抗CD47抗體Hu5F9真核表達載體構建與表達

范 蓓 張靜靜 邢體坤 劉 偉 王 斌 宋路萍 安文琪

1.華蘭生物工程股份有限公司研發部，河南新鄉 453000；2.河南晟明生物技術研究院有限公司重組細胞室，河南新鄉453500；3.華蘭基因工程有限公司質量控制部，河南新鄉 453500；4.華蘭基因工程有限公司研發部，河南新鄉 453500

白細胞分化抗原47（cluster of differentiation，CD47）是一種膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，在正常細胞與腫瘤細胞中普遍表達。腫瘤細胞通過大量表達CD47，與巨噬細胞表面的抑制性免疫受體信號調節蛋白α（signal regulatory protein α, SIRPα）結合，抑制其吞噬作用，從而產生免疫逃逸，在腫瘤發生發展過程中表現出至關重要的作用。Hu5F9 是一種抗CD47 抗體，通過與CD47 結合，有效增強了巨噬細胞對癌細胞的吞噬作用，同時研究人員通過將互補決定區移植到人IgG4 支架上使其獲得人源化改造，對人CD47 有較好的親和力，并在體內多種腫瘤模型中表現出有效的抗腫瘤活性。哺乳動物細胞具有類似人源細胞的翻譯后修飾，例如蛋白的糖基化等，因此相較于細菌、酵母、植物和昆蟲等宿主細胞，哺乳動物細胞更適合表達重組蛋白藥物。中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）是最常用的哺乳動物表達系統，能夠在無血清、無蛋白的條件下進行高密度懸浮培養，可以避免血清的復雜組分的影響，提升了生產的安全性、 穩定性及法規方面的便利性，更加適合大批量工業化生產應用。同時CHO 內源性蛋白分泌較少，也更利于分離純化目的蛋白。目前，針對SIRPα-CD47 信號通路，已有多款藥物正在研究開發中，其中以Hu5F9 進度最快，研究最為全面，國內也有多家企業布局CD47 項目。本研究選用CHO-S系統來表達Hu5F9 重組蛋白，旨在為CD47 抗體藥物的研究開發提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

pUC57-Hu5F9-H 和pUC57-Hu5F9-L 為生工 生物工程（上海）股份有限公司合成；pCGS3 空載質粒為華蘭生物構建保存；CHO-S 細胞為本實驗保存。

1.2 主要試劑

DH5α 大腸感受態（B528413）、瓊脂粉（A505255）、Protein A 蛋白純化試劑盒（C600048-0001）購自生工生物工程公司；細胞所用培養基（A29100-01、12309-019-1L）、轉染試劑盒（A29129-1L、1962735）等購自Gibco 公司；蛋白胨（LP0044T）購自OXOID 公司；酵母粉（212750）購自BD公司；內切酶Hind Ⅲ（R0104V）、Pac I（R0547S）、BstB Ⅰ（R0519S）和Xho Ⅰ（R1064V）購自NEB 公司；高保真預混酶GXL Premix（R051S）、DNA 連接試劑盒（6022Q）購自Takara 公司；蛋白預制膠（M00653）、染色試劑盒（L00687R）、電泳液（M00138）、上樣緩沖液（M00676、MB01015）購自金斯瑞公司；蛋白marker（26616）、Western blot 檢測試劑（34577）購自賽默飛公司；Anti-Human IgG Fc specific（A0170-1ML）購自SIGMA 公司。

1.3 儀器設備

搖床（HYG-A）購自太倉實驗設備廠；臺式離心機（1-15PK）購自德國賽多利斯；潔凈工作臺（SWCJ-2FD）購自蘇州安泰空氣技術有限公司；PCR 反應擴增儀（S1000）購自BIO-RAD 公司；紫外儀（WD-9403C）、電泳儀（DYY-10C）、電泳槽（DYCP-31DN）購自北京六一生物科技有限公司； 蛋白染色儀（eStain L1）、快速濕轉儀（eBlot 1）購自金斯瑞公司；凝膠成像系統（AlphaImager HP）、全自動成像分析系統購自ProteinSimple 公司；超微量分光光度計（NanoDrop ONE）Thermo Fisher 公司；垂直電泳槽（X Cell sure）購自Invitrogen 公司；金屬?。═hermo mixer）、離心機（5804R）購自Eppendorf 公司；細胞計數儀（Countstar Altair）購自上海睿鈺公司；CO疊加式恒溫振蕩器（IS-RDS6C）購自CRYSTAL 公司。

