益生菌對宿主腸道屏障功能的影響

王超越，韓瑨，吳正鈞*，郭誠笑，唐月方

1(光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海乳業生物工程技術研究中心，乳業生物技術國家重點實驗室，上海，200436) 2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

消化道是微生物和宿主免疫系統相互作用的主要場所，在抵御病原體的同時允許固有微生物生存。腸黏膜具有約300 m2的表面積，是人體與外界環境接觸面積最大的結構。腸黏膜屏障的完整性是維持消化道穩態的關鍵，完整的腸黏膜屏障能夠保護機體免受腸道細菌、內毒素及抗原的侵害，保證機體健康。腸道通透性增高(通常稱為“腸漏”)，會造成腸腔內容物移位，進入機體循環，促使機體釋放大量炎性細胞因子，誘發異常的黏膜免疫反應[1]。腸道屏障損傷與多種疾病有關，包括胃腸疾病,如乳糜瀉 (celiac disease, CeD)、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)、結直腸癌(colorectal cancer, CRC)等和腸外疾病(如慢性肝病、Ⅰ型糖尿病、肥胖)[2]。因此，維持腸黏膜屏障功能的完整性將為臨床疾病的干預提供新思路。

益生菌被定義為：當使用一定量后，對宿主健康產生有益作用的活的微生物。益生菌可作用的部位包括腸道、上呼吸道、泌尿生殖道和皮膚。在食品中常用的益生菌包括雙歧桿菌、乳桿菌(如嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌)以及部分酵母菌[如布拉氏酵母菌(Saccharomycesboulardii)]等。在人體中，益生菌可通過調節宿主腸道微生態發揮改善精神健康、降低膽固醇、改善胰島素敏感性、調節免疫、預防過敏等作用[3-5]。作為一類具有良好應用潛力的生物治療劑，益生菌通過對腸道屏障的調節作用，極大地影響著宿主的健康狀態及疾病的發生和發展，其作用機制也不斷被揭示。

1 腸道屏障

腸道屏障是一個由機械、化學、免疫和菌群屏障組成的動態系統(圖1)。4個屏障共同作用，維持消化道功能的穩態，保護機體免受腸道致病菌、內毒素及抗原的侵害，從而維持機體健康。

1.1 機械屏障

機械屏障主要由定殖在隱窩底部的腸道干細胞分化而成的各種腸上皮細胞及細胞間連接復合體構成。

相鄰腸上皮細胞間隙由緊密連接(tight junction, TJ)、黏附連接、橋粒和縫隙連接等4種連接復合體進行封閉，形成緊密的具有動態通透性屏障功能的柱狀細胞單層，阻止腸腔中微生物細胞、菌體碎片及內毒素等有害物質透過腸道黏膜進入血液循環，同時允許營養物質和水進入體內，是抵抗感染和炎癥的主要防御機制。

圖1 腸道屏障組成示意圖[6]Fig.1 Schematic diagram of intestinal barrier composition[6]

腸道機械屏障還包括腸蠕動功能，進入腸道的食物隨著腸道節律性蠕動進行下移，將腸細胞表面一些致病性細菌一起帶走，減少了有毒有害細菌在腸黏膜表面的停留時間，防止細菌易位引起的炎癥性疾病。

1.2 化學屏障

化學屏障包括消化液、溶菌酶、黏多糖、其他化學物質和腸道分泌的抗菌物質[7]。消化道黏液主要由杯狀細胞分泌到管腔中的高度糖基化的黏蛋白組成，還包括碳水化合物、脂類和水。消化道黏液保護上皮細胞的方式有以下幾點：形成將上皮細胞和腸腔環境隔開的水溶性黏液層；黏液中的碳水化合物和細菌進行黏附，阻止細菌與上皮細胞接觸；黏液中存在補體成分、防御素和乳鐵蛋白等能夠直接殺傷微生物的活性成分；黏液在隨管壁平滑肌運動而排出體外時將細菌等有害物質一起排出。另外，腸道中還存在各種具有殺菌和溶菌作用的蛋白、溶菌酶、膽汁等成分。

