶活力測定

以酪蛋白為底物，采用分光光度法測定蛋白酶活力，以1 min水解產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位(U)。測得木瓜蛋白酶活力為72 000 U/g。木瓜蛋白酶使用量以面粉質量計。

1.3.2 濕面筋量、面筋指數的測定

適量小麥粉中分別加入不同劑量的木瓜蛋白酶、沙蒿籽膠、偶氮甲酰胺，混勻。采用面筋儀測定濕面筋量、面筋指數，稱取各處理組小麥粉(10.00±0.01)g(添加劑含量低，其質量忽略不計)，添加5 mL蒸餾水，面團混合20 s后按暫停鍵暫停，取出面團放入不同溫度的恒溫箱保持靜置55 min。將反應后的面團再和面5 min，放入面筋儀啟動后續程序，參考GB/T 5506.2—2008《小麥和小麥粉面筋含量 第2部分：儀器法測定濕面筋》、LS/T 6102—1995《小麥粉濕面筋質量測定法面筋指數法》測定濕面筋量和面筋指數。

1.3.3 酶反應后醇溶蛋白和谷蛋白的提取

稱取1 g木瓜蛋白酶加入小麥粉至180 g，攪拌混勻后取1 g，加入小麥粉至100 g混勻，即在小麥粉中添加4 U/g木瓜蛋白酶，通過面筋儀制備濕面筋：稱取小麥混合粉(10.00±0.01) g，添加5 mL蒸餾水，面團混合20 s后按暫停鍵暫停，保持靜置達30、60、90、120、150、180、210、240 min等反應時間，再繼續啟動洗滌5 min，水溶性和鹽溶性蛋白、酶等物質被洗去，完成濕面筋制備。對照樣為無添加小麥粉。取出濕面筋立即真空冷凍干燥，凍干粉在研缽中磨碎，加入150 mL的HCl溶液(2×10-3mol/L)，磁力攪拌20 min后離心10 min (5 000 r/min)，同樣方法重復3次，分別合并3次分離的上清液(Glu，即酸溶蛋白)和沉淀(Gli，即酸不溶蛋白)。上清液定容至500 mL，沉淀加入500 mL體積分數70%乙醇溶解并定容，2種蛋白組分溶液待測。

1.3.4 醇溶蛋白和谷蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍G-250法測定各蛋白組分的含量。取Glu、Gli蛋白提取液各0.1 mL，加入0.9 mL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，放置2 min，于595 nm下比色測定吸光度(比色應在1 h內完成)，并用標準牛血清白蛋白作標準曲線，按公式(1)計算蛋白含量，按公式(2)計算m(Gli)/m(Glu)比值：

(1)

(2)

式中：C，蛋白含量，%；m1，Glu或Gli蛋白質量，g；m2，小麥粉質量，g；m(Gli)/m(Glu)，醇溶蛋白與谷蛋白質量比；m3，Gli蛋白質量，g；m4，Glu蛋白質量，g。

1.3.5 醇溶蛋白和谷蛋白的SDS-PAGE分析

取Glu、Gli蛋白提取液各0.1 mL，加入0.9 mL蒸餾水、0.25 mL非還原性溴酚藍上樣緩沖液以及4滴丙三醇于指型管中，沸水浴5 min后搖勻。采用質量分數5%濃縮膠和12%的分離膠對蛋白組分進行分析。上樣量為15 μL，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓180 V，溴酚藍指示劑遷移至膠底時停止電泳，小心取下凝膠，進行考馬斯亮藍染色液(2∶1)染色50 min，乙酸溶液反復脫色至條帶清晰。

1.3.6 饅頭制作方法

小麥粉與蒸餾水按質量比2∶1與質量分數1%酵母粉放入和面機中，和面10 min，在30 ℃，相對濕度70%的醒發箱中發酵30 min，取出發酵面團切成70 g，手工搓揉成饅頭胚型后繼續醒發20 min，放入冷水鍋內，水沸后計時蒸制20 min，取出饅頭冷卻30 min待測。用排油菜籽法測定饅頭體積并按公式(3)計算比容：

