上調lncRNA TUG1靶向miRNA-194-5p促進KIAA1199表達對結直腸癌細胞增殖侵襲和EMT的影響*

李海強，蔣紅鋼，沈徐寧，周 元

(浙江省嘉興市第一醫院胃腸外科 314000)

結直腸癌是全球第三大最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的第四大主要原因[1]。盡管在結直腸癌的診斷和治療方面取得了很大的進展，但由于復發、轉移和耐藥等原因，患者的預后仍不理想[2-3]。因此，迫切需要進一步研究結直腸癌進展的分子機制，尋找結直腸癌新的診斷和治療靶點。長鏈非編碼RNA (lncRNAs)是一組保守性較差的內源性RNA分子，其長度超過200 nt，且無編碼蛋白的能力[4-5]。研究發現，lncRNA作為調節因子參與了各種生理和病理過程，或作為癌基因或腫瘤抑制因子參與腫瘤的發生、發展[6-7]。牛磺酸上調基因1(TUG1)是一個7.6 kb的lncRNA，由22q12染色體上的ENSG00000253352基因編碼。TUG1在不同癌癥類型中表達明顯失調。在甲狀腺乳頭狀癌中，lncRNA TUG1通過靶向miRNA-145影響甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、遷移和上皮間質轉化(EMT)形成[8]。在胰腺癌中，lncRNA TUG1/EZH2軸通過海綿miRNA-382促進胰腺癌細胞增殖、遷移和EMT表型形成[9]。在卵巢癌中，lncRNA TUG1通過miRNA-186-5p/ZEB1軸促進卵巢癌細胞增殖、侵襲和干細胞增殖[10]。然而，TUG1是否能通過類似的機制調控結直腸癌的發生和進展仍不清楚。因此，本研究中旨在探討lncRNA TUG1在結直腸癌中的表達及其影響細胞增殖、侵襲和EMT的作用機制，為確定結直腸癌預后的有效生物標志物和有效治療靶點提供可能依據，也為闡明結直腸癌的病理生理基礎提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本組織

選擇本院2018年5月至2020年5月病理確診為結直腸癌并行腫瘤切除術的患者52例，男30例，女22例，年齡32～83歲，平均(58±8.13)歲。選取患者切除的新鮮癌組織及匹配的癌旁組織，將其冷凍并保存在液氮中。每例患者均獲得書面知情同意，并經本院倫理委員會批準。

1.1.2細胞及試劑

結直腸癌細胞SW480及其人正常結腸黏膜上皮細胞NCM460購自中國科學院上海細胞庫。改良Eagle培養基(DMEM)購自美國HyClone公司(貨號:SH30243.01B)。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及其細胞轉染

SW480及NCM460在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中保存。細胞株均在5% CO2培養箱，保持在37 ℃環境下生長。消化長滿的SW480細胞并鋪于6孔板，所有細胞轉染均按照說明書使用Lipofectamine 3000進行轉染，培養箱中放置48 h后取出收集樣品。

1.2.2SW480細胞分組

根據SW480細胞加入的siRNA NC、TUG1 siRNA、KIAA1199 siRNA序列將其分為siRNA NC組、TUG1 siRNA組、KIAA1199 siRNA組；根據SW480細胞轉染inhibitor不同將其分為inhibitor NC組和miRNA-194-5p inhibitor組；根據SW480細胞轉染mimics不同將其分為pcDNA-3.1++mimics NC組(A組)、pcDNA-TUG1+mimics NC組(B組)、pcDNA-3.1++miRNA-194-5p mimics組(C組)、pcDNA-TUG1+miRNA-194-5p mimics組(D組)。

1.2.3雙熒光素酶實驗分析lncRNA TUG1與miRNA-194-5p的相關性

將SW480細胞接種于24孔板(8 000個/孔)，將含有細胞周期蛋白D2(CCND2)野生型或突變3′UTR的100 ng psiCHECK2熒光素酶載體與100 nm miRNA-194-5p mimic或mimics NC共轉染。轉染48 h后，按照制造商的說明進行雙熒光素酶報告物檢測;腎素酶信號被歸一化為螢火蟲熒光素酶信號用于每個個體的分析。所有實驗重復2次。