1.3 菌群屏障

正常情況下，腸道內的益生菌和致病菌相互依賴相互制約達到一種平衡狀態，構成腸黏膜的菌群屏障。腸道中比例最高的專性厭氧菌通過以下幾點保護腸道健康：附著在腸道黏膜表面, 通過定殖拮抗作用抑制病原菌的黏附，具有抗菌和調節腸道免疫反應的作用；分泌乳酸和短鏈脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)等次級代謝物，降低機體腸道pH和氧化還原電位，阻止不耐酸的腐敗菌和致病菌的生長；分泌細菌素抑制腸道兼性厭氧菌和外來菌的定殖和生長；作為腸道中優勢菌群與致病菌爭奪養料，抑制致病菌的生長。

1.4 免疫屏障

免疫系統由免疫器官、免疫細胞、可溶性細胞因子和細胞受體調節。黏膜上皮內淋巴細胞CD8+具有細胞毒性作用，被病原體激活后可釋放穿孔素、端粒酶和絲氨酸醋酶等細胞因子，從而殺傷腸道中的病原菌，防止病原菌的入侵。另外，吞噬細胞一方面通過吞噬作用抵抗并消除一部分病原體，另一方面將病原微生物的信息傳遞給B淋巴細胞，B淋巴細胞進行增殖并轉化為漿細胞，進而產生分泌型免疫球蛋白A (secretory immunoglobulin A, sIgA)，sIgA又通過使病原微生物發生凝集或與病原微生物結合阻斷其表面的特異性結合位點，使其喪失黏附功能。共生微生物群啟動腸道先天性免疫和適應性免疫，可協調保護宿主免受外來病原體入侵，同時維持腸道內環境穩定[8-9]。

2 益生菌對腸道屏障功能的調節作用

2.1 促進上皮細胞增殖分化

動物出生后，隱窩中的干細胞隨著微生物的定殖逐漸成熟，分化為各種具有特殊功能的腸上皮細胞。腸上皮細胞通過增殖、分化和凋亡不斷地進行著更替，維持上皮的穩態和再生。其中，潘氏細胞每18～23 d更新一次，其他腸上皮細胞每3～5 d更新一次。研究發現，羅伊氏乳桿菌D8的代謝物吲哚-3-甲醛通過芳香烴受體刺激固有層淋巴細胞分泌白細胞介素22，誘導STAT3磷酸化，從而加速腸上皮細胞的增殖[10]。另一項研究表明，羅伊氏乳桿菌能夠通過增加 R-spondins 的表達從而激活Wnt/β-catenin通路達到刺激腸上皮細胞增殖的目的[11]。

2.2 降低腸道屏障的通透性

在正常狀態下，腸道屏障的透過性具有選擇性，允許必需營養素和水通過，限制毒素和病原體的透過。當腸道屏障功能受損，出現通透性增加時，腸腔內有害細菌的細胞成分及其代謝產物進入宿主循環系統后，可通過刺激宿主過度的炎癥反應導致消化道和自身免疫性疾病。除了促進上皮細胞增殖分化外，益生菌還可以通過上調宿主腸上皮細胞對TJ蛋白的表達，從而有效維持黏膜完整性。YI等[12]將斷奶仔豬分為對照組、正常飲食加羅伊氏乳桿菌LR1和抗生素處理3個組。結果發現，與抗生素組和對照組相比，益生菌組仔豬腸上皮絨毛高度與隱窩深度的比值升高，空腸和回腸黏膜TJ蛋白表達升高。在另一項研究中，給腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導屏障功能損傷的小鼠灌胃羅伊氏乳桿菌ZJ617和鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG, LGG)，發現ZJ617和LGG均能顯著逆轉LPS誘導的occludin和claudin-3表達下降[13]。從動物實驗中觀察到的益生菌維持屏障完整性的結果，為進行臨床研究提供了可能性[14-15]。

