大豆內生細菌的分離及其作用效果研究

田振祥，丁偉*，程茁，戴航宇

（1.東北農業大學農學院，哈爾濱 150030；2.東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030）

大豆作為中國重要的糧食作物，當前面臨國內生產不足、依賴進口的嚴峻形勢。化學肥料的大量施用會導致生態環境惡化。大豆中存在豐富的內生菌種群，具有多種生理生態學功能，如生物固氮、調節植物激素分泌、產生抑菌代謝物質等[1]。探索大豆內生菌作為環境友好型生物刺激素應用于農業生產，對大豆生產中減少化學肥料的使用具有重要意義。

當前從植物中分離和鑒定的內生細菌主要包括根瘤菌屬（Rhizobium）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、假 單 胞 菌 屬（Pseudomonas）、葡 萄 球 菌 屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacil l us）等[2]。大豆種子內生細菌研究開展較晚[3]，目前國內外對大豆內生細菌的研究多是從根、莖或根瘤內進行分離和鑒定，具體作用表現為具有分泌細胞素酶、果膠酶、植物生長素（IAA）能力和對某些植物病原菌具有拮抗作用[4-5]。從大豆根部分離獲得的賴氨酸芽孢桿菌與微桿菌能分泌大量的IAA內生細菌，對大豆的生長具有顯著促進作用[6]。衡楠楠等[7]把大豆根瘤中分離獲得的內生菌株SCAUS8接種到大豆植株上，對大豆生長和產量均有顯著促進作用。王玉霞等[8]從不同大豆品種的根、莖、葉中分離獲得芽孢桿菌，其對尖孢鐮孢菌、菌核病菌等病原菌具有良好生物防治效果。種子中也存在豐富的內生菌，并具有合成植物激素、溶磷、固氮和抗逆等功能[9]。從水稻和田菁種子中分離得到檸檬色短小桿菌K12G2和BacillusSC60，該菌株具有產IAA、溶解無機磷、固氮及提高淀粉酶活性的促生特性，對種子萌發與幼苗生長具有促進作用[10-11]。如今生物刺激素在農業領域的研究與應用發展迅速[12]，已有多項研究表明，應用植物促生細菌作為生物刺激素具有促進植株生長和提高產量的作用[13-14]。大豆體內具有豐富的內生細菌，并具有多種生理生態學功能[15-17]，但目前關于內生細菌的研究對象大多為禾本科植物和林木，關于大豆內生細菌的相關研究相對較少，因此發掘并應用大豆內生細菌作為環境友好型生物刺激素，對減少化學肥料使用、促進大豆生長發育、提高大豆抗逆能力和產量等具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試種子 轉基因抗草甘膦大豆呼交06-698及其受體蒙豆12由中國農業科學院作物科學研究所提供，轉基因抗旱大豆T-DREB3-1及其受體東農50由東北農業大學大豆生物學教育部重點實驗室提供。

1.1.2 供試培養基 營養肉湯（NA）培養基：牛肉粉3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.4。

營養瓊脂（NB）培養基：牛肉粉3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

Pikovskava無機解磷固體培養基:葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·7H2O 0.03 g、FeSO4·7H2O 0.3 g、Ca3(PO4)25 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

1.2 大豆種子內生細菌的分離及純化

每個大豆品種各取10粒，分別裝入2層無紡布袋內，埋藏于20 cm深土層中，試驗地點位于東北農業大學農學院北側人煙稀少的樹林內，在第3、第7天觀察種子有無腐爛變質，若種子健康則放回深土層中，至第10天后取出種子，種子取出后用95%乙醇消毒1 min，0.5%升汞消毒2 min，70%乙醇消毒1 min，然后用無菌水清洗5～7次，用無菌濾紙吸干水分，用滅菌鑷子分別取出大豆放入NB培養基內，每個培養皿放置5粒大豆種子。置于37℃恒溫培養箱中進行暗培養，胚根伸出后每天觀察種子和胚根周圍菌落生長情況。另取無菌水100μL涂于培養基表面作為對照。從胚根周圍出現菌落的培養皿中挑取單菌落至NB培養基劃線純化，純化后單菌轉到NB培養基斜面試管中保存。