(3)

式中：P，比容，mL/g；V，饅頭體積，mL；m，饅頭質量，g。

1.3.7 面團結構的掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)分析

將饅頭樣品切成薄片冷凍干燥，離子濺射儀噴金后，以掃描電鏡放大×600/×10 000倍成像面筋三維網絡結構。

1.3.8 數據及響應面分析

采用SPSS 18.0中的Duncan’s進行數據的差異性分析，P<0.05表示顯著性差異。結果以平均值±標準差表示。根據單因素試驗結果，采用Design-Expert 12作響應面分析。

2 結果與分析

2.1 木瓜蛋白酶添加對面筋的影響

2.1.1 木瓜蛋白酶對濕面筋量與面筋指數的作用

在面粉中添加木瓜蛋白酶制作面團，木瓜蛋白酶添加量與濕面筋量倒數呈正相關性，R2=0.938 2(圖1)。濕面筋量隨著木瓜蛋白酶添加量增加而減少，當木瓜蛋白酶添加量>5 U/g時濕面筋量減少速度加快。此結果表明，低劑量木瓜蛋白酶(<5 U/g)可使面筋在1 h內輕度水解，與已有相關研究結果一致[6]，木瓜蛋白酶打斷二硫鍵而水解不溶的小麥蛋白為可溶性的多肽，導致濕面筋量減少。一般來說，酶水解導致的濕面筋含量減少會引起面筋指數的同步降低。然而，本研究結果顯示，隨著木瓜蛋白酶的添加，與其相應的面筋指數呈先緩慢上升而后下降的趨勢，呈線性不相關，R2=0.286 2(圖2)，在木瓜蛋白酶添加量為3～8 U/g時，面團有較高的面筋指數值，酶添加量>8 U/g時面筋指數迅速下降。

圖1 木瓜蛋白酶添加量與面團濕面筋量的相關性分析Fig.1 Correlation analysis between papain addition and gluten content of dough注：圖上標不同字母表示顯著性差異(P<0.05)(下同)

圖2 木瓜蛋白酶添加量與面團面筋指數相關性分析Fig.2 Correlation analysis between papain addition and gluten index of dough

有研究通過添加Glu和Gli構建重組粉，隨著重組粉中m(Gli)/m(Glu) 的減小，濕面筋含量下降，而面筋指數上升[9]，增加Glu的面團存在更緊密、牢固而有彈性的面筋蛋白網絡微觀結構[10]。

2.1.2 木瓜蛋白酶對Glu和Gli蛋白的影響

Glu、Gli是構成小麥粉蛋白的兩大組分，通常Gli占比略高，但在實際分離提取過程中受多種因素影響，所得Glu、Gli含量存在較大差異[11]。本實驗結果顯示，原小麥粉Glu含量為(3.53±0.03)%、Gli含量為(4.02±0.04)%，m(Gli)/m(Glu)為1.14，隨著小麥粉中添加4 U/g木瓜蛋白酶反應時間的延長，在1 h內，木瓜蛋白酶對Gli的水解速度快于Glu，m(Gli)/m(Glu)比值顯著降低至0.72(P<0.05)，反應超過1 h后，Gli含量基本保持不變而Glu持續水解，2 h后m(Gli)/m(Glu)比值轉而升高(表1)。

表1 木瓜蛋白酶反應時間對小麥粉中Glu、Gli以及m(Gli)/m(Glu)的影響Table 1 Effects of papain reaction time on Glu, Gli and m(Gli)/m(Glu) in wheat flour

非還原蛋白質電泳結果顯示(圖3)，Glu電泳條帶在240 min內隨著木瓜蛋白酶(4 U/g)作用時間的延長而逐漸變淺，而Gli在60 min內快速酶解，表明木瓜蛋白酶對Gli較Glu有更快的降解速度。使用木瓜蛋白酶時，Gli先被大量酶解，使表現高筋力的Glu占比暫時提升，m(Gli)/m(Glu) 減小導致面筋指數增大，但是隨著Glu被木瓜蛋白酶繼續酶解，面筋指數隨m(Gli)/m(Glu) 的變大而有所降低。這與上述測定Glu、Gli含量比值的變化趨勢一致。

