外源SNP對鹽脅迫下甜瓜幼苗生長及抗氧化酶活性的影響

李世玉，程登虎，閆 星，趙 娟，袁 飛，徐 紅，張 勇*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊陵 712100；2 東臺國家現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園，江蘇東臺 224200)

甜瓜(CucumismeloL.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬的一年生蔓生草本植物，是重要的設(shè)施園藝經(jīng)濟(jì)作物，具有一定耐鹽性[7]。但是近年來設(shè)施土壤鹽漬化越來越嚴(yán)重，鹽脅迫對甜瓜生產(chǎn)造成了不可估計的經(jīng)濟(jì)損失。利用外源褪黑素[8]、脯氨酸[9]、甜菜堿[10]等能有效緩解鹽脅迫對甜瓜生長發(fā)育的抑制作用，在此基礎(chǔ)上探索利用其他外源物質(zhì)緩解鹽脅迫對甜瓜造成的傷害，對降低設(shè)施土壤鹽漬化造成的損失具有重要作用。

外源NO對緩解植物輕度鹽脅迫危害取得了一定的進(jìn)展，但目前缺乏有關(guān)外源NO對甜瓜在重度鹽脅迫下生理調(diào)控影響的研究。因此，本試驗通過葉面噴施不同濃度的外源NO供體硝普鈉(SNP)，研究其對重度鹽脅迫(300 mmol·L-1NaCl)下甜瓜幼苗生長、光合色素含量、細(xì)胞膜透性、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響，以期為外源NO在甜瓜抗鹽栽培中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗于2020年5月至10月在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院日光溫室進(jìn)行，供試材料為耐鹽性較差的厚皮甜瓜品種‘農(nóng)大甜10號’，種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院西甜瓜課題組提供。NO供體為亞硝基鐵氰化鈉二水合物(C5FeN6Na2O·2H2O) (sodium nitroprusside，SNP)，購自源葉生物公司，純度為98.5%。

1.2 試驗處理與設(shè)計

選取飽滿、大小一致的甜瓜種子浸種催芽(55 ℃溫水中浸泡4～6 h后，放在鋪有濕潤紗布的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于28 ℃恒溫箱中12～24 h)，待種子露白后，播種于50孔穴盤育苗。待幼苗長至2片真葉時將幼苗移栽至營養(yǎng)缽(10 cm×10 cm)中，每缽1株，每隔2 d澆1次1/4 Hoagland營養(yǎng)液，每缽用量為20 mL。當(dāng)幼苗長至三葉一心時挑選生長一致的幼苗進(jìn)行處理。

試驗共設(shè)7個處理：1) 對照 (CK)，正常澆水； 2) S0，300 mmol·L-1NaCl； 3) S50，300 mmol·L-1NaCl+50 μmol·L-1SNP； 4) S100，300 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SNP；5) S150，300 mmol·L-1NaCl+150 μmol·L-1SNP； 6) S200，300 mmol·L-1NaCl+200 μmol·L-1SNP； 7) S250，300 mmol·L-1NaCl+250 μmol·L-1SNP。每處理重復(fù)3次，共45株。處理中試劑的濃度是通過前期預(yù)試驗中設(shè)置不同濃度NaCl(100、200、300、400 mmol·L-1)和SNP(50、100、300、500、800 μmol·L-1)篩選得出。SNP處理液在傍晚20:00進(jìn)行葉面噴施(以葉面欲滴又不滴水為宜)，連續(xù)噴施3 d，最后一次噴施后第2天上午9:00點進(jìn)行NaCl灌根處理(記做第0天)，第3天上午再進(jìn)行一次灌根處理，第7天上午取幼苗上數(shù)第2～3片完全展開葉(儲存于-80 ℃超低溫冰箱中)進(jìn)行各種生理指標(biāo)的測定。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長發(fā)育指標(biāo)(1)株高：以子葉到生長點的高度為株高；(2)莖粗：用游標(biāo)卡尺測量子葉上方2 cm處莖的粗度；(3)鮮重和干重：用去離子水沖洗植株后，吸水紙拭干，稱量地上部和地下部鮮質(zhì)量。然后分別將根、莖、葉于110 ℃烘箱中殺青后，調(diào)至70 ℃烘干至恒重，稱量器官干重；(4)壯苗指數(shù)：壯苗指數(shù)= (莖粗/株高+根干質(zhì)量/莖葉干質(zhì)量) × 全株干質(zhì)量。

