不同嫩化劑改善豬大腸嫩度的工藝優化

程成鵬，賀稚非,2，唐春，李芳，廖林，李洪軍,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715) 3(四川高金實業集團股份有限公司，四川 遂寧，629000)

豬大腸又叫豬臟、肥腸、葫蘆頭，是豬的內臟器官，包括盲腸、結腸和直腸，管壁分為黏膜層、黏膜下層、肌肉層、漿膜層，是我國飲食體系中常見的食材。同時豬大腸在中醫體系中還有潤燥、補虛、止渴止血等醫療養生價值[1]。但豬大腸存在口感堅韌，久煮不爛的缺點。

嫩度是影響肉感官的重要因素之一[2-3]，其在消費者的購買決策中，尤其是重復性購買中起著重大的作用。嫩度受到一系列生物和環境因素的影響，例如肌肉組成、脂肪含量、畜種和品種、鈣蛋白酶及鈣蛋白酶抑制蛋白、宰前和宰后的處理等[4]。目前物理嫩化方法主要有沖擊波法、超高壓法、滾揉法等。滾揉嫩化是通過機械作用對肉進行翻滾、摔打從而使肉質表面結構松軟柔嫩，但這種方法存在交叉污染的風險[5]。超高壓技術是通過高壓破壞肌漿網膜和溶酶體膜，激活鈣蛋白酶，增加胞漿內組織蛋白酶數量，從而降解肌原纖維蛋白，肉品得到嫩化，但該方法可能對肉品的色澤、持水力和風味造成一定的負面影響[6]。沖擊波是指在幾分之一毫秒產生的高達1 GPa的壓力波，具有低成本、效率高的優點，該技術最先應用于牛肉的嫩化，但其對產品包裝要求較高，商業化推廣具有一定的局限性[7]。化學嫩化方法中常用嫩化劑主要有鹽類、有機酸、磷酸鹽等[8]。這些化學物質主要是通過改變蛋白質溶解度或影響蛋白酶作用從而提高食品嫩度[8]。生物嫩化方法主要是利用外源蛋白酶消化結締組織和肌肉蛋白質[9]，降低肉的剪切力，從而達到嫩化的效果。目前，木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、獼猴桃蛋白酶的應用較為廣泛，其中木瓜蛋白酶為含疏基肽鏈內切酶，穩定性高，對蛋白質、多肽類、酯類等物質有著較強的水解能力[10-11]，可以作用于膠原蛋白和彈性蛋白從而水解肌肉蛋白并增加肉的嫩度[12]。

本研究通過響應面設計，以NaOH、木瓜蛋白酶為嫩化方法，對豬大腸進行嫩化處理，以得率、蒸煮損失、剪切力和感官評分為評價手段，對比研究化學和生物方法對豬大腸嫩化的最佳條件，填補豬大腸嫩化研究的空白，以期為豬大腸嫩化方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

豬大腸由四川高鑫食品股份有限公司提供，于-18 ℃的環境下貯藏。

1.2 主要試劑

NaOH，重慶躍翔化工有限公司；NaHCO3(純度≥99%)、CaCl2(純度≥99%)，均為分析純，上海源葉生物科技有限公司，木瓜蛋白酶(5萬U/g)、菠蘿蛋白酶(3萬U/g)，河北萬邦實業有限公司。

1.3 儀器與設備

FA214A分析天平，上海豪晟科學儀器有限公司；C-LM3B型數顯式肌肉嫩度儀，北京天翔飛域儀器設備有限公司；磁力攪拌水浴鍋，常州恩培儀器制造有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 單因素試驗

研究不同NaOH質量濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)、時間 (20、25、30、35、40 min)和溫度(25、30、35、40、45 ℃)對豬大腸嫩化效果的影響。研究不同木瓜蛋白酶質量濃度(1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 g/L)、時間(70、80、90、100、110 min)和溫度(25、30、35、40、45 ℃)對豬大腸嫩化效果的影響。

1.4.2 樣品嫩化處理

將豬大腸置于4 ℃條件下解凍12 h，去除表面可見脂肪，清洗干凈，將其分為大小均勻,質量約3.5 g的肉塊,每10 g豬大腸為1組。之后按照料液比1∶10(g∶mL)放入盛有嫩化劑的燒杯中，在恒溫水浴鍋中進行浸泡處理，一定時間后將豬大腸取出。

1.4.3 制成率測定

先將豬大腸水分濾干，之后用濾紙吸干表面水分，準確稱其質量并記錄，制成率計算如公式(1)所示:

(1)