1.3 促生細菌的初步篩選

挑選籽粒飽滿的大豆種子，取200 mL所得內生菌懸液進行浸種4 h處理，使用不含內生菌的滅菌NA培養基作為對照。把浸種后的種子置于墊有濾紙的培養皿中，保持濾紙濕潤，于25℃恒溫培養箱中培養，3 d后測定發芽勢，7 d后測定發芽率、芽長，每處理3次重復；另取上述2種方法處理的種子播種在裝有滅菌土的小盆中，置于光照培養箱中培養，晝夜溫度為25℃/20℃,光照時間12 h/12 h，分別于14、21 d測定大豆株高，每處理3次重復。從中篩選優勢菌株進行16s rRNA鑒定和后續的作用效果研究。

宏波的畫風恰恰兼容了海派與新浙派繪畫的一些特質與精髓，既重視浙派花鳥畫的寫意精神與美學傳統，又照顧到了海派藝術的色彩明麗與雅俗共賞，呈現出瀟灑飄逸，古樸雄厚的繪畫特色，將新浙派的風骨與海派的濃艷合二為一，因而其筆下的花鳥畫作品無論是何種題材，均能體現出一種艷而不俗，清而不媚，秀而不寒，多而不亂，清麗超脫的可人姿致。

1.4 內生細菌的鑒定

按照細菌基因組提取試劑盒說明書（天根生化科技有限公司）提取大豆內生菌株DNA。采用引 物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)擴增16S rRNA序列，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR擴增體系：模板1μL，引物各1μL，PCR Super Mix 15μL，加入雙蒸水補足30μL。PCR擴增程序：96℃預變性5 min；96℃變性20 s，62℃退火20 s，72℃延伸1 min，循環35次；72℃延伸10 min，16℃保溫。PCR產物利用1.0%的瓊脂糖凝膠進行檢測，觀察條帶性狀。將純化后的PCR產物交由北京六合華大基因科技有限公司進行測序，獲得拼接序列后在NCBI數據庫進行BLAST比對，選擇相似度較高的菌株序列使用Mega 7.0軟件以Neighbor-joining鄰接法進行系統發育樹的構建，確定菌株種屬。

1.5 產IAA能力測定

取0.5 mol·L-1FeCl3溶液10 mL，加入500 mL 35%的HClO4溶液中，獲得Salkowski比色液。將優勢菌株接種到NA液體培養基中培養24 h（30℃、180 r·min-1）后，分別取100μL KC-1與MD12-2菌懸液接種至含200 mg·L-1色氨酸的NA培養基中培養48 h（30℃、180 r·min-1），每錐形瓶含100 mL培養液，設3次重復。將菌株培養液8 000 r·min-1離心1 min，取上清液與Salkowski比色液等量混合，使用未接菌NA培養基與Salkowski比色液混合作為陰性對照，使用IAA水溶液與Salkowski比色液混合作為陽性對照，室溫下避光靜置30 min，觀察其變色情況。若3次重復均變紅，表明該菌株具備產IAA能力[11]。

1.6 內生菌株溶磷能力測定

待無機解磷培養基凝固后，使用打孔器在培養基中間打孔，直徑約為0.5 cm，取培養所得內生菌液50μL點入孔中[19]，30℃下培養4～7 d后，若菌落周圍出現清晰的透明圈，表明該菌株溶磷能力良好[11]。

