嗜吡啶紅球菌Rp3生長及降解糞臭素特性研究

吳玉洪，郭榮君，馬桂珍，李世東

（1.江蘇海洋大學環境與化學工程學院，江蘇連云港 222005；2.中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193）

糞臭素（3-甲基吲哚）是含氮雜環有機物，具有刺激性臭味[1-4]，主要為色氨酸在動物消化系統中的產物[5-7]，并隨動物糞便排出體外，進而污染環境。糞臭素會損傷人體機能，引發肺相關疾病，并導致動物出現急性肺水腫等疾病[8]。近年來，利用微生物降解氮雜環類化合物已成為研究熱點，乳酸菌、不動桿菌、惡臭假單胞菌、綠膿桿菌等均對氮雜環類化合物具有降解作用[9-11]。本課題組前期分離鑒定出1株糞臭素高效降解菌——嗜吡啶紅球菌Rp3，該菌株在無機鹽培養液中培養48 h能夠將100 mg·L-1糞臭素完全降解，是非常有潛力的降解菌株[12]。因此進一步明確適宜Rp3菌株生長的碳氮源及不同因素對其降解糞臭素的影響，對該菌株的工業化生產及堆肥污染環境的修復具有重要意義。

微生物對污染物的降解作用通常受到碳氮營養、溫度、金屬離子等因素的影響。Kohda等[13]研究發現，PYG培養液中蛋白胨、葡萄糖、酵母粉等營養供給有利于馬來提名梭菌（Clostridiummalenominatum）對糞臭素的降解；添加葡萄糖可提高芽孢桿菌（Bacillus）L1對吲哚的降解速度[14]；Fukuoka等[15]研究發現，以甘油為原料時，土壤細菌 貪銅菌（Cupriavidus）KK10在24 h內 可 將100 mg·L-1的糞臭素完全降解。溫度和pH影響乳鏈球菌（Streptococcuslactis）6020對糞臭素的降解[16]，芽孢桿菌L1則在30℃時對吲哚降解率最高[14]。Zn2+可明顯促進產堿桿菌屬（Alcaligenessp.）WUST-qu菌株對喹啉的降解[17]。此外，菌株傳代可能影響微生物的降解功能，如α-苯乙胺降解菌P2在多次傳代后，其對α-苯乙胺的降解能力出現退化[18]。目前有關紅球菌對烷烴、芳香烴、原油、有機腈、熒蒽等化合物的轉化及降解研究較多[19-21]。本研究旨在探究適宜嗜吡啶紅球菌Rp3菌株生長的碳氮源及不同因素對其生長和糞臭素降解效率的影響，以期對該菌株的大量培養和實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 供試菌株 嗜吡啶紅球菌（Rhodococcuspyridinivorans）Rp3由中國農業科學院植物保護研究所分離獲得。

1.1.2 培養基 無機鹽培養基L2[12]：KH2PO40.5 g、K2HPO41.5 g、MgSO40.5 g、（NH4）2SO41.5 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2。LB液體培養基：胰蛋白胨10 g、NaCl 5 g、酵母提取物5 g，蒸餾水定容至1 L。

1.1.3 實驗儀器 Flexstion3全波長掃描多功能讀數儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司；LC-20A高效液相色譜儀購自日本島津日本島津株式會社；HCY-123B恒溫振蕩搖床購自太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糞臭素對Rp3菌株生長的影響 將Rp3菌株分別接種于含0（CK）、100 mg·L-1糞臭素的L2培養液中，28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養48 h，每處理設3次重復，測定OD600值。

1.2.2 Rp3菌株活菌數與OD600對應的標準曲線建立 將Rp3菌株接種于LB培養液中，28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養24 h。取上述培養液，5 000 r·min-1離心10 min，棄上清，用0.9%NaCl溶液重懸，再離心洗滌，該過程重復3次。將菌懸液稀釋至OD600分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8，將不同OD600的菌懸液稀釋涂布于LB固體培養基上，28℃培養48 h，設3次重復。以Rp3菌株菌懸液OD600為橫坐標，以菌落形成單位（colony forming unit，CFU）為縱坐標，繪制細菌活菌數與OD600的標準曲線。