上述結果表明，木瓜蛋白酶對Gli和Glu的酶解速率不同而導致m(Gli)/m(Glu)比值先下降后升高，反映在面筋指數呈先上升隨后下降的變化趨勢。小麥粉在木瓜蛋白酶添加量4 U/g下，1～2 h內m(Gli)/m(Glu)比值下降至最低并保持穩定(表1)，酶在此作用濃度和時間范圍內，有助于提升Glu在面筋蛋白中的占比，Gli分散在Glu膨潤狀態下形成的網狀結構中[9-10]，利于提高面筋指數。

a-谷蛋白；b-醇溶蛋白圖3 木瓜蛋白酶解小麥谷蛋白和醇溶蛋白的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE of wheat protein (Glu and Gli) hydrolyzed by papain

2.2 沙蒿籽膠添加對面筋的影響

沙蒿籽膠添加量與濕面筋量、面筋指數呈正相關，分別為R2=0.850 8(圖4)、R2=0.853 2(圖5)，沙蒿籽膠質量分數0.5%～1.0%，可使濕面筋量迅速增加，而在質量分數0.5%～2.0%，面筋指數逐步增加。有研究表明，當沙蒿籽膠添加量>1.5%時，面包感官評分呈下降趨勢[5]。綜合考慮，質量分數0.5%～1.5%的沙蒿籽膠較適用于小麥粉增筋。

圖4 沙蒿籽膠添加量與面團濕面筋量相關性分析Fig.4 Correlation analysis between ASKG addition and gluten content of dough

2.3 木瓜蛋白酶聯合沙蒿籽膠復配優化及對饅頭制品的影響

2.3.1 響應面法優化面團制作

圖5 沙蒿籽膠添加量與面筋指數相關性分析Fig.5 Correlation analysis between ASKG addition and gluten index of dough

根據上述單因素試驗結果，同時考慮酵母最佳發酵溫度為25～35 ℃，采用3因素3水平Box-Behnken試驗設計響應面法確定最優復配比例，因素編碼及水平見表2。面筋指數反映面團的彈性和延展性，因此，以各因素對面筋指數的影響來判斷改良效果和確定最優復配比例。

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and their levels of response surface design

通過 Design Expert 軟件對響應面試驗結果(表3)進行多元回歸擬合，得到面筋指數(Y，%)對溫度、木瓜蛋白酶及沙蒿籽膠的二次多項回歸方程：

Y=-104.181+9.386A+10.739B+42.499C+0.110AB-0.162A2-1.849B2-19.967C2

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental data

表4 回歸模型方差分析結果Table 4 Analysis of variance for the proposed regression model

根據回歸方程及方差分析得響應面圖(圖6)，各因素相互之間的影響均呈先增后減的拋物線型關系，均有一個極大值點。

a-木瓜蛋白酶添加量與溫度;b-沙蒿籽膠與木瓜蛋白酶添加量;c-沙蒿籽膠添加量與溫度圖6 木瓜蛋白酶、沙蒿籽膠和溫度等各因素影響面團面筋指數的響應面圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters (papain, ASKG and temperature) on the gluten index of dough

在所選擇的試驗范圍內，依據一次項回歸系數絕對值的大小可知因素的主效應關系為：沙蒿籽膠>木瓜蛋白酶>溫度。溫度影響木瓜蛋白酶的酶解能力而兩者產生交互作用(表4)。

通過求解回歸方程，復配添加劑形成面團的最佳條件為:溫度30.7 ℃，木瓜蛋白酶添加量3.9 U/g，沙蒿籽膠添加量1.1%，在此條件下形成的面筋指數預測值為84.7%，相應條件下驗證實驗所得值為86.11%(表5)，實際值與預測值之間的相對誤差為1.6%，預測與實際較相符。