1.4.4 剪切力的測定

參照文獻[13-14]的方法，稍作修改，取適量豬大腸肉按照上述方法嫩化處理后，置于蒸煮袋中在90 ℃條件下進行恒溫水浴加熱，20 min后取出樣品。將處理好的樣品切成1 cm×1 cm×5 cm的長方體，用嫩度儀進行測試,每個樣品測3次取其平均值。

1.4.5 蒸煮損失測定

參考李明奇等[13]的方法稍做修改，將處理后的肉進行稱重，記為m1，然后置于蒸煮袋中，于90 ℃恒溫水浴鍋中蒸煮20 min后取出，用濾紙吸干表面水分并稱重，記為m2，每個樣品需平行測定3次。蒸煮損失計算如公式(2)所示：

(2)

1.4.6 感官評定

參考SALLAM[15]的方法略作修改，經過感官評定實驗培訓，選擇10名(5男5女)食品科學學院研究生組成感官評價小組，按照感官評定實驗要求，對嫩化后的豬大腸色澤、咀嚼性、氣味、硬度和風味進行感官評定，感官評分標準見表1。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards

1.4.7 響應面設計

以NaOH質量濃度、時間和溫度為自變量進行單因素試驗，感官評分為響應值，用Design-Expert 8.0.6.1進行響應面試驗設計。試驗各因素水平見表2。

表2 感官評分響應面優化的因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface optimization on sensory score

以木瓜蛋白酶質量分數、時間和溫度為自變量進行單因素試驗，以剪切力為響應值，用Design-Expert 8.0.6.1進行響應面試驗設計。試驗各因素水平見表3。

表3 剪切力響應面優化的因素水平表Table 3 Factors and levels of response surface optimization on shear force

1.5 數據處理

所有數據均采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行響應面分析, 單因素方差分析采用SPSS Statistics 19.0軟件進行處理，采用Origin 2018繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同嫩化劑對豬大腸嫩化效果對比

由圖1可知，NaHCO3、菠蘿蛋白酶對豬大腸剪切力影響比NaOH和木瓜蛋白酶小，CaCl2使豬大腸剪切力增加。NaOH、木瓜蛋白酶能夠明顯降低剪切力，其中NaOH降低豬大腸剪切力效果最好，但蒸煮損失比木瓜蛋白酶大。可能是因為豬大腸在堿液中表面膜和結締組織被部分破壞，蛋白質結構發生改變。木瓜蛋白酶水解膠原蛋白和彈性蛋白從而增加豬大腸的嫩度[8]。因此，綜合考慮選擇NaOH和木瓜蛋白酶這2種嫩化劑進行工藝優化。

圖1 不同嫩化劑對豬大腸的嫩化效果對比結果Fig.1 Comparison of tenderizing effect of different tenderizing agents on pig large intestine

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 NaOH質量濃度對豬大腸品質的影響

由圖2可知，隨著NaOH質量濃度的增加，得率呈現先上升后降低的趨勢，當NaOH質量濃度達到1 g/L時，得率達到最大，此時豬大腸吸水最多。NaOH質量濃度在0.5～2 g/L時，蒸煮損失顯著下降。當達到2 g/L時，蒸煮損失達到最小。NaOH質量濃度在0.5～1 g/L時，剪切力顯著下降，而感官評分顯著增加，達到最大值。之后隨著濃度的增加，剪切力和感官評分都有下降，但不顯著。這可能是因為適當濃度的堿液能夠使蛋白質溶解暴露親水基團，從而提高吸水性和降低剪切力。當堿的濃度過大，會破壞豬大腸結構，吸水過多，從而降低口感[16]。

a-得率和蒸煮損失；b-剪切力和感官評分圖2 NaOH質量濃度對豬大腸品質的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the quality of pig large intestine

2.2.2 NaOH處理時間對豬大腸品質的影響

由圖3可知，隨著處理時間的增加，得率和蒸煮損失都呈上升趨勢，說明處理時間對得率和蒸煮損失都存在顯著影響。剪切力和感官評分在20～25 min時分別呈顯著下降和上升的趨勢，并且感官評分在25 min時達到最大值，之后逐漸下降。說明在25 min時，豬大腸嫩度較好，感官品質最佳。當時間為35 min時，剪切力顯著下降，此時感官評分較低。說明此時豬大腸內部結構已經遭到破壞，咀嚼性差。

a-得率和蒸煮損失；b-剪切力和感官評分圖3 NaOH處理時間對豬大腸品質的影響Fig.3 Effect of NaOH treatment time on the quality of pig large intestine