1.2.3 正交試驗 以L2為基礎培養基，根據前期預試驗結果，設計蔗糖[12（A1）、14（A2）、16 g·L-1（A3）]、牛肉膏[10（B1）、12（B2）、14 g·L-1（B3）]、酵母浸粉[2（C1）、4（C2）、6 g·L-1（C3）]三因素三水平正交試驗L9（34）。28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養48 h，測定OD600值，計算培養液中Rp3的活菌數，確定適宜Rp3菌株生長的碳氮源用量。判斷標準：依據不同因素在水平1（K1）、水平2（K2）和水平3（K3）的實驗結果總和計算各因子的k1（K1/3）、k2（K2/3）、k3（K3/3）值以及極差值Ri（同列k1、k2、k3中最大值與最小值的差）。

1.2.4 碳氮源對Rp3菌株生長和降解糞臭素的影響 以正交實驗獲得的適宜碳氮源為待測碳氮源，分別配制L2+適宜碳氮源（L2-N）和L2培養液，并加入糞臭素，使其終含量為100 mg·L-1。按5%的接種量加入Rp3菌懸液（OD600=0.8），以相同含量糞臭素但不接種Rp3菌液的培養液為CK，每處理設3次重復。28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養24 h，測定培養液的OD600和糞臭素含量。采用高效液相色譜法（high performance liquid chromato-graphy，HPLC）檢測糞臭素的條件[12]：色譜 柱 為Hypersill BDSC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫為室溫（25℃），紫外檢測波長為254 nm；流動相設置甲醇∶水為90∶10（體積比），流速為1 mL·min-1，進樣量10μL。計算糞臭素的降解率。

1.2.5 金屬離子對Rp3菌株生長和降解糞臭素的影響 參照鄧秀瓊[22]的方法測定不同金屬離子對糞臭素降解的影響。L2培養液中糞臭素含量為100 mg·L-1，金屬離子含量：Fe2+25 mg·L-1、Mn2+50 mg·L-1、Zn2+50 mg·L-1、Mg2+100 mg·L-1，以只加糞臭素的L2培養液為對照，每處理設3次重復。28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養48 h，測定OD600和糞臭素含量，并計算糞臭素的降解率（公式1）。

1.2.6 溫度對Rp3菌株生長和降解糞臭素的影響無機鹽培養液L2中添加100 mg·L-1的糞臭素，分別在28、35、40℃及180 r·min-1搖床振蕩培養24 h，測定OD600和糞臭素含量，計算糞臭素的降解率（公式1）。

1.2.7 傳代對Rp3菌株生長和降解糞臭素的影響將Rp3初始菌株Rp3-0接種于60 mL LB培養液中，28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養，以7 d為1個傳代周期，連續傳代5代（Rp3-5）、10代（Rp3-10）。分別取Rp3-0、Rp3-5和Rp3-10菌懸液，于12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，用無菌水重懸3次，調整OD600=0.8，按5%的接種量接種于L2培養液中，其中糞臭素含量為100 mg·L-1，裝液量為20 mL，各處理以不接種Rp3為對照，標記為CK-0、CK-5和CK-10。28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養，每處理設3次重復。分別于24、48 h取樣，測定OD600和糞臭素含量，計算糞臭素的降解率（公式1）。

1.3 數據統計分析

采用SPSS 24軟件對數據進行統計分析，數值采用平均值±標準差表示，采用Excel 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 Rp3菌株在糞臭素為唯一碳源培養液中的生長量

如圖1所示，Rp3菌株在未添加糞臭素的L2培養液中基本不生長，在添加100 mg·L-1糞臭素的L2培養液中生長量顯著高于CK（P＜0.05），表明Rp3通過降解糞臭素為其生長提供碳源。