對比各組，木瓜蛋白酶與沙蒿籽膠復配添加組的濕面筋含量為(36.22±0.52)%，面筋指數為(86.11±1.54)%，分別是未添加組的1.36和1.55倍(表5)。木瓜蛋白酶與沙蒿籽膠復配添加可改善面團品質，優于沙蒿籽膠或偶氮甲酰胺單獨使用(P<0.05)，是優良而安全性高的小麥粉增筋劑。以木瓜蛋白酶輕度酶解面筋蛋白，有利于減少沙蒿籽膠作為增筋劑的添加量，減少對口感的影響。

表5 不同添加劑對面團濕面筋量、面筋指數的影響Table 5 The influence of different addition agents on wet gluten content and gluten index of dough

2.3.2 復配添加劑對饅頭制品的影響

與無添加組或偶氮甲酰胺添加組(0.02 g/kg)對比，在最優化復配(沙蒿籽膠1.1%，木瓜蛋白酶3.9 U/g)條件下制作的饅頭體積有顯著提高，三者比容分別為(1.96±0.16)、(2.30±0.15)、(2.69±0.11) mL/g(P<0.05)。切開饅頭從內部結構看，無添加組(圖7-a)由于面筋的延展性不夠而出現表皮與內芯分離現象；同時由于面筋的彈性不足而導致發酵產氣膨脹而破壞面筋網絡結構，部分相鄰氣孔合并為大氣孔，孔徑大小不均勻、結構較粗糙。偶氮甲酰胺添加組(圖7-b)的氣孔基本均勻，但仍存在個別大氣孔。與此相對應的是，復配添加組(圖7-c)的氣孔細膩均一、彈性較足，表明面筋網絡結構有顯著增強，限制了發酵氣體膨脹對面團結構的有害影響。

a-無添加；b-偶氮甲酰胺添加；c-木瓜蛋白酶-沙蒿籽膠復配添加圖7 不同添加劑對饅頭外觀品質的影響Fig.7 Effect of different addition agents on the appearance quality of steamed bread

電鏡微觀研究表明，親水膠體會阻礙面筋蛋白網絡結構的形成。張帥[12]通過SEM探究了添加0.6%沙蒿籽膠的面團的微觀結構，發現面筋蛋白的連續性受到破壞，然而又因沙蒿籽膠具有較高黏性，可將散碎的面筋蛋白粘合起來，對饅頭比容沒有顯著影響，仍可提供饅頭形狀結構的支撐，且使饅頭更耐老化，并不影響色澤與口感。因此，對于添加親水膠體的面團，僅僅考察面筋形成階段蛋白的聯結，并不能客觀反映面團加工特性改良情況。為此，本研究通過掃描電鏡分析沙蒿籽膠對饅頭微觀結構的影響。

通過SEM分析得到×600和×10 000放大倍數下的饅頭內部微觀組織結構(圖8)，饅頭樣品600倍放大SEM圖像顯示，無添加組(圖8-a)有大量的散落小顆粒附著于面筋網絡結構之上且互相無聯結，這些小顆粒的主要成分應為淀粉物質與少量的面筋蛋白。在偶氮甲酰胺添加組中(圖8-c)，大部分小顆粒與面筋網絡結構較疏松地聯結，形成一個較完整的整體。木瓜蛋白酶和沙蒿籽膠復配添加組(圖8-d)中能夠看到在其面筋蛋白網絡結構中有大量緊密結合的小粒徑顆粒，幾乎無獨立小顆粒存在于整體結構之外。以放大10 000倍圖像觀察，無添加組(圖8-b)的蛋白網絡結構有不連續相和空洞，偶氮甲酰胺添加組(圖8-d)的蛋白質基質呈簇狀的略不均勻分布且網絡結構疏松，木瓜蛋白酶和沙蒿籽膠復配添加組(圖8-e)的網絡結構有較好的連續和融合性。

a-無添加，×600倍；b-無添加，×10 000倍；c-偶氮甲酰胺添加，×600倍；d-偶氮甲酰胺添加，×10 000倍；e-木瓜蛋白酶-沙蒿籽膠添加，×600倍；f-木瓜蛋白酶-沙蒿籽膠添加，×10 000倍圖8 不同添加劑對饅頭微觀組織結構的影響Fig.8 Effect of different addition agents on the microstructure of steamed bread

