白樺Trihelix家族全基因組鑒定及抗病表達模式分析

寧小萌，孫晶晶，馮思雨，李天驕，任占辰，李然紅

(牡丹江師范學院 生命科學與技術學院，黑龍江牡丹江 157012)

白樺(Betulaplatyphylla)為樺木屬落葉喬木，也被稱為亞洲白樺、西伯利亞白樺，主要分布于中國東北地區，是一種具有重要應用價值的樹種[1]。白樺在生長發育過程中常遭受到許多病原菌的侵害，如立枯病、葉枯病、根腐病等。立枯病嚴重危害處于生長期的幼苗，致死率達到30%～60%[2]；葉枯病是一種葉部病害，能使葉片產生大量壞死性病斑，導致葉片枯萎甚至提前脫落，致使大量苗木死亡[3]；根腐病主要危害植株根部，使植株底部葉片發黃脫落，植株產生矮化現象，最后整株葉片死亡[4]。化學農藥是防治白樺病害的有效措施，但副作用也尤為明顯，會對生態環境造成不可逆轉的破壞。白樺抗病品種的培育，可減少白樺病害的發生，并可避免農藥使用的不良影響，因而成為重要的研究課題。

轉錄因子是某些能和基因的特定序列專一結合從而保證目的基因能夠以特定的強度在特定的時間和空間表達的蛋白質分子，也被稱為反式作用因子，在植物的生長發育及對外界環境的反應中發揮著重要作用[5-6]。Trihelix家族是植物特有的轉錄因子家族[7]，其特點是在DNA結合域中含有一個典型的螺旋-環-螺旋-環-螺旋的三螺旋結構[8]，該結構域可以特異地與DNA序列中的光響應所需的GT元件結合，所以該家族也被稱為GT家族[9]。在早期研究中，Trihelix家族功能主要與光反應調節有關[10]，近些年，Trihelix家族的其他生物學功能逐漸被發現，它們能夠調控一系列植物器官如胚胎、氣孔、種子及花的發育過程[11-15]，更重要的是它們能對植物中不同的非生物及生物脅迫做出反應，如OsGTγ1可以被鹽脅迫強烈誘導，過表達該基因的水稻(Oryzasativa)耐鹽性有所增強[16]。大豆(Glycinemax)GmGT2A和GmGT2B在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中過表達，轉基因擬南芥對鹽、冷凍和干旱脅迫的抗性提高，且GmGT2B會賦予轉基因植株對ABA的耐受性[17]。在大豆受到丁香假單胞菌番茄致病變種 DC3000(Pseudomonassringaepv.tomato)的侵染30 min內，SCaM-4的轉錄被迅速誘導，經驗證發現GT-1順式作用元件是該基因的核心順式作用元件，GT-1-like轉錄因子——AtGT-3b也能與該順式作用元件結合，并在NaCl和病原菌處理30 min內也被迅速誘導[18]，說明AtGT-3b在大豆抗DC3000的侵染反應中起作用。毛果楊(Populustrichocarpa)受到鏈格孢霉菌(Alternariaalternata)侵染后，除了3個Trihelix家族成員表達量下調，其他成員表達量均上調，且將PtrGT10在秋子梨(Pyrusussuriensis)中抑制表達后，活性氧和MDA的含量均下降，細胞死亡率有所降低[19]。有關Trihelix家族功能的研究主要集中在光反應、對植物生長發育的調控及抵抗各種非生物脅迫上，在抗病反應中的研究鮮見報道。本研究采用生物信息學方法，對白樺Tihelix家族成員進行鑒定比較，并分析白樺Trihelix家族成員組織表達特異性及病原菌脅迫響應情況，為進一步了解Trihelix家族成員的結構與功能提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料和處理

(1)供試植物及病原真菌：用于鏈格孢霉菌侵染的白樺植株為40～50 cm的白樺幼苗，用于立枯絲核菌侵染的植株為無菌土培苗，高度為6～8 cm。供試植株均為組織培養所得無性系。培養條件為28 ℃、光照/黑暗為16 h/8 h，光照強度1 500 Lx。致病菌鏈格孢霉菌(Alternariaalternata)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)為本實驗室保存。

