糖尿病腎病患者腸道菌群及炎癥因子變化的臨床意義

郭世強 劉春林 吳清念

1.華南理工大學附屬第六醫院臨床科研中心實驗室，廣東佛山 528200；2.華南理工大學附屬第六醫院檢驗科，廣東佛山 528200

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellius，T2DM）是以胰島素抵抗和胰島素分泌不足的病理生理為基礎的內分泌代謝性疾病，糖尿病腎病是其常見的慢性并發癥，由于糖尿病腎病疾病進程快且缺少有效的干預手段，已成為終末期腎病的主要病因。T2DM 和腸道菌群關系密切，而腸道菌群會通過對腎素-血管緊張素系統產生影響，進而影響腎臟功能。研究證實，相比健康對照，糖尿病腎病患者腸道菌群存在失衡，表現厚壁菌門比例下降、擬桿菌門比例上升，同時腸道菌群介導炎癥的發生，加劇了腎功能的惡化。然而關于糖尿病腎病患者腸道菌群如何變化以及與炎癥因子的關聯性研究報道較少。基于此，本研究分析糖尿病腎病患者腸道菌群及其炎癥因子的變化，為臨床干預提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至12月在華南理工大學附屬第六醫院住院治療的101 例T2DM 患者作為研究對象，根據24 h 尿白蛋白排泄率（24 h urinary albumin excretion rate，UAER）分成A 組（UAER≤30 mg/24 h，糖尿病正常蛋白尿，n=49）、B 組（30 mg/24 h300 mg/24 h，糖尿病腎病，n=22），同期選擇25 例健康者作為D 組。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準（2019056），所有患者知情并簽署知情同意書。納入標準：患者符合2016年美國糖尿病協會發布的《糖尿病醫學診療標準》。排除標準：①有慢性腎臟疾病、慢性腸道疾病、腹部手術史者；②30 d 內使用抗生素者；③年齡<18 歲者。

1.2 方法

通過醫院病歷系統收集研究對象基線特征包括年齡、性別、病程、體重指數（body mass index，BMI）等；實驗室相關檢查結果空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），試劑由北京利德曼生化有限公司提供，檢測儀器為日立7600；糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c），檢測儀器為HA-8180-日本愛科來糖化血紅蛋白儀HA-8180 及其配套試劑等。

1.3 炎癥因子檢測

抽取研究對象清晨空腹靜脈血3 ml，以離心力1000 g 離心10 min，吸取500 μl 血清于EP 管并放置-70℃冰箱保存。白介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測采用酶聯免疫吸附法，酶標儀為安圖生物PHNOMO 型，全部操作均嚴格按試劑盒說明書進行（購于武漢博迪萊莎生物科技有限公司）。

1.4 腸道菌群分析

采用傳統細菌培養方法，參照文獻光岡法，對雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、梭菌屬四種腸道菌群進行定量培養。稱取研究對象5 g 新鮮糞便，加入生理鹽水稀釋，標本按照10 倍稀釋呈梯度系列至10。將標本接種在雙歧桿菌培養基、乳桿菌培養基、擬桿菌培養基、梭菌培養基上，分別放入普通培養箱（35℃，48 h）和厭氧培養箱（35℃，48～72 h）進行培養。根據菌落特征、菌體形態和革蘭染色并結合質譜儀將細菌鑒定到屬或種水平，由本單位微生物實驗室提供MALDITOF MS 質譜儀（布魯克-道爾頓公司）。根據平板菌落計數和稀釋度，按照公式（CFU/ml）=（標本質量+稀釋量）/標本質量×稀釋度×菌落數。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 研究對象基線特征

四組的年齡、性別和BMI 比較，差異無統計學意義（P>0.05）。D 組的FBG 和HbA1c 水平低于A 組、B組和C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A 組、B 組和C 組的FBG 和HbA1c 水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。C 組的糖尿病病程長于A 組和B 組，差異有統計學意義（P<0.05），A 組和B 組的糖尿病病程比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。

表1 研究對象基本特征比較（±s）

2.2 四組腸道菌群的比較

C 組的雙歧桿菌和梭菌屬低于A 組、B 組和D 組，差異有統計學意義（P<0.05）。C 組的乳桿菌低于D 組，差異有統計學意義（P<0.05）。A 組、B 組和D組的雙歧桿菌、乳桿菌和梭菌屬比較，差異無統計學意義（P>0.05）。四組的擬桿菌比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表2）。