3 討論

Glu分子內及分子間均有二硫鍵，主要決定面團的彈性；Gli通過氫鍵和疏水作用相互反應，與面團黏性和延展性有關。本研究結果表明，木瓜蛋白酶對Glu和Gli的酶解速率不同，可降低m(Gli)/m(Glu)比值以提高小麥粉面筋指數，具有一定增筋效果。據相關文獻報道，添加0.475%(E/S，換算為19 U/g)的木瓜蛋白酶在60 ℃下1.63 h，可使谷朊粉酶解達最大值[13]，或者添加0.15%(E/S，換算為9 000 U/g)的木瓜蛋白酶可在15 min內充分水解小麥蛋白[14]，采用高劑量的酶或長時間反應都可充分水解蛋白為可溶性多肽，不適用于面筋改性。也有研究表明，酶促大豆蛋白凝固的木瓜蛋白酶使用量為510 U/g[7]，這與本研究3.9 U/g的最佳添加量不同，推測是因為酶對大豆蛋白和小麥蛋白的作用機理不同。有研究通過向小麥粉直接添加相應組分來調整m(Gli)/m(Glu)比值[9]，也有研究發現小麥在一定的儲藏期Gli含量降低，Glu逐漸增加，但蛋白質總量不變，這種儲藏期蛋白組分的變化是小麥粉烘焙性能隨之提高的重要原因[15]。

已有研究表明，沙蒿籽膠作為食用膠體添加后與水結合會形成類凝膠的物質，更好地包裹住面粉中的細小物質，其中包括部分可能會在洗面筋時流失的面筋蛋白和細小淀粉顆粒，同時也會通過類似凝膠包裹的作用覆蓋面團聯結網絡，形成軟性保護層以增加網絡結構的韌性[16-17]。在這樣的吸水性和黏性提升作用之下，不僅增加面團的總量，也在一定程度上改善了面筋的質量。已有研究表明，在面粉中添加不超過1.0%的沙蒿籽膠，面團穩定時間延長[12,18]，面條品質最佳[19]，這與本研究中沙蒿籽膠在小麥粉中的最佳添加量為1.1%的結果基本一致。

沙蒿籽膠常與其他增筋劑復配使用，提升增筋效果，同時可避免高劑量引起的高硬度影響到面制品口感。已有研究表明，復配添加3%谷朊粉和2%沙蒿籽膠(占燕麥粉和面包粉總質量)的高纖燕麥面包的品質達到最優[20]。發酵改性玉米面條的最佳復配添加為6%谷朊粉、1.2%沙蒿籽膠、0.6%黃原膠[21]。在小麥和鷹嘴豆復合面粉中，添加0.03%～0.5%的沙蒿籽膠有利于面團黏彈性增加，高于0.8%則呈下降趨勢[22]。添加0.5%沙蒿籽膠可改善蕎麥面包特性，添加超過1.3%時蕎麥面包比容和感官評價下降[23]。沙蒿籽膠的最佳使用劑量可能與它的提取方法和純度以及面粉特性有關。本研究結果表明，1.1%沙蒿籽膠與3.9 U/g木瓜蛋白酶復配添加能提升面筋網絡結構強度，發酵時穩定容納氣體而提高比容，不影響色澤與口感，適用于饅頭制品加工。

4 結論

本研究結果顯示，通過木瓜蛋白酶適度水解，利用其對面筋蛋白中的醇溶蛋白較谷蛋白有更快的酶解速度，使表現高筋力的谷蛋白的相對占比提升，同時添加沙蒿籽膠以其高黏性和持水性從而增加面筋強度，兩者共同作用增強面筋三維網絡結構，因而能在高溫焙烤時將酵母產生的CO2氣體包裹住以減慢擴散速率，使饅頭比容增大，效果優于偶氮甲酰胺。天然制劑的木瓜蛋白酶聯合沙蒿籽膠能增強面團筋力，可作為常用增筋劑偶氮甲酰胺的優良替代品。