1.4 基因合成

根據世衛組織公布的Hu5F9 重鏈和輕鏈的氨基酸序列（CAS：2169232-81-7），設計引入酶切位點、Kozak序列（GCCACC）和信號肽（MGWSCIILFLVATATGVHS），交由生工生物公司針對CHO 細胞進行密碼子優化并合成堿基序列（pUC57-Hu5F9-H 和pUC57-Hu5F9-L）。

1.5 載體構建

表達載體為實驗室保存的pCGS3 質粒，合成質粒與載體質粒經過限制性內切酶處理后回收目的基因及載體片段，將目的基因依次連接至pCGS3 載體質粒，并轉化大腸桿菌感受態細胞，涂板倒置培養過夜，次日挑選陽性菌落提取質粒進行雙酶切驗證，并送生工生物公司進行基因測序。

1.6 細胞瞬時轉染及培養

轉染前1 天，對傳代擴增CHO-S 細胞進行細胞計數，待細胞達到合適的密度時進行分種稀釋并培養過夜。次日使用新鮮的表達培養基預熱至37℃后將細胞進一步稀釋，使用預冷試劑配制ExpiFectamineTM CHO/質粒DNA 復合物，室溫孵育復合物1～5 min，緩慢加入到細胞懸液中，混勻后培養18～22 h 后，加入增強劑和輔料，繼續培養5 d 后，第2 次添加輔料至培養瓶中繼續培養，轉染后8～10 d，在細胞活率≥75%時，收集細胞上清進行檢測。

1.7 蛋白電泳及純化

取適量樣品加入上樣緩沖液（還原/非還原），充分混勻后95℃孵育10 min，取預制膠上樣進行電泳，結束后用蛋白染色儀快速染色脫色，置于凝膠成像系統中拍照。

將需純化的蛋白樣品加入超濾管中，重復離心收集蛋白濃縮液，將蛋白濃縮液與Binding/Wash buffer等比例混勻，用針頭濾器過濾。將混勻的蛋白濃縮液加入純化柱，收集流穿液，用Binding/Wash buffer 清洗柱子同樣收集流穿液，使用超微量分光光度計測量流穿液中蛋白濃度，待流穿液吸光度接近基線時，用Elution buffer 洗脫蛋白并收集，取樣測定濃度并進行SDS-PAGE 檢測。

1.8 Western blot 鑒定

取適量樣品加入上樣緩沖液（還原/非還原），充分混勻后95℃孵育10 min，取預制膠上樣進行電泳，結束后用蛋白染色儀快速染色脫色。取PVDF 膜放入甲醇中浸泡1 min，倒掉甲醇加入平衡液浸泡2 min，打開轉膜夾，按照海綿墊-膜-凝膠-海綿墊的順序放好，合上轉膜夾，插入轉膜儀進行轉膜。

轉膜結束后，將膜浸泡在5%脫脂奶粉中，4℃浸泡過夜，棄掉脫脂奶粉，加入洗滌液重復洗滌3 次，將膜浸泡在抗人源Fc 抗體稀釋液中，搖床上緩慢搖晃孵育1 h，加入洗滌液，重復洗滌3 次，將配置好的顯色液（A 液∶B 液=1∶1）加至膜上，避光反應5 min，晾至半干，使用全自動成像分析系統拍照保存圖像。

2 結果

2.1 獲取目的基因及載體

目的基因Hu5F9-H 長度為1392 bp，共編碼463個氨基酸，分子量為50.9 kD，Hu5F9-L 基因長度為717 bp，共編碼238 個氨基酸，分子量為25.9 kD。

合成質粒pUC57-Hu5F9-H 和pUC57-Hu5F9-L雙酶切后回收的目的條帶大小與預期符合（圖1）。

圖1 目的基因回收結果

2.2 真核表達載體的構建與驗證

將酶切得到的目的片段回收后，先將Hu5F9-H連接至pCGS3 載體，進行雙酶切驗證及基因測序，驗證結果正確后，再連接Hu5F9-L，同樣進行酶切驗證及基因測序，實驗結果表明真核表達載體構建成功見圖2、圖3（封三）。