1.3.2 光合色素含量葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素以及類胡蘿卜素的含量采用95%乙醇浸提法[20]測定。各處理重復(fù)3次。

1.3.4 抗氧化酶活性稱取0.3 g研磨均勻的葉片樣品加入6 mL 50 mmol·L-1pH7.8的磷酸緩沖液，冰浴30 min后，4 ℃、12 000 g離心10 min，上清液即為提取的粗酶液，可用于超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)的測定。各處理均重復(fù)3次。

(1)SOD活性：采用氮藍(lán)四唑(NBT)還原法[25]測定。酶反應(yīng)體系為50 mmol·L-1pH7.8磷酸緩沖液、136 mmol·L-1甲硫氨酸、20 μmol·L-1核黃素、750 μmol·L-1NBT、100 μmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉、0.5 mL蒸餾水和0.1 mL粗酶液(對照加0.1 mL蒸餾水)，其中一管對照放置黑暗中作空白管，將其余各管光照30 min，以空白調(diào)零，測定反應(yīng)液在560 nm的吸光度。

(2)POD活性：采用愈創(chuàng)木酚比色法[25]測定。酶反應(yīng)體系為 50 mmol·L-1pH7.8磷酸緩沖液680 μL、 250 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚100 μL、20 μL酶液，最后加入 200 mmol·L-1H2O2啟動液200 μL，立即測定470 nm的吸光度，每隔15 s讀數(shù)一次，共測2 min。

(3)CAT活性：采用紫外吸收法[26]測定。酶反應(yīng)體系為 50 mmol·L-1pH7.0磷酸緩沖液780 μL、20 μL酶液，最后加入 200 mmol·L-1H2O2啟動液200 μL，立即測定240 nm的吸光度，每隔10 s讀數(shù)一次，共測1.5 min。

(4)APX活性：采用過氧化氫法[27]測定。酶反應(yīng)體系為 50 mmol·L-1pH7.3磷酸緩沖液580 μL、1 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉 100 μL、5 mmol·L-1抗壞血酸ASA100 μL、20 μL酶液，最后加入5 mmol·L-1H2O2啟動液200 μL，立即測定290 nm的吸光度，每隔5 s讀數(shù)一次，共測1.5 min。

(5)GR活性：采用比色法[27]測定。酶反應(yīng)體系為100 mmol·L-1pH8.0 Tris-HCl 640 μL、10 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉100 μL、2.5 mmol·L-1GSSG 120 μL、20 μL酶液，最后加入1 mmol·L-1NADPH啟動液120 μL，立即測定340 nm的吸光度，每隔5 s讀數(shù)一次，共測1.5 min。

(6)MDHAR活性：參考Krivosheeva等[28]的方法測定。酶反應(yīng)體系為50 mmol·L-1pH7.3 Hepes-KOH 740 μL、11 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉 10 μL、25 mmol·L-1抗壞血酸ASA 110 μL、20 μL酶液，最后加入20 μL(AO)啟動液，立即測定340 nm的吸光度，每隔10 s讀數(shù)一次，共測1.5 min。

(7)DHAR活性：參考Nakano等[27]的方法測定。酶反應(yīng)體系為 100 mmol·L-1pH7.0 Hepes-KOH 640 μL、1 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉100 μL、25 mmol·L-1還原型谷胱甘肽GSH 120 μL、20 μL酶液，最后加入2 mmol·L-1氧化態(tài)脫氫抗壞血酸DHA 啟動液120 μL，立即測定265 nm的吸光度，每隔10 s讀數(shù)一次，共測1.5 min。

1.3.5 游離脯氨酸和可溶性蛋白含量游離脯氨酸(Pro)含量采用磺基水楊酸法[26]測定。稱取0.2 g研磨均勻的葉片樣品加入2 mL磺基水楊酸，沸水浴中提取10 min，冷卻后，6 000 g離心10 min，取1 mL上清、1 mL蒸餾水、1 mL冰醋酸、2 mL酸性茚三酮，沸水浴中顯色1 h，冷卻后加2 mL甲苯，渦旋震蕩0.5 min，靜置分層，吸取紅色甲苯相，520 nm處測定吸光度。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法[26]測定。稱取0.2 g研磨均勻的葉片樣品，加入10 mL蒸餾水，取2～3 mL勻漿于離心管中，5 000 g離心10 min，上清液即為蛋白質(zhì)提取液。吸取蛋白質(zhì)提取液0.1 mL，加入0.9 mL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置2 min后在595 nm比色，記錄吸光值。各處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用 Excel 2017和 Origin Pro 2019軟件整理實驗數(shù)據(jù)和作圖，用 SPSS 19. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(α= 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源SNP對鹽脅迫下甜瓜幼苗植株表型和生長的影響