1.7 大豆內生細菌促萌發效果測定

將菌株在NA培養基中接種后，于恒溫搖床（37℃，180 r·min-1）培養24 h，在血球計數板中觀察可知菌液含量約為10×107cfu·mL-1，稀釋菌液至1倍、2倍、4倍，即調整菌液含量為高（10.0×107cfu·mL-1）、中（5.0×107cfu·mL-1）、低（2.5×107cfu·mL-1）。選擇飽滿、大小均一的呼交06-698和蒙豆12大豆種子，表面消毒后分別取200 ml高、中、低3種含量的KC-1與MD12-2菌懸液進行浸種處理4 h，使用滅菌NA培養基（0.0 cfu·mL-1）作為對照，每處理20粒種子，設3次重復。將處理后的種子置于墊有濾紙的培養皿中，保持濕潤，于恒溫培養箱25℃進行培養。每天觀察并記錄種子發芽情況。3 d后測定發芽勢、7 d后測定發芽率，并按以下公式計算內生菌對種子萌發和幼苗的影響[20]。第7天采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法[21]測定大豆種子萌發過程中α-淀粉酶含量。

式中，Gt指在時間t日內發芽數，Dt指相應發芽天數。

1.8 大豆內生細菌的作用效果

在東北農業大學盆栽場內，選用直徑30 cm，高40 cm的花盆，每盆裝草炭混合營養土3 kg，供試呼交06-698和蒙豆12大豆種子表面消毒后，分別用高（10.0×107cfu·mL-1）、中（5.0×107cfu·mL-1）、低（2.5×107cfu·mL-1）、滅菌NA培養基（0.0 cfu·mL-1）4種處理的菌懸液浸種4 h，將處理后的種子每盆播種3粒，播深3 cm，每處理5次重復。

1.8.1 內生細菌促生長效果測定 在大豆生長苗期、初花期、結莢期，隨機選取植株對大豆株高、地上部干重、地下部干重、根瘤鮮重、根瘤干重和根瘤數進行調查。

1.8.2 大豆葉綠素含量和硝酸還原酶活性測定在大豆苗期、初花期、結莢期，各處理隨機挑選植株，選取新近完全展開的復葉，參照張憲政等[22]方法測定葉綠素含量和硝酸還原酶活性測定。

1.8.3 大豆根系活力測定 在大豆苗期、初花期、結莢期，每個處理隨機選取大豆根系，采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[23]測定大豆根系活力。

1.8.4 大豆根瘤固氮酶活性測定 在大豆苗期、初花期、結莢期，每個處理隨機選取大豆根系，參考ZabLotowicz等[24]和Ding等[25]的方法并改進，測定各處理大豆根瘤固氮酶活性。

1.9 數據處理

使用Excel 2013進行原始數據整理，應用DPS 7.05軟件分析處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 大豆內生細菌的分離與優勢菌株篩選

從4個大豆品種中共分離獲得8株內生細菌，其中，轉基因抗草甘膦大豆呼交06-698中分離獲得2株，編號為KC-1、KC-2；蒙豆12中分離獲得2株，編號為MD12-1、MD12-2；轉基因抗旱大豆T-DREB3-1中分離獲得1株，編號為KH-1；東農50中分離獲得3株，編號為DN50-1、DN50-2、DN50-3。分離所得內生細菌菌液浸種處理后，與其他處理相比，KC-1與MD12-2菌液處理效果最好，大豆種子發芽勢、芽長與株高均顯著增加(P＜0.05)（表1），選擇菌株KC-1與MD12-2進行鑒定及后續效果試驗。

表1 不同內生細菌浸種后大豆萌發性狀Table 1 Effect of different endophytic bacterial dips on germination and growth of soybean

2.2 優勢內生細菌的16S rRNA分析

對KC-1和MD12-2菌株DNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測可見條帶清晰明亮，提取的DNA具有較高濃度與純度，可進行下一步試驗。通過16S rRNA序列比對，從結果中選取序列相似度高具有代表性的菌株，使用Neighbor-joining鄰接法構建系統發育樹（圖1、圖2）。Blast比對結果顯示，KC-1與Brevibacill us laterosporusDSM 25相似性高達100%，MD12-2與Bacillus subti l isstrain soil G2B相似性高達100%，一般情況下，16S rRNA序列之間存在97%以上相似性的原核生物被認為屬于同種[26]，因此KC-1屬于Brevib acil l us laterospor us，MD12-2屬于Bacillus s ubtilis。

圖1 菌株KC-1的16S rRNA系統發育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA of strain KC-1

