QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測土壤-小青菜系統中丁蟲腈及其代謝物殘留

李晶，董超，左巍，安文進，張耀海，趙其陽，焦必寧

1(西南大學柑桔研究所，重慶，400712)2(農業農村部柑桔及苗木質量監督檢驗測試中心，重慶，400712) 3(國家柑桔工程技術研究中心，重慶，400712)

小青菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinensis)是我國常見的葉菜類十字花科蔬菜，在我國的種植范圍廣，復種指數高。小菜蛾[Plutellaxylostella(L.)]是小青菜種植生長過程中危害較為嚴重的一類害蟲，嚴重影響了蔬菜的產量和品質。以丁蟲腈為代表的苯基吡唑類殺蟲劑是防治小菜蛾重要的農藥品種之一，具有活性高、持效期長等特點。丁蟲腈(丁烯氟蟲腈)由我國自主創制[1]，主要作用于昆蟲中的γ-氨基丁酸依賴性神經傳遞系統[2]。相比其同類型殺蟲劑氟蟲腈而言，丁蟲腈對蔬菜等作物的上鱗翅目、鞘翅目等害蟲表現出同等甚至更高的活性，且大幅降低非靶標生物毒性，因此被作為氟蟲腈的替代產品在我國各大蔬菜產區進行使用[3-5]。農藥在施用過程中，會通過漂移、沉降、淋溶等多種途徑進入到土壤中，進而造成土壤中農藥殘留的持續積累。研究數據表明丁蟲腈在土壤中較為穩定，丁蟲腈在江西紅壤、太湖水稻土及陜西潮土3種不同類型土壤中，室溫25 ℃條件下培養180 d后均未發生明顯降解，半衰期均大于364.8 d[6]。進入土壤中的農藥可通過直接或間接途徑被蔬菜吸收并在植株內富集、轉化，造成蔬菜中農藥殘留污染，最終影響蔬菜產品質量[7]。鑒于此，本研究以小青菜為研究對象，建立土壤-小青菜系統中丁蟲腈及多種代謝物的高效快速殘留檢測方法，對于進一步開展蔬菜對土壤中農藥的吸收、轉運和代謝研究，以及蔬菜食品全程質量控制，保障蔬菜食品安全具有重要意義。

目前，關于蔬菜和土壤中丁蟲腈殘留方法的研究主要集中在丁蟲腈母體本身。趙玉華等[8]利用QuEChERS結合氣相色譜串聯質譜(GC-MS/MS)建立了番茄，黃瓜和芹菜中丁蟲腈的分析方法；羅智強等[9]利用氣相色譜-電子捕獲檢測器(gas chromatography-electron capture detector，GC-ECD)建立了土壤中丁蟲腈的農藥殘留檢測方法；丁立平等[10]采用改進的QuEChERS-氣質聯用法(GC-MS/MS)建立了蔬菜中丁蟲腈和氟蟲腈的測定方法。然而，丁蟲腈在進入作物及環境中后，會通過多種途徑降解生成多種代謝產物，其中丁蟲腈砜、丁蟲腈硫醚、丁蟲腈酰胺及氟蟲腈等是丁蟲腈的幾種代表性代謝產物[11](圖1)，且這幾種代謝物對于某些非靶標生物具有比母體更高的生物毒性。例如，代謝物丁蟲腈砜(EC50=9.2 mg/L)和氟蟲腈(EC50=3.5 mg/L)對蛋白核小球藻的48 h急性毒性分別為母體丁蟲腈的(EC50=17.9 mg/L)的1.9倍和5.1倍；氟蟲腈(LC50=0.11 mg/L)和丁蟲腈砜(LC50=0.01 mg/L)對于大型蚤的48 h急性毒性分別為母體丁蟲腈(LC50=0.60 mg/L)的5.5倍和60倍[11]。