1.2.4CCK-8法檢測SW480細胞活力

采用CCK-8檢測SW480細胞活力。取處于對數生長期的轉染細胞，以5×103個/孔的密度將其置于96孔板中。在培養箱中靜置2 d后，每個孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。使用酶標儀測定450 nm波長的吸光度(A)值，所有實驗均為3個重復。

1.2.5Transwell實驗檢測SW480細胞侵襲數目

使用涂有基質的Transwell室檢測細胞侵襲。將無血清培養基中的轉染細胞添加到Transwell室的上室中，600 μL含有10% FBS的DMEM培養基加入下室作為化學引誘劑。孵化后48 h，下室中的細胞層用5%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色5 min。PBS洗滌后，在倒置顯微鏡下，隨機選取每個樣品的5個區域，捕捉被侵襲細胞進行計算。

1.2.6RNA提取、反轉錄及其RT-qPCR檢測

使用TRIzol試劑從結直腸癌組織或細胞系中提取總RNA，使用NanoDrop 2000分光光度計(Wilmington,USA)測量RNA的純度和濃度，按照制造商的說明使用逆轉錄試劑盒進行反轉錄，然后在ABI 7900Real-Time PCR系統(Applied Biosystems,Foster City,USA)下，使用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Roche,Basel,Switzerland)進行定量，GAPDH為內參，2-ΔΔCt法分析結果。重復3次實驗。引物如下，lncRNA TUG1上游引物：5′-CCA GAC CCT CAG TGC AAA CT-3′；下游引物：5′-CAA TCA GGA GGC ACA GGA C-3′。miRNA-194-5p上游引物：5′-ACA CTC CAG CTG GGT GTA ACA GCA ACT CC-3′；下游引物：5′-TGG TGT CGT GGA GTC G-3′。KIAA1199 上游引物：5′-GCT TAC CCC AAG TTC ACC GA-3′；下游引物：5′-AGT GCT GCT TGG AAC TCT CC-3′。GAPDH上游引物：5′-CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG-3′；下游引物：5′-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA G-3′。

1.2.7Western blot分析細胞內EMT相關蛋白和KIAA1199蛋白表達

(1)從結直腸癌細胞中提取蛋白，在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離，然后轉移到PVDF膜(Bio-Rad)上。將PVDF膜與5%脫脂牛奶孵育90 min，阻斷非特異性結合。(2)將PVDF膜與一抗孵育，包括抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和抗GAPDH，于4 ℃過夜孵育。用Tris-HCl鹽加Tween緩沖液(TBST)洗滌PVDF膜后，用辣根過氧化物酶偶聯的二抗在37 ℃下孵育。最后使用ECL-plus檢測系統對蛋白進行可視化檢測。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組組織及細胞中TUG1、miRNA-194-5p及KIAA1199的表達水平比較

與癌旁組織比較，結腸癌組織中TUG1及KIAA1199表達水平明顯升高(P<0.01)，miRNA-194-5p表達水平明顯下降(P<0.05)；與NCM460細胞比較，SW480細胞中TUG1及KIAA1199表達水平明顯升高(P<0.01)，miRNA-194-5p表達水平明顯下降(P<0.01)，見表1。

表1 各組組織及細胞中TUG1、miRNA-194-5p及其KIAA1199的表達水平比較

2.2 siRNA NC組與TUG1 siRNA組SW480細胞的增殖、侵襲及EMT相關蛋白表達水平比較

與siRNA NC組比較，TUG1 siRNA組SW480細胞內TUG1表達水平及細胞增殖活力明顯下降(P<0.01)，細胞侵襲數目明顯減少(P<0.01)；SW480細胞內N-cadherin、Vimentin表達水平明顯下降(P<0.01)，E-cadherin表達水平明顯升高(P<0.01)，見圖1、表2。