圖2 菌株MD12-2的16S rRNA系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA of strain MD12-2

2.3 菌株產IAA能力

在含色氨酸的培養基中接種菌株KC-1與MD12-2，與比色液混合后，與陰性對照比對，呈現紅色，與陰性對照有明顯的差異(圖3)，說明菌株KC-1與MD12-2具有產生IAA的能力[27]。

圖3 菌株KC-1和MD12-2產IAA的能力Fig.3 IAA secreting ability of strains KC-1 and MD12-2

2.4 菌株溶磷能力

與對照相比，KC-1與MD12-2菌落周圍出現明顯的透明圈（圖4），說明KC-1與MD12-2具有良好的溶磷能力。

圖4 菌株KC-1和MD12-2的溶磷能力Fig.4 Phosphate solubilizing ability of strains KC-1 and MD12-2

2.5 內生細菌對大豆種子萌發特性的影響

在低含量KC-1與MD12-2菌液浸種處理下，大豆種子發芽勢較對照顯著增加41.68%和38.34%，種子活力分別較對照顯著提高45.54%和236.47%，發芽率未見顯著變化。各含量菌液浸種處理的種子在萌發過程中α-淀粉酶活性較對照均有顯著提高，其中低含量KC-1與MD12-2菌液浸種處理大豆α-淀粉酶活性較對照升高最多，分別增加46.5%和144.9%（表2）。可見，低含量KC-1與MD12-2浸種對種子萌發具有明顯的促進作用。

表2 大豆內生細菌的促萌發效果Table 2 Promoting germination of soybean endophytic bacteria

2.6 內生細菌的促生長效應

2.6.1 內生細菌浸種對大豆生長指標的影響MD12-2中含量和高含量浸種處理下，大豆苗期株高較對照分別顯著增加27.3%和25.5%；高含量KC-1與MD12-2處理大豆株高在初花期較對照分別顯著提高50.2%和28.9%，結莢期較對照分別顯著提高25.7%和29.5%。初花期，高含量KC-1與MD12-2處理大豆植株地上部干重較對照分別顯著增加24.6%和19.3%。苗期，各含量KC-1浸種處理大豆植株地下部干重均顯著增加；結莢期，中含量MD12-2浸種處理大豆植株地下部分干重較對照顯著增加26.5%。可見，中、高含量的KC-1和MD12-2浸種對大豆生長的促進效果最好（表3）。

表3 大豆內生細菌的促生長效果Table 3 Promoting function of soybean endophytic bacteria

2.6.2 內生細菌浸種對大豆葉綠素含量的影響 苗期，中、低含量MD12-2浸種處理，大豆葉綠素含量較對照分別顯著提高16.9%和13.0%；初花期，中含量MD12-2浸種處理下，大豆葉綠素含量較對照顯著提高27.4%；結莢期，各處理間均無明顯差異。可見，中、低含量MD12-2在大豆生長苗期和初花期可顯著增加葉綠素含量，菌株KC-1對大豆葉綠素含量無明顯影響（圖5）。

圖5 內生細菌對大豆葉綠素含量的影響Fig.5 Effect of endophytic bacteria on chlorophyll content of soybean

2.6.3 內生細菌浸種對大豆硝酸還原酶活性的影響 苗期，高、中含量KC-1與MD12-2浸種處理后，大豆硝酸還原酶活性提升幅度較為明顯，較對照分別提高119.5%、94.23%與70.7%、87.54%；初花期，中含量KC-1與MD12-2浸種處理，大豆硝酸還原酶活性較對照分別顯著提高109.1%和129.0%；結莢期，中含量KC-1與MD12-2處理下大豆硝酸還原酶活性較對照分別顯著提高66.9%與117.5%。可見，苗期時高、中含量KC-1與MD12-2對提高大豆硝酸還原酶活性作用效果最好；初花期與結莢期時，中含量KC-1與MD12-2對提高大豆硝酸還原酶活性作用效果最好（圖6）。