(2)培養基：使用馬鈴薯葡萄糖培養基(potato dextrose agar，PDA)培養兩種病原菌，培養基成分為馬鈴薯300 g/L+葡萄糖20 g/L+瓊脂20 g/L。白樺擴繁培養基：WPM 2.14 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖20 g/L+Ca(NO3)20.56 g/L+6 BA 1.5 mg/L+NaOH 1 mL/L；生根培養基：WPM 2.14 g/L+瓊脂7 g/L+蔗糖20 g/L+Ca(NO3)20.56 g/L+NAA 0.2 mg/L+NaOH 1mL/L；無菌土培苗的培養：草炭土和蛭石比例為1∶1，將二者混勻后加入蒸餾水至潮濕狀態。

(3)病原菌侵染：將鏈格孢霉菌(Alternariaalternata)菌株接種于PDA斜面上擴大培養，于25 ℃培養箱中培養6～7 d，在長滿菌絲的斜面中加入無菌水后震蕩，再用雙層紗布過濾掉菌絲，收集孢子懸浮液，無菌水沖洗濾渣2～3次，將濾液定容至10 mL。用血球計數板計數，孢子懸浮液稀釋濃度至105個/mL。采用噴霧法將孢子懸浮液均勻噴到植株葉片上，將植株置于透明的塑料箱中密閉保濕24 h，然后轉移至光照培養箱中，28℃、光照/黑暗16 h/8 h、光照強度1 500 Lx條件下培養，每天觀察植株染病情況；將立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)接種于PDA平板上，置于25 ℃培養箱中培養6～7 d，待菌絲長滿整個培養皿，用無菌刀片刮取0.05 g菌絲，加入20 mL無菌水配制成菌懸液，采用注射法，將菌懸液注射到白樺幼苗根部。分別在侵染6、12、24和48 h，以及3、5、7 d后，取鏈格孢霉菌侵染的植株葉片以及立枯絲核菌侵染的整個植株作為樣品，液氮速凍后于-80 ℃中保存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 白樺Trihelix家族成員的鑒定利用COGE數據庫(https://genomevolution.org/coge/)篩選白樺基因組序列中Trihelix基因序列，篩選掉序列中的重復序列，并在NCBI中進行同源比對及保守結構域分析，保留含有Trihelix結構域的序列，確定為白樺Trihelix家族成員。

1.2.2 白樺Trihelix家族生物信息學分析利用Phytozome v12.1數據庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)查詢毛果楊和擬南芥Trihelix家族蛋白序列；利用Clustal X軟件進行基因家族氨基酸序列的多序列比對，利用MEGA7.0軟件并采用鄰接法構建進化樹；從COGE數據庫中獲得白樺每個Trihelix家族成員啟動子上游1 500 bp的基因序列，并用Plant CARE(http:// bioinformatics.psb.ugent.bewebtoolsplantcarehtml)預測其順式作用元件。使用Origin8.5制作折線圖。其他分析網站及軟件見表1。

表1 生物信息學分析的軟件及網址Table 1 Software and website for bioinformatic analysis

1.2.3 RNA提取及反轉錄使用植物總RNA提取試劑盒(BioTeke, 無錫)提取白樺根、莖、葉部位的總RNA及兩種病菌侵染后各時間段樣品的總RNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取質量，超微量分光光度計測量RNA濃度。以1 μg的RNA為模板，利用反轉錄酶(Vazyme, 南京)將其反轉錄合成為cDNA。

1.2.4 熒光定量PCR以白樺持家基因18S rRNA、肌動蛋白基因Actin和泛素基因Ubiquitin為內參基因，以莖中BpTrihelix1基因為對照，計算根和葉片中各基因的相對表達量；以未感病時葉片中BpTrihelix1基因為對照，計算鏈格孢霉感染后各基因的相對表達量；以未感病時整株的BpTrihelix1基因為對照，計算立枯絲核菌感染后各基因的相對表達量；使用引物序列見表2。反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 15 s，58 ℃ 45 s，共45個循環。每個處理進行3次生物學重復，以2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

表2 熒光定量所用的基因引物序列Table 2 Primer sequences of the genes used for quantitative real-time PCR

2 結果與分析

2.1 白樺Trihelix家族成員蛋白理化性質分析

經過篩選重復序列、保守結構域鑒定以及同源性比對，最終獲得了8個Trihelix家族成員(表3)。根據其在染色體上的位置，將其命名為BpTrihelix1-BpTrihelix8(圖1)。在8個家族成員中，長度最長的序列為BpTrihelix5 (8 934 bp)，長度最短的為BpTrihelix8(2 049 bp)；氨基酸的數量在307～591 aa之間(表3)；氨基酸分子量在35 633.96～81 871.27 Da之間；等電點在5.32～8.67之間，且均為疏水性氨基酸；亞細胞定位結果表明，所有家族成員均定位在細胞核中。