A：CCK-8檢測；B：Transwell檢測(×200)；C:Western blot檢測；a:P<0.01,與siRNA NC組比較。

表2 siRNA NC組與TUG1 siRNA組SW480細胞增殖活力、侵襲數目和EMT相關蛋白表達水平比較

2.3 lncRNA TUG1與miRNA-194-5p的關系

生物學信息軟件miRcode預測TUG1和miRNA-194-5p之間可能的結合位點，見圖2。與TUG1 wt+mimics NC組相比，TUG1 wt+miRNA-194-5p mimics組細胞熒光素酶活性明顯下調(1.14±0.52vs.0.37±0.08，t=3.297，P=0.087)，與TUG1 mut+mimics NC組相比，TUG1 mut+miRNA-194-5p mimics組細胞熒光素酶活性無明顯變化(1.23±0.05vs.1.26±0.12，t=1.137，P=0.36)。

圖2 檢測lncRNA TUG1與miRNA-194-5p的結合位點

2.4 inhibitor NC組與miRNA-194-5p inhibitor組SW480細胞的增殖、侵襲及EMT相關蛋白表達水平比較

與inhibitor NC組比較，miRNA-194-5p inhibitor組SW480細胞內miRNA-194-5p表達水平明顯下調(P<0.01)，增殖活力明顯上升(P<0.05)，細胞侵襲數目明顯(P<0.01)；SW480細胞內N-cadherin、Vimentin表達明顯上調(P<0.01)，E-cadherin表達明顯下調(P<0.01)，見圖3、表3。

A：CCK-8檢測；B：Tranwell檢測(×200)；C:Western blot檢測；1:inhibitor NC組;2:miRNA-194-5p inhibitor組;a:P<0.05,與inhibitor NC組比較。

表3 inhibitor NC組與miRNA-194-5p inhibitor組SW480細胞增殖活力、侵襲數目和EMT相關蛋白表達水平比較

2.5 4組SW480細胞的增殖、侵襲及EMT相關蛋白表達水平比較

與A組比較，B組細胞增殖活力明顯升高(P<0.01)，細胞侵襲數目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin表達水平明顯升高(P<0.01)，E-cadherin表達水平明顯下降(P<0.01)；C組細胞增殖活力明顯下降(P<0.01)，細胞侵襲數目明顯減少(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin表達明顯下降(P<0.01)，E-cadherin表達水平明顯升高(P<0.01)。與C組比較，D組細胞增殖活力明顯上升(P<0.01)，細胞侵襲數目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin表達水平明顯升高(P<0.01)，E-cadherin表達明顯下降(P<0.01)，見圖4、表4。

A:CCK-8檢測;B:Transwell檢測(×200);C:Western blot檢測;a:P<0.01，與A組比較;b:P<0.01,與C組比較。

表4 4組SW480細胞增殖活力、侵襲數目和EMT相關蛋白表達水平比較

2.6 4組SW480細胞KIAA1199表達水平比較

與A組比較，B組細胞內KIAA1199基因和蛋白表達明顯上調(P<0.01)，C組細胞內KIAA1199基因和蛋白表達明顯下調(P<0.01)；與C組比較，D組細胞內KIAA1199基因和蛋白表達明顯上調(P<0.01)，見表5、圖5。

表5 4組SW480細胞KIAA1199基因及其蛋白表達水平比較

A:RT-qPCR檢測;B:Western blot檢測;a:P<0.01,與A組比較;b:P<0.01,與C組比較。

2.7 siRNA NC組與KIAA1199 siRNA組SW480細胞的增殖、侵襲及EMT相關蛋白表達水平比較

與siRNA NC組比較，KIAA1199 siRNA組SW480細胞內KIAA1199表達水平及細胞增殖活力明顯下降(P<0.05)，細胞侵襲數目明顯減少(P<0.01)；SW480細胞內N-cadherin、Vimentin表達水平明顯下降(P<0.01)，E-cadherin表達水平明顯升高(P<0.01)，見圖6、表6。