圖6 內生細菌對大豆硝酸還原酶的影響Fig.6 Effect of endophytic bacteria on nitrate reductase activity of soybean

2.6.4 內生細菌浸種對大豆根系活力的影響 苗期，高、中、低含量KC-1與高、中含量MD12-2處理的大豆根系活力均有顯著提高；其中，中含量KC-1與MD12-2處理的大豆根系活力提高幅度最大，較對照顯著提高75.4%和84.0%(P＜0.05)。初花期，高、中、低含量KC-1與MD12-2處理的大豆根系活力均有顯著提高；其中，中含量KC-1與MD12-2處理的大豆根系活力提高幅度最大，較對照分別顯著提高107.2%和195.3%。結莢期，中含量KC-1與高、中、低含量MD12-2處理的大豆植株根系活力均有顯著提高；其中，中含量KC-1與MD12-2處理的大豆根系活力提高幅度最大，較對照分別顯著提高45.0%與160.1%。可見，中含量KC-1與MD12-2對提高大豆根系活力作用效果最好（圖7）。

圖7 內生細菌對根系活力的影響Fig.7 Effect of endophytic bacteria on root activity of soybean

2.6.5 內生細菌浸種對大豆根瘤固氮酶活性的影響 苗期，低含量KC-1處理，大豆根瘤固氮酶活性顯著增加124.1%(P＜0.05)；初花期，高含量KC-1與MD12-2處理根瘤固氮酶較對照分別顯著提高100.4%和44.6%；結莢期，高含量KC-1處理根瘤固氮酶活性較對照顯著提高191.0%(P＜0.05)。可見，低含量KC-1在苗期對提高大豆根瘤固氮酶活性作用效果最好；高含量KC-1在初花期與結莢期對提高大豆根瘤固氮酶活性作用效果最好；高含量MD12-2在初花期對提高大豆根瘤固氮酶活性作用效果最好（圖8）。

圖8 內生細菌對根瘤固氮酶的影響Fig.8 Effect of endophytic bacteria on nitrogenase activity in root nodules

3 討論

本研究采用種子埋藏的方法使土壤微生物定植于種子內成為內生菌，這與周怡等[28]直接選擇大豆種子破碎后進行內生菌分離的方式不同，該方法不僅可以獲得大豆種子內源本存在的內生菌，還可獲得能侵入并定植于大豆種子內的土壤微生物，更易得到豐富的內生菌株。植物內生菌分離因消毒、分離等方式的不同，所得內生菌數量、種類及準確性也存在區別。對種子表面消毒后采用無菌水清洗，在培養基中培養大豆并在胚根周圍獲得內生菌，這種方法既可保證獲得菌株來自大豆種子內部，又可避免破碎種子后分離內生菌容易在操作過程中污染而造成準確性差的不利影響。

本研究所得2株優勢內生細菌KC-1與MD12-2，經16S rRNA鑒定分別為側孢芽孢桿菌（Brevib aci l lus laterosporus）和 枯 草 芽 孢 桿 菌（Baci l lus s ubtilis），利用菌株發酵液進行浸種處理后發現，種子的發芽勢、種子活力和種子萌發時α-淀粉酶活性較對照均有顯著提高，說明使用大豆內生細菌浸種處理對大豆種子萌發有良好的促進效果，與張凱曄等[11]田菁種子內生菌SC17浸種處理的研究結果一致。Khan等[29]接種內生菌Peni cilliumminiol ut eumLHL09，使大豆芽伸長、葉面積和葉綠素含量等得到顯著提高，本研究中菌株KC-1與MD12-2發酵液浸種處理，可以增強大豆生長過程中硝酸還原酶與根瘤固氮酶活性，提高大豆葉綠素含量，從而保證大豆在生長期間健康的氮循環過程，保證大豆植株中高水平含量的氮，促進大豆的光合作用，大豆的株高、地上部干重和地下部干重顯著增加，使大豆獲得較高的干物質積累，并提高大豆生育期內根系活力，提高大豆的吸水能力與營養獲取能力，為大豆高產奠定了基礎。