2.3 促進黏蛋白基因的表達和分泌

黏液層的厚度通常可達到50～800 μm, 在健康個體中，貼近上皮層30 μm厚度區域內的黏液幾乎不存在細菌。黏液是腸腔內細菌遇到的第一道屏障，病原菌需要穿透黏液層才有可能引發感染。致病菌降解黏液層的方式多種多樣，包括減少黏蛋白的二硫鍵數量、分泌蛋白酶、分泌糖苷鍵水解酶(口腔及部分腸道菌群)等。黏液中發揮阻斷腸腔內容物與腸上皮層接觸作用的主要是黏蛋白。黏蛋白是一類大分子、高度糖基化的蛋白(碳水化合物含量超過80%)，糖基部分將蛋白部分包裹在內部，防止其被機體分泌的蛋白酶水解。在小腸中，黏蛋白主要為MUC2。

研究發現，鼠李糖乳桿菌CNCM I-3690能通過增加杯狀細胞的數量和促進黏蛋白的表達來改善結腸屏障功能[16]。副干酪乳桿菌CBAL74發酵的脫脂乳在85 ℃下加熱20 s滅活后進行噴霧干燥，得到僅含有滅活菌體的發酵產物FM-CBAL74，FM-CBAL74能以劑量依賴的方式顯著地誘導Caco-2細胞的生長和分化，上調TJ蛋白和MUC2基因的表達，但研究者未明確是FM-CBAL74中的何種成分產生的作用[17]。另一項研究也表明，受沙門氏菌感染的小鼠在食用植物乳桿菌MTCC 5690發酵乳后，MUC2的表達有所增加，腸屏障功能得到改善[18]。除了食用單獨的益生菌或益生菌發酵乳外，連續7天口服VSL#3益生菌混合物可通過上調腸上皮細胞中MUC2、MUC3和MUC5AC基因的表達，使大鼠基底管腔黏蛋白含量增加60%[19]。

2.4 競爭黏膜定殖位點，形成菌膜屏障

細菌表面的結構決定其在宿主腸道內的定殖能力。益生菌通過細胞表層蛋白(surface layer proteins, SLPs)和菌毛等黏附在腸道黏液上，通過抑制和排斥作用減少細菌性腸道病原體的定殖，在維持腸道內穩態和促進腸道健康方面發揮作用[20]。SLPs是覆蓋在乳桿菌菌體表面的一類呈規則晶格狀排列的蛋白，由蛋白質或糖蛋白亞基組成。研究發現，與僅用大腸桿菌O157:H7感染的HEp-2上皮細胞相比，使用從瑞士乳桿菌R0052分離的SLPs提取物預處理HEp-2上皮細胞可導致大腸桿菌O157:H7的黏附減少[21]。KIM等[22]從短乳桿菌FSB-1的SLPs中分離出凝集素，該凝集素能識別大鼠結腸黏蛋白的末端糖鏈并與之結合，從而減少致病菌的黏附。

2.5 調節腸道菌群組成

人類胃腸道擁有一個復雜而動態的微生物生態系統，由數萬億微生物組成。隨著對腸道菌群組成和功能的不斷認識，其對腸道健康的重要性越來越受到關注。研究發現，腸道菌群及其代謝產物能夠調節先天性和適應性免疫細胞的發育、穩態和功能，抑制有害菌的生長，維持腸道上皮組織的完整性[23]。由于腸道菌群可以吸收宿主自身難以消化吸收的成分及分泌到腸腔中的物質，所以腸道菌群的組成會隨著機體攝入的食物成分的改變而改變。不當的飲食會造成腸道菌群失調進而誘發多種腸道疾病。攝入添加益生菌的食品可調節腸道菌群組成，從而達到預防甚至是治療相關疾病的目的。相關研究發現，在乙二醇攝入前補充植物乳桿菌N-1可以預防乙二醇誘導的大鼠腸道菌群失調和腸道屏障損傷[24]。另一項研究發現，瘤胃乳桿菌FXJWS27L3和FXJSW17L1處理能顯著增加小鼠腸道菌群多樣性，平衡腸道菌群的組成和分布，緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎[25]。