圖2 雙酶切驗證

圖3 測序峰圖

2.3 目的基因的真核表達

將構建好的真核表達載體轉入CHO-S 細胞中表達，培養數天后，取細胞上清進行SDS-PAGE檢測（圖4）。檢測結果顯示非還原條件下在180 kD附近出現特異性條帶，下方有一條雜帶，推測為輕鏈部分斷裂。還原條件下在50 kD 和30 kD 處出現兩條特異性條帶，與Hu5F9 抗體的重鏈和輕鏈大小相符。

圖4 SDS-PAGE 檢測目的蛋白

2.4 純化目的蛋白

利用Fc 標簽純化目的蛋白，經SDS-PAGE 檢測發現，非還原條件下在180 kD 出現特異性條帶，為Hu5F9 全抗分子，其下方存在多條特異性條帶，分析抗體分子可能存在輕鏈不同程度的斷裂。還原條件下在50 kD 和30 kD 出現兩條特異性條帶，分別對應抗體的重鏈和輕鏈，條帶大小符合預期（圖5）。

圖5 蛋白純化結果

2.5 重組蛋白Western blot 鑒定

利用重鏈上的人源Fc 標簽進行Western blot 鑒定，發現非還原條件下，重、輕鏈聚合，全抗分子理論大小為153.6 kD，鑒定結果顯示在80～180 kD 處有多條特異性條帶，表明可能出現輕鏈不同程度的斷裂。還原條件下，重、輕鏈解聚，重鏈單獨與Fc 抗體結合，在55 kD 附近有單一條帶，與重鏈大小相符（圖6）。實驗結果表明Hu5F9 重組蛋白在CHO-S 細胞中成功表達。

圖6 Western blot 鑒定結果

3 討論

巨噬細胞對靶細胞的吞噬作用受激活信號（FcγR、CRT、LRP-1）和抑制信號（SIRPα-CD47）的平衡調節，但癌細胞通過上調CD47 的表達，使大量的CD47 與免疫細胞表面的SIRPα 受體結合，通過傳遞出一種“不要吃我”的信號來逃避免疫系統?？笴D47抗體能阻斷CD47-SIRPα 信號通路，激活巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，同時能夠增強抗原呈遞細胞對腫瘤抗原的呈遞作用，激活免疫T 細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷，這種機制為靶向CD47 的腫瘤免疫治療藥物開發提供了充分的理論基礎。

此前研究報告了一種新的抗CD47 抗體分子Hu5F9-G4，能夠在體外有效地誘導巨噬細胞對原代人類急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）細胞吞噬作用，并在體內完全根除人AML 細胞，展現出極佳的抗癌治療潛力。有研究報道，Hu5F9-G4 與利妥昔單抗聯用，在治療彌漫性大B 細胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤的臨床試驗結果中表現出良好的抗腫瘤效果。曲妥珠單抗是一種靶向抗人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）單克隆抗體，用于治療HER2 陽性乳腺癌，能夠顯著提高早期HER2 陽性乳腺癌患者生存率，但晚期患者容易產生耐藥性而導致復發，而近期研究結果表明，Hu5F9-G4 與曲妥珠單抗聯用能克服耐藥性的限制，增強HER2 陽性乳腺癌的抗腫瘤療效。

SIRPα-CD47 靶向藥物正在成為癌癥免疫治療方向的熱點，除了Hu5F9 外，還有多個抗體分子正在開發中，例如抗SIRPα 抗體TTI-621、CD47 拮抗劑ALX-148以及另一個抗CD47 抗體B6H12等，其中最具臨床價值的還是Hu5F9，已有多個臨床試驗正在進行中。但是不斷有研究表明，因CD47 在紅細胞上的表達，使得Hu5F9 對紅細胞具有一定的毒害作用，可能會導致一系列血液系統方面的不良反應，臨床應用面臨一定的安全風險。這些風險無疑限制了Hu5F9 的開發應用，目前臨床試驗大都通過與其他靶點藥物聯用，改進給藥方式或者開發雙特異性抗體等方法來避免大劑量直接給藥，以減輕其不良反應。因此，如何平衡CD47 靶向藥物的有效性和安全性仍需要進一步的研究。

盡管Hu5F9 仍存在一些問題，但其在抗CD47 抗體藥物研發中仍極具參考價值，目前未見有Hu5F9真核表達方法等相關報告，本研究根據世界衛生組織公布的Hu5F9 氨基酸序列，構建真核表達載體，利用CHO-S 表達系統，在瞬時轉染條件下成功地獲得了抗CD47 抗體Hu5F9 的重組蛋白，為后續CD47 藥物的開發研究工作提供實驗依據。