表3 白樺Trihelix家族成員基本信息Table 3 Basic information of Trihelix family members in birch

2.2 白樺Trihelix家族蛋白的系統進化分析

系統進化分析顯示(圖2)，8條白樺Trihelix家族氨基酸序列被分為4個分支，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。其中Ⅲ中包含白樺Trihelix蛋白序列最多，含有3條；Ⅰ和Ⅱ均含有2條白樺Trihelix蛋白序列；Ⅳ中包含1條白樺Trihelix蛋白序列，數量最少。

2.3 白樺Trihelix基因結構分析及蛋白結構分析

基因結構如圖3所示，白樺Trihelix家族成員含有2～5個外顯子，其中，BpTrihelix1含有的外顯子數量最多為5個，BpTrihelix5和BpTrihelix7均含有3個外顯子，BpTrihelix2、BpTrihelix3、BpTrihelix4、BpTrihelix6和BpTrihelix8均含有2個外顯子。利用DNAMAN軟件對白樺Trihelix家族成員的氨基酸序列進行多序列比對(圖4)，結果表明Trihelix家族成員都具有螺旋-環-螺旋-環-螺旋這一特殊構象。利用MEME網站對白樺Trihelix家族成員蛋白序列進行Motif搜索，設置搜索數量為10個，結果如圖5所示，所有家族成員均含有數量不等的保守基序，且所有家族成員均含有Motif 1基序。不同亞家族間保守基序也有差異，如Motif 10僅存在于第Ⅱ亞家族中，Motif 9僅存在于第Ⅲ亞家族中。

2.4 白樺Trihelix家族啟動子區順式作用元件預測

將白樺Trihelix家族各成員上游1 500 bp的序列確定為啟動子序列，利用PLANT Care進行順式作用元件預測，結果如表4所示。白樺Trihelix家族含有種類較為豐富的順式作用元件，除了一些真核啟動子的必需元件，如CAAT-box、TATA-box外，還有一些與植物脅迫、生長發育、激素響應及光應答相關的元件。其中BpTrihelix2、BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7含有脅迫相關元件的數量和種類較多，推測它們可能在不同的脅迫下起關鍵作用；BpTrihelix4、BpTrihelix5和BpTrihelix6含有激素響應相關元件種類較多，推測它們能夠對不同種類激素有響應；BpTrihelix4含有的光響應元件種類最多，推測BpTrihelix4可能對光響應過程起調控作用。

表4 白樺Trihelix家族啟動子區順式作用元件預測Table 4 Prediction of cis-acting elements of Trihelix family promoters in birch

2.5 白樺Trihelix家族成員組織表達分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，RNA提取無降解(圖6)，且OD260/280在1.7～2.0之間，符合實驗要求。根據相對定量的結果,用Clustvis制作熱圖(圖7)，結果表明，所有基因在不同組織中均有表達，其中的BpTrihelix3在葉片中表達量最高，隨后依次是BpTrihelix4、BpTrihelix7、BpTrihelix1、BpTrihelix5、BpTrihelix8、BpTrihelix6，BpTrihelix2的表達量最低；BpTrihelix3在莖中表達量最高，然后是BpTrihelix7、BpTrihelix1、BpTrihelix4、BpTrihelix5、BpTrihelix8、BpTrihelix2，BpTrihelix6的表達量最低；BpTrihelix3在根中表達量最高，然后是BpTrihelix1、BpTrihelix7、BpTrihelix5、BpTrihelix4、BpTrihelix6、BpTrihelix8，BpTrihelix2的表達量最低。

2.6 鏈格孢霉菌侵染后Trihelix基因家族的表達

為研究白樺Trihelix基因家族成員對鏈格孢霉的響應情況，分別對侵染不同時間的白樺植株葉片中各基因的表達量進行分析，結果(圖8)顯示：BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7的表達量有明顯的變化，且三者的表達量均呈先上升后下降的趨勢。在感病24 h時，三者的表達量開始上升，BpTrihelix3和BpTrihelix4的表達量均在2 d時達到峰值，此時，相對表達量分別為對照的31.1和38.7倍，BpTrihelix7的表達量在感染5 d時達到峰值，相對表達量為對照的6倍；BpTrihelix1和BpTrihelix5的表達量在2 d時開始有微弱的變化，其余基因的表達量幾乎無變化。