圖1 Rp3菌株在糞臭素為唯一碳源培養液中的生長量Fig.1 Growth of strain Rp3 cultured in broth with skatole as sole carbon

2.2 最適生長碳氮源正交試驗結果

Rp3菌株懸液OD600與其活菌數CFU之間的標準曲線方程為y=3×109x-5×108，R2=0.971 3。對蔗糖、牛肉膏和酵母浸粉的正交試驗結果表明，各組分對Rp3菌株的活菌數影響排序為酵母浸粉＞牛肉膏＞蔗糖，經計算最優組合為A3B3C3，適宜Rp3菌株生長的碳氮源及用量為蔗糖16.0 g·L-1、牛肉膏14.0 g·L-1、酵母浸粉6.0 g·L-1（表1）。

表1 培養基各組分配比優化的正交試驗統計結果Table 1 Statistical results of orthogonal test for the optimization of the medium components

2.3 影響Rp3菌株生長和糞臭素降解的因素

2.3.1 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的碳氮源由圖2可知，Rp3菌株在L2-N培養液中的生長量顯著高于L2培養液（P＜0.05）；在L2-N和L2培養液中，Rp3菌株與100 mg·L-1糞臭素共培養24 h時，對糞臭素的降解率分別為81.5%±1.19%和85.9%±2.78%，差異不顯著（P＞0.05），說明在該糞臭素含量下，外源營養不影響Rp3菌株對糞臭素的降解。

圖2 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的碳氮源Fig.2 Carbon and nitrogen sources for strain Rp3 growth and skatole degradation

2.3.2 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的金屬離子如圖3所示，在含有100 mg·L-1糞臭素但去除Mg2+的L2培養液（CK）中，Rp3菌株基本不生長（OD600=0.13±0.01），顯著低于Mg2+存在時的生長量（P＜0.05），說明Mg2+為Rp3菌株降解糞臭素所必需的金屬離子。用Fe2+、Mn2+或Zn2+替換Mg2+時，Rp3菌株生長量顯著降低（P＜0.05），其中Rp3菌株在含有Zn2+的處理中生長量最低。在含有Mg2+的處理中，糞臭素的降解率高達95.5%，替換為Fe2+、Mn2+或Zn2+時3個處理糞臭素含量差異不顯著（P＞0.05），降解率均顯著低于加入Mg2+的處理（P＜0.05）。上述結果說明Mg2+對Rp3菌株降解糞臭素有重要作用，Fe2+、Mn2+、Zn2+這3種金屬離子雖然對糞臭素降解能力相似，但對Rp3菌株生長的影響不同，且50 mg·L-1的Zn2+明顯抑制了Rp3的生長。

圖3 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的金屬離子Fig.3 Metal ions for strain Rp3 growth and skatole degradation

2.3.3 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的溫度如圖4所示，隨著培養溫度的升高，Rp3菌株的生長量也隨之逐漸升高，呈顯著正相關趨勢（P＜0.05）；隨著溫度的升高，未接種Rp3菌株的L2培養液中糞臭素含量也有所下降，說明糞臭素有一定的揮發；但接種Rp3菌株后，隨著培養溫度升高，各處理中糞臭素降解率逐漸提高，溫度為28、35、40℃時，糞臭素的降解率分別為82.9%、93.2%和95.5%。

圖4 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的溫度Fig.4 Optical temperature for strain Rp3 growth and skatole degradation

2.3.4 Rp3菌株多次傳代后生長及降解糞臭素能力對初始菌株Rp3-0和傳代菌株Rp3-5、Rp3-10降解糞臭素能力進行測定，結果表明，培養24 h時，初始菌株Rp3-0和傳代菌株Rp3-5、Rp3-10對糞臭素的降解率均在80%以上，差異不顯著（P＞0.05）；培養48 h時，初始株菌Rp3-0和傳代菌株Rp3-5、Rp3-10對糞臭素的降解率均達100%（表3），說明糞臭素含量為100 mg·L-1時，傳代基本不影響Rp3菌株對糞臭素的降解能力。