圖1 丁蟲腈及其代謝物的結構式Fig.1 Structural formula of flufiprole and its metabolites

目前關于同時檢測植物源樣品和環境介質中丁蟲腈及其代謝物的方法報道較少。何建等[12]利用固相萃取結合GC-ECD檢測器建立了丁蟲腈及氟蟲腈代謝物在水稻植株、稻田水及稻田土壤樣品中的檢測方法。然而該方法的目標檢測物僅包含了氟蟲腈的幾種典型代謝物MB46513，MB45950和MB46136等，而對于丁蟲腈在作物及環境中的幾種重要降解代謝產物如丁蟲腈砜，丁蟲腈硫醚和丁蟲腈酰胺等均未涉及；且上述方法前處理過程較為繁瑣，檢測耗時較長(接近20 min)。此外，蔬菜樣品基質較為復雜，含有多種干擾分析的成分(例如色素、甾醇等)，采用GC-ECD檢測，方法的選擇性和靈敏度難以滿足檢測要求。相比之下，QuEChERS前處理技術結合UPLC-MS/MS用于植物源和環境樣品中目標物的檢測可以有效提高方法前處理效率、靈敏度和特異性[13-15]。

因此，本文通過利用QuEChERS結合UPLC-MS/MS建立了同時測定小青菜和土壤中的丁蟲腈及其多種代謝產物殘留量方法，并成功應用于實際樣品的檢測，旨在為下一步開展土壤-小青菜系統中丁蟲腈的遷移、轉化、降解研究及殘留監測提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

Shimadzu LC-30AD液相色譜儀，日本島津公司；AB SCIEX QTRAP 6500串聯質譜儀，美國 AB SCIEX 公司；Sigma 3-15K臺式冷凍離心機，德國Sigma公司；CK2000高通量組織研磨儀，北京托摩根公司。

Acquity UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，簡稱T3柱，美國Waters公司；Titank F5柱色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，簡稱F5柱；ACE Excel 2 C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm，2 μm)，簡稱C18柱，廣州菲羅門公司。

丁蟲腈、丁蟲腈砜、丁蟲腈硫醚、氟蟲腈、丁蟲腈酰胺(純度>99%)，上海丁百生物科技有限公司；甲醇、乙腈(色譜純)，德國Sigma-Aldrich公司；甲酸(質譜純)，上海安譜科學儀器有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine，PSA)、石墨化炭黑(graphitized carbon black，GCB)，上海安譜科學儀器有限公司；3種不同外徑規格(<8，10～20和20～30 nm)的多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotube,MWCNTs)，中科院成都有機化學公司；超純水由Mill-Q試劑水設備(美國Millipore公司)制備；有機相濾膜(0.22 μm)，上海安譜科學儀器有限公司。

供試土壤及小青菜樣品均采自西南大學農藥殘留檢測與安全評價試驗基地，土壤經風干、磨碎、過2 mm孔徑篩后備用，其基本理化性質為:pH值6.73，有機質11.35 g/kg。供試小青菜品種為蘇州青。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器分析條件

色譜條件：采用F5柱，柱溫40 ℃，流速0.4 mL/min，進樣量1 μL。流動相為水(含體積分數0.1%甲酸)(A相)和乙腈(B相)，梯度洗脫程序：0～5 min，10% B→90% B；5～7 min，90% B；7～9 min，90% B→10% B。

質譜條件：采用電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)，掃描方式：正負離子同時掃描；多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)模式采集。碰撞氣壓力為Medium，氣簾氣為275.7 kPa，噴霧氣壓強和輔助加熱氣壓強均為344.7 kPa，離子源溫度為350 ℃，正離子模式離子化電壓為+5 500 V，負離子模式離子化電壓-4 500 V。丁蟲腈及4種代謝物的詳細質譜參數見表1所示。

表1 丁蟲腈及其代謝物的質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters for flufiprole and its metabolites

1.2.2 樣品提取與凈化

小青菜莖、葉和根：準確稱取5.00 g樣品(根樣品準確稱取2.00 g)于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈并垂直振蕩提取10 min，然后加入1 g NaCl并垂直振蕩1 min，于10 000 r/min離心5 min，取1.5 mL上清液加入含有20 mg MWCNTs(外徑為10～20 nm)的4 mL離心管中，渦旋1 min，于4 000 r/min離心3 min，取上清液過膜后上機。