2.6 調節腸道黏膜免疫反應

益生菌通過細菌-上皮-免疫細胞之間的互作加強先天和適應性免疫反應。腸上皮細胞和黏膜免疫細胞表面的Toll樣受體(toll like receptors, TLRs)和NOD樣受體可以特異性識別病原體相關分子模式，迅速感應菌群變化，激活核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路，啟動宿主免疫防御反應。在正常生理條件下，腸黏膜免疫系統對固有菌處于免疫耐受狀態，維持腸道微生態平衡。

腸黏膜上散布著一種叫派伊爾結的圓頂狀結構，其中富含大量的免疫細胞，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。派伊爾結是與消化道相關淋巴組織調節腸道對病原體免疫反應的關鍵。在一項研究中，大劑量卡那霉素擾亂小鼠腸道菌群后，小鼠血清免疫球蛋白E(immunoglobin E, IgE)水平升高，血清IgA和糞便IgA水平降低，派伊爾結細胞數量減少；而乳酸菌有效地降低卡那霉素處理后小鼠血清IgE水平，恢復血清IgA和糞便IgA水平，增加派伊爾結細胞的數量，上調了回腸組織中ZO-1和occludin的mRNA水平。表明乳酸菌可以通過改善腸道屏障的完整性和增加派伊爾結中IgA的產生來增強腸道免疫功能，調節由抗生素引發的腸屏障功能損傷[26]。

3 益生菌在腸道疾病中的應用

3.1 炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)

IBD是一種慢性炎癥引起的消化道疾病，包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)和未確定型結腸炎(indeterminate colitis, IC)，可根據炎癥的位置進行區分[27]。盡管IBD的確切病因尚不清楚，通常認為是遺傳易感個體對固有微生物群出現炎性反應的結果，飲食和壓力被認為是IBD的潛在誘因。此外，腸道菌群組成異常引發的腸道炎性反應，造成黏膜屏障損傷，增加腸腔內容物和細菌易位，可能引發宿主持續的炎性反應。研究發現，IBD患者的腸道微生物群與健康人不同。在IBD患者中，梭狀芽胞桿菌科或黏附侵襲性大腸桿菌菌株比普通人群中更常見[28-29]。

在過去幾十年里，益生菌在調節菌群組成及其在治療IBD中的效果引起了廣泛的關注。益生菌可通過降低腸腔pH值、競爭營養物質、分泌和誘導宿主產生抗菌化合物(細菌素和防御素)、阻止細菌黏附于上皮細胞等途徑防止病原菌的過度生長。此外，益生菌還可以通過免疫調節作用，如降低NF-κB的活化、促進樹突細胞的成熟、刺激細胞因子(interleukin-10, IL-10)的合成、增強自然殺傷細胞(natural killer, NK)的殺傷活性、促進派伊爾氏淋巴集結中抗原呈遞細胞的活化改善IBD。

盡管有證據表明益生菌對潰瘍性結腸炎具有免疫調節作用，但大多數研究沒有證明益生菌補充劑對CD的治療作用。

3.2 結直腸癌(colorectal cancer, CRC)

Cancer Today (WHO) 目前的統計數據顯示，CRC是全球第三大確診癌癥類型，2020年新發病例為1 931 590例(占癌癥總病例的10%)，死亡病例為935 173例(占癌癥總死亡率的9.4%)。CRC的發病率在歐洲、北美和澳大利亞高于亞洲國家。病因學表明，遺傳因素和環境因素共同導致CRC的發生。

益生菌可以通過一系列機制預防CRC的發生[30]。大多數情況下，這些機制組成性地發揮作用，對腸道菌群組成產生積極影響，并防止結腸和直腸受到經常誘發癌變的環境應激因素的影響。主要作用機制如下：