3 討論

糞臭素是畜牧堆肥及廢水中臭氣形成的主要化合物之一[23]。近年來，利用微生物降解糞臭素已成為研究熱點，但不同因素對不同菌株降解效率的影響存在差異[15]。以往研究表明，外源營養物質是影響微生物降解有害物質的重要因素，外源營養物質缺乏常限制微生物生長及有機物的降解[24]。本研究中Rp3菌株不但能夠以糞臭素為唯一碳源，通過降解糞臭素為其自身生長提供碳源，而且在有適宜的外源營養供應時，仍能夠高效降解糞臭素，說明Rp3菌株對營養要求不苛刻，此特點非常有利于該菌株的開發和應用。除碳氮源外，金屬離子也影響微生物對有機物的降解效率[25]。鄧秀瓊[22]研究表明，金屬離子Fe2+、Mn2+和Zn2+能促進無色桿菌（Ach romobacter）DN-06對吡啶的降解；Ma等[26]研究表明，Fe2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+對IDO3菌株降解糞臭素無顯著影響。本研究發現Mg2+在Rp3菌株降解糞臭素過程中起著重要作用，Fe2+、Zn2+、Mn2+不能替代Mg2+，該結果與前人研究結果不一致[22,26]，分析原因可能與菌株降解酶特性有關，尚需進一步深入研究。

表2 Rp3初始菌株與傳代菌株生長和降解糞臭素能力比較Table 2 Comparison of the growth and skatole degrading ability between the initial and subculture strain Rp3

培養條件在有機污染物微生物降解過程中起著重要作用，其中溫度是重要的影響因子，但不同微生物降解糞臭素的適宜溫度不同，如伯克霍爾德菌屬（Burk h older i asp.）IDO3降解糞臭素的最佳溫度為30～35℃[26]，而短乳桿菌在37℃時對糞臭素的降解效果最好[10]。本研究發現，Rp3菌株在35和40℃時對糞臭素的降解能力優于28℃。雖然溫度升高時，糞臭素本身有一定揮發，但Rp3菌株處理的糞臭素含量下降更為顯著。一般情況下，細菌生長會隨溫度的升高而升高，但Rp3菌株在不添加糞臭素的L2培養液中不生長，因此推測Rp3菌株在35～40℃時生長量增加并不是因為溫度升高促進了Rp3的生長，而是因為該菌株隨著溫度的升高對糞臭素的降解能力提升，從而獲得了更多的碳源所致。紅球菌Rp3為本課題組前期從堆肥土壤中分離獲得的，而堆肥溫度通常高于正常環境，因此推測該菌株對高溫有一定的適應性，且溫度較高時，Rp3對糞臭素的降解率提高可能與該菌株本身的降解酶特性有關[12]。

微生物連續傳代培養后功能退化是工業生產中常見的問題，因此傳代穩定性常作為評價菌株是否具有工業化應用潛力的重要指標，不同菌株的傳代穩定性因菌株特性而存在差異，如α-苯乙胺降解菌P2在多次傳代后，其降解能力出現明顯的退化[18]；而干酪乳桿菌在去選擇壓力連續傳代培養后，其耐藥性并未發生改變[27]。本研究中Rp3菌株連續傳代10次后的降解能力并未出現退化，說明該菌株傳代穩定性好，具有良好的應用潛力。

綜上所述，本研究獲得了利于糞臭素降解菌Rp3生長的碳氮源為蔗糖、牛肉膏和酵母浸粉，金屬離子為Mg2+；明確了傳代不影響Rp3菌株對糞臭素的降解，說明Rp3菌株是易培養并具有良好傳代穩定性的糞臭素降解菌。研究結果為推動Rp3菌株應用于生產提供了理論依據。