鹽脅迫條件下不同SNP處理甜瓜幼苗植株生長表型情況如圖1所示。與CK相比，甜瓜葉片在單獨鹽脅迫處理(S0)下明顯黃化，邊緣卷曲枯萎嚴(yán)重。不同濃度外源SNP處理(S50-S250)的效果不同。與S0相比，S50處理下葉片稍有恢復(fù)但仍明顯發(fā)黃卷曲；S150處理下葉片已明顯復(fù)綠，生長狀態(tài)最好；S100處理葉片狀況比S150稍差；S200處理葉片狀況較差，稍優(yōu)于S250處理；S250處理葉片生長狀況最差。可見，S150處理對甜瓜所受鹽脅迫傷害的緩解效果最佳，隨后依次為S100、S50、S200、S250處理。

同時，在單鹽脅迫處理(S0)下，甜瓜幼苗的株高、莖粗、地上部和地下部的鮮重和干重、壯苗指數(shù)均比對照顯著下降，降幅在28.85%～51.50%之間(表1)。而施加不同濃度的外源SNP均能顯著提高NaCl脅迫下甜瓜幼苗各生長指標(biāo)，且各指標(biāo)隨SNP濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但都高于S0處理，低于CK處理。其中以S150處理的株高、莖粗、地上部和地下部的鮮重和干重、壯苗指數(shù)最大，比S0處理分別提高了43.55%、29.73%、51.20%、54.55%、76.11%、45.45%、48.94%，除地下干重外增幅均達(dá)到顯著水平。

表1 外源SNP對鹽脅迫下甜瓜幼苗生長的影響Table 1 Effects of exogenous SNP on the growth of melon seedlings under salt stress

2.2 外源SNP對鹽脅迫下甜瓜幼苗光合色素含量的影響

鹽脅迫下甜瓜幼苗的光合色素含量與對照(CK)相比均出現(xiàn)不同程度的下降(表2)。其中，單鹽脅迫處理(S0)幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素總量比CK分別顯著降低了51.33%、44.74%、29.17%、49.01%。葉面噴施不同濃度SNP處理后，葉片各光合色素含量均比S0處理不同程度增加，但仍顯著低于相應(yīng)的對照；隨SNP濃度的增加，各光合色素含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且都在S150處理下增幅最大，此時葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素總量分別比S0處理顯著提高了47.27%、28.57%、11.76%、40.26%。

表2 外源SNP對鹽脅迫下甜瓜幼苗光合色素含量的影響Table 2 Effects of exogenous SNP on photosynthetic pigment contents of melon seedlings under salt stress

2.3 外源SNP對鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片產(chǎn)生

速率及H2O2和MDA含量的影響

圖2顯示，與CK相比，單鹽脅迫處理(S0)大幅

2.4 外源SNP對鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

如圖3所示，單一鹽脅迫處理(S0)甜瓜幼苗葉片SOD、POD、APX、GR、MDHAR和DHAR的活性均比對照顯著提高20%～215%，并以MDHAR活性增幅最大，而其CAT活性卻比對照顯著降低53.25%。與S0處理相比、不同濃度SNP處理甜瓜幼苗葉片SOD、POD、CAT、APX、GR、MDHAR和DHAR的活性大多不同程度升高；隨SNP處理濃度的增加，7種酶活性均呈先升高后下降的趨勢變化，并均在S150處理下得到最大增幅，此時比相應(yīng)S0處理分別顯著提高了25.20%、63.18%、56.62%、18.00%、68.00%、43.65%、36.89%，說明葉面噴施適宜濃度SNP能顯著增強(qiáng)鹽脅迫甜瓜幼苗葉片的抗氧化酶活性，從而增強(qiáng)幼苗耐鹽脅迫能力。