(1)調節腸道菌群的組成，減少致癌物的產生。腸道菌群產生的代謝酶通常將不同的前體化合物轉化為致癌化合物。結腸和直腸的細胞經常暴露在不同的致癌化合物中。調節腸道菌群的酶表達，可以間接控制致癌化合物的產生。研究表明，經常食用益生菌可以改善腸道菌群的種類和豐度，從而減少腸道內致癌化合物的產生和慢性炎癥的發生[31]。另外，細菌細胞壁肽聚糖可通過與致癌物物理結合或降低化合物的活性來直接滅活致癌化合物[32]。

(2)調節免疫系統。腸道菌群和腸道免疫系統的互作在維持體內平衡中起著重要的作用。上皮細胞中TLRs通過識別不同的微生物相關分子模式啟動一系列免疫反應，失調的腸道微生態系統導致MAPK途徑激活和NF-κB易位，從而刺激不同的促炎細胞因子如IL-8和NO的分泌，最終導致IBD和CRC的發生。益生菌通過調節抗炎細胞因子(IL-10和TGF-β2)和促炎細胞因子的產生影響機體的免疫應答。某些益生菌還可以激活吞噬細胞，使免疫反應處于一種警戒狀態，在癌細胞的早期發展階段將其清除。

(3)增強腸上皮屏障。TJ蛋白復合物的破壞或細胞旁通透性的增大通常會導致IBD的發生，并常伴有IBD相關的CRC[33]。益生菌能分泌SCFA，這些SCFA在改善腸道屏障功能方面顯示出積極的效果。研究發現，SCFA如丁酸鹽、丙酸鹽和乙酸鹽對乙醇誘導的屏障功能損傷具有保護作用[34]。乙醇處理會破壞腸上皮細胞間TJs和上皮細胞骨架并引起代謝應激的增加，而SCFAs通過激活Caco-2細胞中腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK]信號通路能夠減輕代謝應激并修復TJs[35]。

(4)誘導癌細胞凋亡。益生菌促進癌細胞凋亡的作用在許多體外實驗中得到了證實，通常伴有凋亡相關蛋白的表達，如死亡配體受體、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax/Bak、Bcl-2和Bcl-x蛋白[36]。RABIEI等[37]研究發現，干酪乳桿菌UT1的發酵上清液以時間和劑量依賴的方式促進人結腸癌細胞HCT116的凋亡。另一項研究發現，植物乳桿菌-12產生的粗胞外多糖通過增加HT-29細胞中凋亡蛋白如Bax、細胞色素C、caspase-3、caspase-8和caspase-9酶的表達，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，誘導HT-29細胞凋亡[38]。

3.3 乳糜瀉(celiac disease, CeD)

乳糜瀉，又稱麥膠性腸病，是一種多因素慢性炎癥性小腸疾病，CeD的發生與遺傳因素(HLA-DQ2和HLA-DQ8)、自身抗原(組織轉谷氨酰胺酶2)和環境因素(麩質蛋白)有關。HLA-DQ2/8是一種常見的基因型，約30%～40%的人群中存在這種基因，但只有2%～5%的攜帶者會發展成CeD。麩質蛋白是CeD的主要環境誘因，但麩質蛋白的攝入并不能完全解釋這種疾病的發生，一些人在接觸麩質蛋白多年后才患上這種疾病，這表明還有其他因素在CeD的發生中起作用[39-40]。越來越多的證據表明，腸道菌群與消化道疾病密切相關[41]。腸道菌群的變化可能改變腸腔內麩質蛋白的代謝、腸道通透性和宿主免疫系統，并可能導致麩質蛋白敏感性腸病[42]。目前治療CeD的主要方法是堅持嚴格的無麩質飲食(gluten free diet, GFD)，雖然GFD可以減輕大多數患者的CeD癥狀，但并不能將患者的腸道菌群完全恢復到健康個體狀態[43-44]。