2.7 立枯絲核菌侵染后Trihelix基因家族成員的表達

為研究白樺Trihelix基因家族成員對立枯絲核菌的響應情況，分別對侵染不同時間的白樺幼苗整株中各基因的表達量進行分析，結果如圖9所示。其中，BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7表達量的變化最為明顯，且三者的表達量均是在感病后開始下降，直到12 h開始上升，在24 h達到峰值，相對表達量分別為對照的10.3倍、6.7倍和9.4倍；BpTrihelix1和BpTrihelix5的表達量也有不同變化，二者的表達量也在感病后呈下降趨勢，不同的是，BpTrihelix5的表達量在感病6 h時開始升高，在12 h達到峰值；BpTrihelix1的表達量在12 h時才開始上升，在24 h達到峰值；其余基因的表達量無明顯變化。

3 討 論

轉錄因子能夠與基因啟動子上的順式作用元件結合，在細胞核中調控下游靶基因的表達[20]。Trihelix家族是一類轉錄因子家族，最早在豌豆中被發現[10]，隨后，在擬南芥、水稻中陸續鑒定出多個該家族成員[21-22]。本研究在白樺中共鑒定到8個Trihelix家族成員，均定位在細胞核中，符合轉錄因子的細胞定位特征。Trihelix家族基因發揮作用主要通過與GT元件結合得以實現，GT元件屬于順式作用元件，最初的研究證明該元件與光反應有關。近些年不同功能的GT元件被鑒定出來[23]，如大豆中的SBF-1因子能與Box1、Box2及Box3元件結合，從而參與植物生長發育過程[24]。GT-1-like轉錄因子——AtGT-3b可以與GT-1元件結合，在擬南芥病原菌脅迫中發揮作用[18]。本研究發現，白樺Trihelix家族各成員均含有典型的三螺旋結構，具備與GT元件結合的結構特征，且其啟動子上具有與抗脅迫、生長發育和激素調節有關的順式作用元件，推測白樺Trihelix家族成員可能參與白樺的生長發育以及各種非生物脅迫和生物脅迫響應等生命過程。

研究表明，Trihelix家族基因在不同組織和器官中均有不同程度的表達。大豆中，GmGT2A在莖中的表達量最高，在種子中表達量則為0[25]；棉花GhGTs基因在棉花的根、莖、葉、花、胚珠及纖維均有表達，但表達程度有所不同[26]。本研究發現，白樺Trihelix家族成員在根、莖、葉中均有不同程度的表達，如BpTrihelix1、BpTrihelix4和BpTrihelix7在葉中的表達量較高，在根中的表達量卻極低，而BpTrihelix3在根、莖、葉中的表達量均為最高。基因在不同器官中的差異表達暗示著它們在植物的不同組織、器官中各自發揮著不同的調節作用。Trihelix家族被分為GT-1、GT-2、GTγ、SH4和SIP1五個亞家族，其中，GT-2亞家族被證明包含兩個保守結構域[27]，并具有抗非生物脅迫及生物脅迫功能。如擬南芥AtGT2L基因受到低溫、高鹽和ABA脅迫時，其表達量被迅速誘導[28]；楊樹中的PtaGTL1是一種Ca2+-CaM結合蛋白，能通過調節植物氣孔密度影響其蒸騰作用，從而提高植物耐旱性[29]；AtGTL1是擬南芥GT-2亞家族成員之一，研究發現它屬于AtMPK4信號級聯反應中的一部分，能協調水楊酸的代謝，賦予植物對丁香假單胞菌的免疫力[30]。本研究使用兩種病原菌侵染白樺幼苗，發現BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7的表達量變化最為明顯，氨基酸序列分析發現，這3個基因均具有N端的TN和C端的TC結構域，符合GT-2亞家族的結構特征，說明它們屬于GT-2亞家族成員，并可能在白樺的抗病反應過程中具有積極作用。

本研究利用生物信息學方法篩選鑒定出8個白樺Trihelix家族成員，并對該家族成員的結構和功能進行了初步研究，結果發現BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7在白樺各組織中表達量均較高，且都具備GT-2亞家族成員的結構特征，并顯著響應兩種病原菌的侵染，說明它們在白樺抗病過程中可能發揮重要作用，但具體作用機制還有待于進一步研究。本研究為Trihelix家族基因在白樺抗病過程中的功能研究提供了參考。