2.2.3 NaOH處理溫度對豬大腸品質的影響

由圖4可知，隨著溫度的增加，得率呈現先上升后下降的趨勢，當溫度40 ℃時達到最大值，吸水最多。蒸煮損失在35～40 ℃時，顯著下降，說明此時豬大腸持水性較好。剪切力隨著溫度升高呈現一個先下降后上升的趨勢。當溫度為40 ℃時，達到最低值。感官評分隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢。當溫度達到40 ℃時，感官評分最高。說明溫度為40 ℃時，豬大腸品質最佳。

a-得率和蒸煮損失；b-剪切力和感官評分圖4 NaOH處理溫度對豬大腸品質的影響Fig.4 Effect of NaOH treatment temperature on pig large intestine quality

2.2.4 木瓜蛋白酶質量分數、處理時間和溫度對蒸煮損失和剪切力影響

由圖5-a可知，隨著木瓜蛋白酶質量分數的增加蒸煮損失和剪切力都呈現先下降后上升的趨勢。質量分數達到2%時剪切力達到最小值。木瓜蛋白酶質量分數處于2%～2.2%時蒸煮損失處于最小值且變化不大。根據前人研究，木瓜蛋白酶是一種低特異性巰基酶，它能夠將蛋白質分子內部的肽鏈—CO—NH—分解成多肽和氨基酸[17]。在適宜條件下，可以提高保水性，獲得更好的口感。當木瓜蛋白酶添加過量時，剪切力和蒸煮損失都上升。這是因為木瓜蛋白酶過量使用會導致蛋白水解過度，保水性和感官品質下降[18]。如圖5-b所示，隨著酶處理的時間增加，蒸煮損失和剪切力都呈現先下降后上升的趨勢，并且都在100 min時達到最小值。豬大腸嫩化是一定程度的水解，當木瓜蛋白酶處理時間適宜，可以有效降低豬大腸剪切力，提高嫩度。當處理時間超過100 min，豬大腸過度水解，失水老化，嫩度降低[8]。木瓜蛋白酶有最適的反應溫度，如圖5-c所示，當溫度處于25～35 ℃時，豬大腸的剪切力隨著溫度的升高而逐漸降低，木瓜蛋白酶嫩化效果十分明顯；當嫩化溫度大于35 ℃時，豬大腸的剪切力反而增加。因此，木瓜蛋白酶處理豬大腸最佳溫度為35 ℃，在此溫度條件下，豬大腸的嫩化和保水效果較好。

a-木瓜蛋白酶質量分數；b-木瓜蛋白酶處理時間；c-木瓜蛋白酶溫度圖5 木瓜蛋白酶質量分數、處理時間和溫度對蒸煮損失和剪切力影響Fig.5 Effects of papain mass fraction, treatment time and temperature on cooking loss and shear force

2.3 響應面法優化豬大腸的嫩化工藝

2.3.1 響應面分析因素和水平選擇

響應面優化豬大腸嫩化工藝試驗結果見表4和表5。

表4 感官評分Box-Behnken 試驗設計及結果Table 4 The design matrix and result of Box-Behnken experiments (sensory score)

表5 剪切力Box-Behnken 試驗設計及結果Table 5 The design matrix and result of Box-Behnken experiments (shear force)

運用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對表中的數據進行二次多元回歸擬合，得到堿處理后感官評分(Y1) 與3個嫩化因子A、B、C的關系如公式(3)所示:

Y1=7.68+0.45A-0.20B+0.25C+0.25AB-0.95AC-0.95BC-0.86A2-0.86B2-0.96C2

(3)

式中：Y1，感官評分；A，NaOH質量濃度；B，堿處理時間；C，堿處理溫度。

得到木瓜蛋白酶處理后剪切力(Y2)與3個嫩化因子A、B、C的關系如公式(4)所示：

Y2=11.74-0.13A-0.15B-0.23C+0.022AB-0.16AC-0.030BC+2.03A2+0.29B2+0.71C2

(4)

式中：Y2，剪切力；A，木瓜蛋白酶質量分數；B，時間；C，溫度。

回歸方程中每項系數絕對值的大小直接反映了各個因素對響應值的影響程度，系數的正負則反映了影響的方向。

2.3.2 多元回歸模型分析

表6 感官評分多元回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance and multiple regression model on sensory scores

表7 剪切力多元回歸模型方差分析Table 7 Analysis of variance and multiple regression model (shear force)

2.3.3 響應面模型中各因素的交互效應分析

應用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行響應面分析，各因素對響應值的影響可以用等高線和響應曲面來表示，結果如圖6與圖7所示。