益生菌可能通過以下3種機制影響CeD：

(1)通過產生能有效切割麩質蛋白肽中蛋白水解抗性序列的酶來降低麩質蛋白的免疫原性，消除或減少CeD的誘因，從而防止其發作。CAMINERO等[45]利用小鼠實驗研究了麩質蛋白在條件致病菌(銅綠假單胞菌)和十二指腸共生細菌(乳酸菌)作用下的代謝情況，并對代謝產生的肽激活麩質蛋白特異性T細胞的能力進行了考察。結果發現，從CeD患者十二指腸分離的銅綠假單胞菌可通過其彈性蛋白酶活性將麩質蛋白降解為免疫原性肽，激活CeD患者的麩質蛋白特異性T細胞，而來自健康受試者的乳桿菌可通過產生蛋白酶將這些免疫原性肽繼續降解為非免疫原性肽，從而降低CeD的發病率。

(2)降低腸屏障的通透性，防止免疫原性多肽進入固有層引發CeD。醇溶蛋白可引起zonulin的釋放，導致腸上皮細胞骨架重排，降低occludin和ZO-1蛋白之間的相互作用，增加腸道通透性，使腸腔中的抗原轉移到黏膜下層，從而引發CeD[46]。因益生菌具有增強腸道屏障，降低腸道屏障通透性的作用，這種情況可通過益生菌給藥來預防。

(3)通過調節腸道菌群平衡以及宿主免疫反應減少CeD的發生。研究發現，CeD患者的糞便樣品(代表失衡的腸道菌群)能顯著增加外周血單核細胞中TNF-α的產生和CD86的表達，同時降低IL-10的產生和CD4的表達，而長雙歧桿菌ES1和雙歧桿菌ES2處理的外周血單核細胞與CeD患者的糞便樣品共孵育可使促炎細胞因子的產生減少，IL-10的產生增加[47]。

4 小結與展望

腸道屏障功能對腸道健康至關重要，屏障功能受損會引發多種腸道疾病。益生菌可通過促進上皮細胞增殖分化、降低腸道上皮細胞通透性、促進黏蛋白的表達和分泌、競爭黏膜黏附位點、調節腸道菌群組成及調節免疫反應等途徑改善腸道屏障功能，維持機體健康。益生菌作為生物治療劑具有安全、高效的特點，不僅可避免由抗生素的大量使用產生的細菌耐藥性，還可調節腸道菌群和增強機體免疫力。

值得注意的是，益生菌對腸道屏障的調節作用具有菌株特異性和宿主特異性。不同菌株對同一宿主可能產生不同的影響，同一菌株對不同宿主產生的效果也會受到宿主的生理、免疫、飲食、藥物使用等因素的干擾。研究發現，乳酸菌在體外對HT-29細胞TJ蛋白的調節作用表現出顯著的種間和種內差異，另外，這些菌株在緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎癥狀(包括疾病活動指數、組織損傷和炎癥)方面也表現出不同的效果，并且這種緩解效果與其修復TJ蛋白的能力高度相關[48-49]。因此，需要對特定菌株進行更全面的研究，進一步明確相關菌株改善腸屏障功能的具體作用機制及主要的生物效應物質，為菌株的應用提供強有力的科學依據。

然而，活益生菌在給宿主腸道健康帶來有益影響的同時，也會給免疫功能低下的人群帶來一些潛在的副作用，如腹脹、腹瀉、過度免疫刺激、全身感染、敗血癥和抗生素耐藥基因的轉移等。為了避免這些風險，人們越來越關注滅活益生菌或益生菌發酵代謝產物。經熱處理的益生菌細胞、無細胞上清液和純化的生物活性成分具有與活益生菌相似的效應，并且在安全性、儲存、運輸方面更具有優勢。因此，將其作為活益生菌的替代制劑，通過改善腸道屏障完整性來預防和治療各種胃腸道疾病可能是一種更有效的策略。