土壤樣品：準確稱取5.00 g樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 mL超純水，再加入25 mL乙腈并垂直振蕩提取10 min，然后加入1 g NaCl并垂直振蕩1 min，于10 000 r/min離心5 min，取1.5 mL上清液加入含有20 mg MWCNTs(外徑為10～20 nm)的4 mL離心管中，渦旋1 min，于4 000 r/min離心3 min，取上清液過膜后上機。

1.2.3 標準溶液的配制

用乙腈分別溶解丁蟲腈，丁蟲腈砜，丁蟲腈硫醚，氟蟲腈及丁蟲腈酰胺標準品配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液，然后各吸取適量的標準溶液配制質量濃度為100 mg/L的混合標準溶液，于-20 ℃避光保存，備用。

1.2.4 標準曲線的繪制

稱取空白樣品，按1.2.2節的方法前處理后，獲得空白基質提取液，分別配制質量濃度為0.5、1、2.5、5、10、25、50和100 μg/L的基質標準工作溶液，通過UPLC-MS/MS檢測以獲得基質匹配標準曲線。

1.2.5 添加回收試驗

取空白樣品進行4個不同水平(5、50、200和1 000 μg/kg)的添加回收試驗，每個水平重復5次，于室溫下靜置0.5 h后按照1.2.2節的方法進行前處理，獲得樣品提取液。測定前，將添加水平為1 000 μg/kg的樣品提取液按V(空白基質提取液)∶V(樣品提取液)=9∶1進行稀釋，其余添加水平的樣品不再進行稀釋。計算添加回收率和相對標準偏差。

1.3 數據處理

數據采集、定量分析分別采用Analyst1.6.0和MultiQuant 3.0.2軟件，并通過Origin Pro 8軟件對試驗結果進行作圖。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

使用乙腈/水(0.1%甲酸)(4∶1,體積比)配制質量濃度為0.1 mg/L的單標溶液，采用注射泵以20 μL/min將單標溶液分別注入離子源。首先在Q1 Mass模式下進行全掃描，結果表明丁蟲腈，丁蟲腈硫醚和丁蟲腈酰胺在正離子模式下[M+H]+的響應值顯著高于負離子模式，而丁蟲腈砜和氟蟲腈2種化合物則相反，在負離子模式[M-H]-下響應值顯著高于正離子模式。然后在Product Ion模式下進行碎片離子掃描，獲得高豐度和高穩定性的子離子。最后在MRM模式下，對不同離子通道的裂解電壓(正離子模式0～300 V，負離子模式-300～0 V)和碰撞電壓(正離子模式5～180 eV，負離子模式-180～-5 eV)等參數進行優化，獲得最佳響應的離子對信息。每種目標化合物選擇2對離子對，以最高響應的子離子為定量離子，另一子離子作為定性離子。采用上述優化后的質譜方法檢測不同濃度基質標準品及實測樣品，不同離子通道的質譜圖顯示(圖2)，在上述幾種目標物出峰位置均沒有雜質峰干擾，且目標物具有較好的重現性。

2.2 液相條件優化

本文考察比較了乙腈/水和甲醇/水2種流動相組成中，在水相中加入體積分數0.1%甲酸后對于多種目標物響應值的影響，結果表明當體積分數0.1%甲酸水加入后，正離子模式下丁蟲腈、丁蟲腈酰胺和丁蟲腈硫醚的響應值顯著提升，負離子模式下的丁蟲腈砜及氟蟲腈的響應值變化不顯著，因此，0.1%甲酸水被用于水相。

選擇一種合適的固定相是實現多種目標物快速分離和檢測的關鍵。本文在乙腈/0.1%甲酸水和甲醇/0.1%甲酸水流動相體系下，進一步考察比較了3種不同的色譜柱對于5種目標化合物色譜保留和分離效果的影響。由圖2可以看出，使用F5柱在乙腈/0.1%甲酸水流動相體系條件下可實現丁蟲腈及其4種代謝物的同時基線分離，且目標物保留時間最短(<5.5 min)，分析效率最高。相比之下，在甲醇/0.1%甲酸水流動相體系下，使用3種色譜柱均難以實現丁蟲腈酰胺和丁蟲腈的色譜分離。在乙腈/0.1%甲酸水流動相體系下，使用T3柱僅能實現丁蟲腈及其代謝物的部分分離，使用C18柱難以實現丁蟲腈硫醚和丁蟲腈砜的色譜分離，且目標物的保留時間均大于5.5 min。綜合考慮分析效率及色譜分離度，最終選擇F5柱-乙腈/0.1%甲酸水流動相體系用于丁蟲腈及其代謝物的分析。

