正交試驗優(yōu)選頭痛方水提工藝*

鄭粵文 ，陳秋谷 ，張尚斌 ，張志強 ，周國莉 ，吳紅彥 △，陳劍平

（1. 廣東省深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518001； 2. 上海中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518001；3. 廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院，廣東 深圳 518033； 4. 廣東省深圳市中醫(yī)院·深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點實驗室，廣東 深圳 518033）

頭痛方以川芎為君藥，葛根、白芷、北柴胡為臣藥，白芍、醋延胡索、丹參、僵蠶、天麻、蔓荊子為佐藥，炙甘草為使藥，有疏風、通絡、活血止痛之效，主治氣陰虧虛、痰瘀阻絡型頭痛。該方以湯劑長期應用于臨床，療效確切，但煎煮服用和攜帶不便，難以適應現(xiàn)代生活需要。因此，本研究中擬將頭痛方轉化為服用方便、質量可控、療效確切的中成藥產品，以更廣泛應用。中藥復方制劑成分復雜，理化性質各異，從藥材來源到加工制備工藝過程，其中每個環(huán)節(jié)均可能影響或改變中藥制劑的藥效物質基礎［1］，而這些因素會影響臨床療效的一致性。為了強化整個生產過程的質量控制，建立產品全生命周期質量追溯系統(tǒng)，本研究中基于高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究，采用正交試驗法對頭痛方的水提工藝進行了優(yōu)選，為該方的后續(xù)新藥或新劑型藥物研發(fā)奠定基礎。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030型高效液相色譜儀，AUW220D型電子分析天平（精度為十萬分之一），均購自日本Shimadzu公司。

1.2 試藥

沒食子酸對照品（批號為110831 - 201605，含量90.8%），葛根素對照品（批號為110752-201615，含量95.4%），大豆苷對照品（批號為111738-201603，含量93.3%），阿魏酸對照品（批號為110773-201614，含量99.0%），丹酚酸B 對照品（批號為111562 - 201917，含量96.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；3′-羥基葛根素對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq18020905，含量＞98%）；甲醇、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

川芎（批號為191101741）、白芷（批號為191200229）、醋延胡索（批號為191001901）、僵蠶（批號為191000059）、葛根（批號為 191201）、天麻（批號為191201681）、炒白芍（批號為191200249）、炙甘草（批號為191102971）、丹參（批號為190801921）、蔓荊子（批號為190803681）、北柴胡（批號為190814061a）飲片，均購自康美藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 HPLC 圖譜共有峰主成分綜合評分的計算

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Waters XSelect Hss T3柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～90 min 時5%A→ 48%A）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：0～63 min 時250 nm，63～90 min 時321 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.1.2 溶液制備

取沒食子酸、3′-羥基葛根素、葛根素、大豆苷、阿魏酸、丹酚酸B對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解制成質量濃度分別為20，50，250，60，20，25 μg/ mL 的系列混合對照品溶液。按3 倍處方量稱取1.2 項下各藥材飲片，煎煮提取，濾過，合并濾液，濃縮至1 000 mL，精密量取濃縮液1 mL，加30%乙醇定容至5 mL，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

取2.1.2 項下供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，考察方法的精密度；并分別于室溫下放置 0，2，4，8，12，16，24 h 時進樣測定，考察供試品溶液穩(wěn)定性；取2.1.2 項下同批濃縮液，按2.1.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，考察方法的重復性。結果精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗中各主要色譜峰峰面積（或含量）的RSD均小于2.0%。

2.1.4 主成分分析

導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）分析，共匹配14 個共有峰。采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對14 個共有峰的峰面積進行因子分析，結果見表1、表2。根據(jù)主成分的提取原則，取特征值大于1的成分作為提取主成分。由表1 可知，主成分1 的累積貢獻率及對應特征值均遠高于其他主成分。由表2 可知，14 個共有峰在主成分1 上均有較高載荷，說明所提取的主成分可基本反映全部指標的信息。

表1 主成分貢獻統(tǒng)計結果（%）Tab.1 Variance contribution rate of the principal components（%）

表2 主成分因子載荷矩陣Tab.2 Factor load matrix of the principal components

2.1.5 共有峰主成分綜合評分計算［2］

由公式Fi=a1X1+a2X2+ … +ajXm（a為特征向量，由成分因子載荷矩陣中的第j 列載荷除以對應成分特征值的算術平方根所得，X為原始指標），計算得出F1主成分的表達式。將原始指標進行標準化處理。由公式F=C1F1+C2F2+…+CiFi（C為各主成分得分系數(shù)，由主成分特征值除以提取主成分總特征值所得）得，綜合評分F=F1。