A：CCK-8檢測；B：Transwell檢測(×200)；C:Western blot檢測；a:P<0.05,與siRNA NC組比較。

表6 siRNA NC組與KIAA1199 siRNA組SW480細胞增殖活力、侵襲數目和EMT相關蛋白表達水平比較

3 討 論

結直腸癌是我國癌癥相關死亡的第四大原因，在我國呈快速上升趨勢。而局部和全身轉移是結直腸癌患者預后不良的主要原因。因此，有必要探討結直腸癌轉移的分子機制。本研究結果顯示，lncRNA TUG1、miRNA-194-5p和KIAA1199在結直腸癌增殖、侵襲及EMT過程中發揮了關鍵作用。較高水平的TUG1可直接與成熟的miRNA-194-5p結合并作為生物海綿，從而促進結直腸癌細胞的增殖、侵襲和EMT。此外，TUG1可靶向miRNA-194-5p調控KIAA1199的表達。本文在TUG1/miRNA-194-5p/KIAA1199通路對結直腸癌細胞發展的調控機制研究中，發現TUG1是一種很有前途的結直腸癌治療靶點和有用的生物標志物。

近年來，已被許多研究證實，lncRNA的異常調節參與了幾乎所有人類癌癥的發病機制，表明lncRNA可以作為致癌基因或腫瘤抑制因子在人類癌癥的發生和進展中發揮作用。TUG1首次被發現并被認為是一種新的視網膜非編碼RNA，TUG1可以與生長相關基因相互作用，并在各種惡性腫瘤中作為關鍵的致癌基因發揮作用。XU等[11]研究發現，lncRNA TUG1可加重前列腺癌的進展，預測預后不良。WANG等[12]研究表明，lncRNA TUG1通過TUG1/miRNA-145-5p/trpc6通路促進結直腸癌細胞的生長和遷移。本研究結果顯示，TUG1在結直腸癌中上調，并在結直腸癌細胞增殖、侵襲和EMT中發揮關鍵作用。此外，siRNA下調TUG1在SW480細胞中的表達后，明顯抑制了SW480細胞的增殖、侵襲和EMT發生，這些結果支持了TUG1沉默可有效降低結直腸癌細胞的腫瘤發生，對確定新的治療靶點，促進結直腸癌的臨床治療具有重要意義。

TUG1被認為通過作為ceRNA調控某些靶點(如miRNA)，在多種人類癌癥的發生和進展中發揮作用。TUG1作為miRNA海綿，可與miRNA-29a、miRNA-128-3p、miRNA-498等多種miRNA結合，進一步影響這些miRNA某些靶基因的表達，從而影響腫瘤細胞的生物學行為[13-15]。本研究結果顯示，TUG1可靶向結合miRNA-194-5p，上調TUG1通過miRNA-194-5p可促KIAA1199表達及SW480細胞增殖、侵襲及EMT。如miRNA-194-5p通過靶向E2F3抑制膀胱癌細胞遷移和侵襲[16]。下調miRNA-194-5p通過改變鼠雙微體2(MDM2)的表達誘導卵巢癌細胞對紫杉醇耐藥[17]。miRNA-194-5p在結直腸癌細胞和腫瘤組織中的表達經常降低，并發揮抑瘤作用，這與其他癌癥一致。此外，本研究數據也證實了lncRNA TUG1通過靶向miRNA-194-5p調控KIAA1199表達。有文獻報道KIAA1199在人類癌癥和癌細胞發展中起重要作用[18]。KIAA1199作為胃癌藥物治療新靶點具有重要的臨床意義[19]。KIAA1199通過PI3K-Akt介導的EMT促進非小細胞肺癌的侵襲和遷移[20]。ZHAO等[21]研究發現，KIAA1199通過PP2A/stathmin通路調控的微管不穩定促進結直腸癌細胞轉移。本研究結果顯示，KIAA1199在結直腸癌中上調，KIAA1199 siRNA轉染SW480細胞后，可明顯抑制SW480細胞的惡性發展。

綜上所述，TUG1在結直腸癌中明顯上調，TUG1的激活可能參與結直腸癌的進展。在結直腸癌中，TUG1通過作為miRNA海綿沉默miRNA-194-5p來調節KIAA1199，從而促進結直腸癌細胞增殖、侵襲和MET。本研究結果對于闡明TUG1/miRNA-194-5p/KIAA1199通路在結直腸癌發生、發展中的確切作用和分子機制有促進作用。