a F5柱-甲醇/0.1%甲酸水梯度洗脫；b F5柱-乙腈/0.1%甲酸水梯度洗脫；c T3柱-甲醇/0.1%甲酸水梯度洗脫；d T3柱-乙腈/0.1%甲酸水梯度洗脫；e C18柱-甲醇/0.1%甲酸水梯度洗脫；f C18柱-乙腈/0.1%甲酸水梯度洗脫；1-丁蟲腈酰胺；2-氟蟲腈；3-丁蟲腈；4-丁蟲腈硫醚；5-丁蟲腈砜圖2 流動相組成及色譜柱對丁蟲腈及其代謝物色譜分離和保留時間的影響Fig.2 Effect of mobile phase compositions and chromatographic columns on chromatographic separation and retention time of flufiprole and its metabolites

2.3 小青菜和土壤凈化劑的選擇

蔬菜和土壤成分復雜，易對后續液質檢測分析的準確性造成影響，因此對凈化劑的選擇具有更高的要求。在本實驗室前期發表的檢測方法基礎之上[16-17]，本文綜合比較了8種凈化劑對于樣品中雜質凈化效果和目標物回收率的影響。

由圖3可以看出，未凈化的土壤樣品的提取液中色素雜質含量較低，故8種凈化劑對土壤的凈化效果外觀上差異不顯著。而對于小青菜樣品，上述幾種凈化劑的凈化效果則存在顯著差異。使用不同質量(50和100 mg)的PSA凈化劑對提取液中的色素幾乎沒有去除效果，凈化效果顯著弱于其他凈化劑組合。色素雜質會導致色譜柱堵塞及儀器靈敏度降低。相比之下，含GCB組合(50 mg GCB，100 mg GCB，50 mg GCB+50 mg PSA)以及3種不同外徑的MWCNTs則表現出良好的色素去除效果。

a-空白土壤樣品基質凈化效果對比;b-空白小青菜樣品基質凈化效果對比注：1未凈化空白基質提取液；2～4分別為使用20 mg外徑為<8 nm，10～20 nm，20～30 nm的多壁碳納米管凈化的空白基質提取液；5～9分別為使用50 mg PSA，100 mg PSA，50 mg GCB，100 mg GCB，50 mg PSA+50 mg GCB凈化的空白基質提取液圖3 土壤及小青菜空白基質樣品中不同凈化劑的凈化效果比較Fig.3 Comparison of purification efficacy of different sorbents in the control samples of pakchoi and soil

值得注意的是，GCB類凈化劑在對色素雜質表現出較好的凈化效果的同時，也會對某些特殊結構的目標化合物產生一定程度的吸附，從而影響目標化合物的準確定量。鑒于此，本文進一步考察比較了8種凈化劑對丁蟲腈及其代謝物回收率的影響。土壤樣品和小青菜添加回收試驗各設置3次重復，添加濃度為0.1 mg/kg。由圖4可以看出，使用20 mg 10～20 nm MWCNTs作為凈化劑時，土壤和小青菜中丁蟲腈及其代謝物均可獲得滿意的回收率(大于83%)；使用50 mg PSA和100 mg PSA作為凈化劑時，小青菜中的丁蟲腈硫醚的回收率低于70%；使用100 mg GCB為凈化劑時，小青菜中丁蟲腈硫醚的回收率低于80%；使用50 mg GCB+50 mg PSA為凈化劑時，小青菜中丁蟲腈硫醚和丁蟲腈砜的回收率低于80%，土壤中丁蟲腈砜的回收率低于80%；使用50 mg GCB為凈化劑，目標物的回收率均大于80%，但目標物的回收率略低于20 mg外徑10～20 nm MWCNTs。綜合考慮凈化效果和回收率，最終本實驗選擇20 mg外徑10～20 nm MWCNTs作為土壤樣品和蔬菜樣品的凈化劑。