表2 四組腸道菌群的比較（lgCFU/g 濕便，±s）

2.3 四組炎癥因子水平的比較

D 組的IL-6 和TNF-α 水平低于A 組、B 組和C組，差異有統計學意義（P<0.05）；C 組的IL-6 和TNF-α 水平高于A 組、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B 組的IL-6 和TNF-α 水平高于A 組，差異有統計學意義（P<0.05）（表3）。

表3 四組炎癥因子水平的比較（ng/L，±s）

2.4 腸道菌群與炎癥因子相關性分析

雙歧桿菌和梭菌屬與IL-6 和TNF-α 水平呈負相關（P<0.05）；乳桿菌和擬桿菌與炎癥因子水平無顯著相關性（P>0.05）（表4）。

表4 腸道菌群與炎癥因子的相關性

3 討論

腸道菌群與糖尿病腎病的發生發展有著密切關系。本研究結果顯示，糖尿病腎病患者包括雙歧桿菌、乳桿菌和梭菌在內的腸道益生菌群顯著減少，同時也表明益生菌群數量與炎癥因子表達有關。本研究采用光岡法對擬桿菌、梭菌、乳桿菌以及雙歧桿菌等四類與人類健康密切相關優勢菌群進行分析，結果發現糖尿病腎病患者的雙歧桿菌、 乳桿菌和梭菌屬顯著下降。據孫雅嫻報道，與無腎病的糖尿病患者相比，糖尿病腎病患者的腸道乳桿菌減少。暴旭廣等采用高通量測序技術分析腸道菌群，發現T2DM 和糖尿病腎病患者包括產短鏈脂肪酸的毛螺旋菌屬、 柔嫩梭菌屬和羅斯菌屬等腸道菌群顯著減少。類似本研究腸道菌群的分析方法，李雷等報道，相比T2DM 組，糖尿病腎病組的雙歧桿菌和真桿菌數量顯著降低。但上述研究者并沒有進一步將糖尿病腎病分層比較。本研究結果顯示，A 組、B 組和D 組的雙歧桿菌、乳桿菌和梭菌屬比較，差異無統計學意義（P>0.05）。據報道，腸道雙歧桿菌和柔嫩梭菌等益生菌可以發酵膳食纖維產生短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），參與單磷酸腺苷活化蛋白激酶和過氧化物酶體增殖物激活受體γ 信號通路，調控糖異生和脂肪合成。SCFAs 還可作為信號轉導分子激活G 蛋白偶聯受體（G protein coupled receptors，GPR），促進腸道分泌胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和肽YY（pepetide tyrosine tyrosine，PYY），增強胰島素敏感性改善糖、脂和膽汁酸代謝水平，提示有益菌群的減少加劇了糖尿病腎病的進展。

本研究結果顯示，炎癥因子IL-6 和TNF-α 水平隨著糖尿病腎病嚴重程度逐漸升高。據報道，糖尿病腎病患者存在低度炎癥反應，一方面革蘭氏陰性菌脂多糖經由Toll 受體2 和Toll 受體4 相關途徑介導宿主的炎癥反應，并通過激活核因子（nuclear facor-κB，NF-κB）誘導促炎細胞因子釋放，TNF-α、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）和IL-6，產生炎癥級聯反應，加劇腎臟損害。Winther 等分析不同分期1 型糖尿病腎病患者代謝物指標，發現三甲胺N 氧化物、硫酸吲哚酚和對甲酚硫酸鹽等代謝物與尿蛋白含量顯著相關。本研究結果還顯示，雙歧桿菌和梭菌屬與IL-6 和TNF-α 水平呈負相關（P<0.05），提示腸道有益菌的減少可能是導致血清炎癥指標上升的原因，與其他報道基本一致。補充益生菌、保持腸道微生態結構和功能完整性或可作為延緩糖尿病腎病進展的新策略。

綜上所述，腸道菌群與糖尿病腎病患者關系密切，腸道菌群失調可影響糖尿病及糖尿病腎病的進展。改變飲食結構、補充益生菌等可能有助于恢復腸道菌群平衡。