圖6顯示了不同NaOH質量濃度(A)、時間(B)、溫度(C)對豬大腸感官評分的影響，響應面圖為曲面，說明3個因素之間有一定的交互作用，其中AC、BC之間存在極顯著交互作用(P<0.001)，AB之間存在高度顯著作用(P<0.01)。由圖6-a可知，當嫩化時間為24 min左右，NaOH質量濃度為1.1 g/L左右時，豬大腸的感官評分最高，兩因素對比，NaOH質量濃度對感官評分影響較大。在適宜NaOH濃度范圍內，豬大腸的脂蛋白分解率會隨著NaOH質量濃度提高而增加，擴散到豬大腸內部的水分增加，從而增加制成率、增加嫩度。但NaOH質量濃度過高，會使豬大腸吸水過多，豬大腸的內部組織結構遭到破壞，從而保水性、感官品質變差[19]。由圖6-b可知，當嫩化溫度在41 ℃左右，NaOH質量濃度為1.1 g/L左右時，豬大腸的感官評分最高，且響應曲面的等高線圖呈現橢圓形，說明二者之間有顯著交互作用。這可能是因為適當濃度的堿液和溫度能夠使蛋白質溶解暴露親水基團，提高吸水性和降低剪切力[18, 20-21]。由圖6-c可知，當嫩化溫度為41 ℃左右，嫩化時間為24 min左右時，豬大腸的感官評分最高。

a-NaOH處理時間和質量濃度；b-NaOH處理溫度和質量濃度；c-NaOH處理溫度和處理時間圖6 各因素的交互效應對感官評分的影響Fig.6 Effect of interaction of various factors on sensory score

a-木瓜蛋白酶處理時間和溫度；b-木瓜蛋白酶處理時間和酶用量；c-木瓜蛋白酶處理溫度和酶用量圖7 各因素的交互效應對剪切力的影響Fig.7 Effect of interaction of various factors on shear force

圖7顯示了不同木瓜蛋白酶質量(A)、時間(B)、溫度(C)對豬大腸感官品分的影響，響應面圖為曲面，說明3個因素之間有一定的交互作用，其中AC之間存在顯著交互作用(P<0.05)。由圖7-a可知，當嫩化時間為102 min左右，嫩化溫度為36 ℃左右時，豬大腸的剪切力最低。肌內結締組織的變化對肉的嫩度影響較大，其中肌束膜和肌內膜中的膠原蛋白起關鍵作用[22]。隨著溫度升高到適宜范圍，膠原蛋白適當變性，豬大腸的剪切力降低。由圖7-b可知，當嫩化時間為102 min左右，酶用量為2.0%左右時，豬大腸的剪切力最高，由圖7-c可知，當嫩化溫度為36 ℃左右，酶用量為2.0%左右時，豬大腸的剪切力最高。

2.4 驗證試驗結果

結合回歸模型和響應曲面圖，得到2種嫩化劑嫩化豬大腸的感官評分和剪切力最佳工藝條件是:以NaOH為嫩化劑時最佳參數組合為NaOH質量濃度為1.08 g/L，時間為24.2 min，溫度為40.63 ℃，此時豬大腸的感官評分為7.750。以木瓜蛋白酶為嫩化劑時最佳參數組合為木瓜蛋白酶質量分數為2.01%，時間為101.69 min，溫度為36.32 ℃，此時豬大腸的剪切力為11.695 N。

為進一步驗證響應面優化的準確性，根據實際操作對最優條件進行調整，在NaOH質量濃度為1.1 g/L，時間為24 min，溫度為41 ℃的條件下進行3次驗證實驗，得到嫩化后的豬大腸感官評分為7.4，與響應面優化的結果相對誤差為4.73%，響應面優化結果準確可信。在木瓜蛋白酶質量分數為2.0%，時間為102 min，溫度為36 ℃的條件下進行3次驗證實驗，得到嫩化后的豬大腸剪切力為12.36 N，與響應面優化的結果相對誤差為5.38%，響應面優化結果準確可信。

3 結論

NaOH與木瓜蛋白酶來嫩化豬大腸制品，都可以顯著增加得率，降低剪切力。以NaOH為嫩化劑時最佳參數組合為NaOH質量濃度為1.1 g/L，時間為24 min，溫度為41 ℃，此時豬大腸的感官評分為7.7。以木瓜蛋白酶為嫩化劑時最佳參數組合為木瓜蛋白酶質量分數為2.0%，時間為102 min，溫度為36 ℃，此時豬大腸的剪切力為11.70 N。說明這2種嫩化劑對豬大腸的嫩化和品質改善效果較好,有一定實用價值，可以為豬大腸的精深加工提供參考。