2.4 方法驗證

2.4.1 方法線性及基質效應

在0.5～100 μg/L的線性范圍內，丁蟲腈及其代謝物在小青菜(根、莖和葉)及土壤基質中的線性良好(相關系數≥0.9923)。基質效應(matrix effect,ME)是指目標物的離子化受共流出物的影響，從而導致目標物響應值增高或降低的現象，通過ME=(基質匹配標準曲線的斜率-溶劑標準曲線的斜率)/溶劑標準曲線的斜率計算[18]。ME在-20%～20%，屬于弱基質效應；ME在-50%～-20%和20%～50%，屬于中等基質效應；當ME<-50%或ME>50%時，表現為強基質效應[19]。由表2可知，丁蟲腈及其4種代謝物在小青菜莖，葉和土壤基質中ME均介于-20%～20%，屬于弱基質效應；而丁蟲腈、丁蟲腈酰胺、丁蟲腈砜和丁蟲腈硫醚在小青菜根基質中存在中等基質效應，為-37.4%～-27.9%。由于存在中等基質效應，為了保證分析結果的準確性，基質匹配標準曲線被用于上述幾種目標物的定量分析。

圖4 不同凈化劑對于土壤和小青菜中丁蟲腈及其代謝物回收率的影響Fig.4 Effects of different sorbents on the recovery of flufiprole and its metabolites in the soil and pakchoi samples

表2 丁蟲腈及其代謝物在小青菜(根、莖和葉)和土壤中的線性關系Table 2 Linear relationship of flufiprole and its metabolites in pakchoi (roots, stems and leaves) and soil samples

續表2

2.4.2 回收率和方法定量限

通過開展添加回收實驗，結果表明丁蟲腈及其代謝物的回收率為76%～107%，相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為0.8%～7.6%(表3)。以滿足農藥殘留分析添加回收率要求的最低添加濃度為方法的定量限(limit of quantification,LOQ)[17]，丁蟲腈及其4種代謝物在小青菜(根、莖、葉)及土壤中的LOQ均為5 μg/kg。

表3 丁蟲腈及其代謝物在小青菜(根、莖和葉)和土壤中的添加回收率(n=5)Table 3 Recovery of flufiprole and its metabolites in pakchoi (roots, stems and leaves) and soil samples (n=5)

2.5 實際樣品檢測

如圖5所示，丁蟲腈酰胺、丁蟲腈砜以及氟蟲腈為丁蟲腈在小青菜-土壤系統中的主要代謝產物，而丁蟲腈硫醚在實際樣品中均未檢出。在小青菜根、莖和葉樣品中均檢測出一定含量的氟蟲腈和丁蟲腈砜殘留，殘留質量分數分別為3.702，0.107，0.018 mg/kg及0.020，0.029，0.215 mg/kg。鑒于氟蟲腈和丁蟲腈砜2種代謝物具有較高的非靶標生物毒性，在丁蟲腈的使用過程中，應當注意其代謝產物殘留帶來的環境安全風險。

1 丁蟲腈酰胺；2 氟蟲腈；3 丁蟲腈；4 丁蟲腈硫醚；5 丁蟲腈砜圖5 小青菜(根、莖和葉)及土壤的實際樣品液質檢測色譜圖Fig.5 Typical UPLC-MS chromatograms of real samples of pakchoi (roots, stems and leaves) and soil

3 結論

本研究建立了小青菜和土壤中丁蟲腈及其多種代謝物(丁蟲腈砜、丁蟲腈硫醚、丁蟲腈酰胺及氟蟲腈)殘留的UPLC-MS/MS檢測方法。供試樣品經乙腈快速提取，MWNTs凈化，UPLC-MS/MS檢測，基質匹配標準曲線法定量。該方法操作簡單、快速準確、靈敏度高、重現性良好，檢測成本低。該方法LOQ為5 μg/kg，滿足不同生長階段小青菜樣品中目標農藥及代謝物殘留檢測的要求。實際樣品檢測結果表明，該方法具有較好的適用性，可用于土壤和小青菜中丁蟲腈及其多種代謝產物的快速篩查及準確定量分析，同時為下一步開展土壤-小青菜系統中丁蟲腈的遷移、轉化、降解研究及殘留監測提供參考。