2.5 外源SNP對鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

從圖4可知，葉面噴施不同濃度SNP能顯著提高鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片中脯氨酸和可溶性蛋白含量。其中，與對照相比，單獨鹽脅迫處理(S0)能分別使甜瓜葉片中脯氨酸與可溶性蛋白的含量顯著提高107%和49%；隨SNP濃度的升高，甜瓜葉片中脯氨酸和可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，且大多顯著高于S0處理，并均在S150處理下含量最高，此時分別比S0處理顯著提高了73.86%和42.98%。

3 討 論

鹽脅迫是主要的非生物脅迫之一，當(dāng)植物遭受鹽脅迫時，最直觀的表現(xiàn)是生物量積累的降低，而生物量積累的降低是植物遭受生理傷害的綜合反映[5]。本試驗中鹽脅迫甜瓜幼苗的生長受到顯著抑制，其株高、莖粗、干鮮重均明顯降低，許姣姣[21]利用γ-氨基丁酸提高了甜瓜內(nèi)源NO含量進(jìn)而增強(qiáng)甜瓜耐鹽堿性，本研究利用葉面噴施不同濃度外源NO供體SNP后，鹽脅迫的生長抑制作用得到明顯緩解，并且隨SNP濃度的增大緩解作用呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在150 μmol·L-1SNP)的緩解效果最佳，這種趨勢與吳錚等[29]在藜麥幼苗中的研究結(jié)論一致。只是最佳濃度有所不同，可能是由于物種不同，或本試驗為重度鹽脅迫所導(dǎo)致。

光合色素作為植物吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換光能，進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量的高低直接關(guān)系到葉片光合功能的充分發(fā)揮[30]。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片光合色素含量均顯著降低，而施加SNP處理可使脅迫下幼苗葉片的各色素含量獲得不同程度的提高，這與孫德智等[20]在番茄幼苗中的研究結(jié)論一致。說明外源NO可通過提高鹽脅迫下光合色素的含量而影響甜瓜幼苗的生長發(fā)育，進(jìn)而增強(qiáng)了植株的耐鹽性。

細(xì)胞膜是維持植物體正常生長代謝的重要組成部分[31]。逆境脅迫對植物細(xì)胞最直接的傷害就是破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝平衡發(fā)生紊亂，活性氧

同時，SOD、POD、CAT等保護(hù)酶能有效減輕ROS對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，抑制膜脂過氧化，以減輕逆境脅迫對植物細(xì)胞的傷害[33]。SOD能將毒性

另外，植物為了減緩由鹽脅迫造成的生理代謝不平衡，通常會在植物胞內(nèi)積累一些小分子可溶性有機(jī)化合物，例如可溶性蛋白、脯氨酸等，以通過滲透調(diào)節(jié)來降低細(xì)胞水勢，保證植物細(xì)胞正常生理功能，從而使植物正常生長[35]。因此通過外源物質(zhì)誘導(dǎo)和調(diào)控植物中脯氨酸和可溶性蛋白的含量可以有效緩解逆境傷害[36]。本研究結(jié)果表明，在鹽脅迫條件下，噴施不同濃度外源SNP后甜瓜幼苗葉片的脯氨酸和可溶性蛋白的含量明顯增加，并且隨SNP施用濃度的增大呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并在150 μmol·L-1濃度處理下含量增幅達(dá)到最大。這一變化規(guī)律與在小麥幼苗[37]、番茄[38]、黃瓜[39]上相關(guān)的研究結(jié)論一致，但最佳濃度有所差異，可能是由于脅迫效果與物種之間差異導(dǎo)致。這說明添加SNP有利于植物幼苗體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成與積累，減輕鹽脅迫對甜瓜幼苗生長的危害，提高幼苗對鹽脅迫的適應(yīng)性。

綜上所述，葉面噴施外源SNP可以有效促進(jìn)甜瓜幼苗葉片光合色素含量、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的提高，顯著降低細(xì)胞膜透性。在本研究中，150 μmol·L-1SNP葉面噴施處理可高效修復(fù)甜瓜幼苗因NaCl脅迫引起的傷害，恢復(fù)和維持植株生理代謝和生化反應(yīng)的恒穩(wěn)狀態(tài)，緩解甜瓜幼苗在逆境下受到的生長抑制，提高了甜瓜幼苗的抗鹽性。