2.2 主要成分含量測定

2.2.1 溶液制備

取3′-羥基葛根素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解制成質量濃度分別為0.396，2.003，0.406，0.164 mg/ mL 的單一對照品貯備液。

2.2.2 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取2.2.1項下各單一對照品貯備液適量，置2 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL分 別 含 3′ - 羥 基 葛 根 素 8.712，21.780，43.560，54.450，65.340，76.230 μg，葛根素 40.832，102.080，204.160，255.200，306.240，357.280 μg，大 豆 苷10.150，25.375，50.750，63.438，76.125，88.813 μg，丹酚酸B 4.920，9.840，19.680，24.600，29.520，46.320 μg的系列混合對照品溶液，分別精密吸取10μL，按2.1.1項下色譜條件測定，以質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，3′-羥基葛根素為Y1= 47 936.7X1- 70 348（r= 0.999 2，n= 6）；葛根素為Y2=48 162.4X2+224 867（r=0.999 7，n=6）；大豆苷為Y3=45 451.8X3+88 408.9（r=0.999 3，n=6）；丹酚酸 B 為Y4= 21 210.6X4- 52 051.3（r= 0.999 0，n=6）。結果表明，3′- 羥基葛根素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B 質量濃度分別在8.712～76.230 μg/mL、40.832～357.280 μg/ mL、10.150～88.813 μg/ mL、4.920～46.320μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度、穩(wěn)定性、重復性及加樣回收試驗：取2.1.2項下供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，考察方法的精密度；并分別于室溫下放置0，2，4，8，12，16，24 h 時進樣測定，考察供試品溶液的穩(wěn)定性；取2.1.2 項下同批濃縮液，按2.1.2 項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，考察方法的重復性；取9 份已知含量的濃縮液約0.5 mL，按質量比 1∶0.5，1∶1，1∶1.5 加入各成分對照品適量，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗中3′-羥基葛根素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B峰面積的RSD均小于3.0%，平均加樣回收率分別為 98.76%，99.27%，101.52%，102.93%，RSD分別為2.46%，1.73%，1.49%，2.04%（n=9）。

2.2.3 含量測定

取供試品溶液適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品總含量。

2.3 總固形物質量測定

精密吸取2.1.2 項下濃縮液50 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，100 ℃水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻0.5 h，迅速稱定質量，按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0831 干燥失重測定法測定，計算總固形物質量。

2.4 正交試驗設計與結果

結合頭痛方中醫(yī)方解理論及臨床藥理活性研究［3-8］，以共有峰主成分綜合評分、4 個主成分總含量、總固形物質量加權系數(shù)分別為0.3，0.4，0.3 的總評分為評價指標，加水量（因素A）、煎煮時間（因素B）和煎煮次數(shù)（因素C）為考察因素，采用L9（34）正交試驗法優(yōu)選頭痛方水提工藝［9］。因素水平見表3，正交試驗設計及結果見表4，方差分析結果見表5。由表4、表5 可知，頭痛方的最佳水提工藝為A3B2C3，各因素對提取效果的影響大小為C ＞A ＞B，但3 個因素對水提工藝結果均無明顯影響。為節(jié)約能源，提高提取效率，選擇提取工藝為A1B1C3，即加8倍量水，煎煮3次，每次1.0 h。

表3 因素與水平Tab.3 Factors and their levels

表4 正交試驗設計及結果Tab.4 Design and results of the orthogonal test

表5 方差分析結果Tab.5 Results of the ANOVA

2.5 驗證試驗

稱取3倍處方量各藥材飲片，按最佳水提工藝進行提取，同法計算總評分，結果見表6。3 批驗證試驗的平均總評分為96.78 分，RSD為0.35%，且各評價指標的RSD均小于1%，表明本試驗所優(yōu)選的工藝穩(wěn)定，重復性好，可作為頭痛方的水提工藝。

表6 驗證試驗結果Tab.6 Results of the verification test

3 討論

目前，我國中藥復方多以單一性指標成分含量和干膏率為評價指標進行提取工藝篩選［10-12］。但中藥復方中各味藥材所含成分復雜多樣，藥效作用來源于多種成分的配伍。我國中藥復方新藥質量標準控制已采用指紋圖譜技術、多成分測定、一測多評或指紋圖譜技術結合多成分測定/一測多評等分析手段［13-14］，但以單一性指標成分含量和干膏率為評價指標進行提取工藝篩選，已不能適應和滿足中藥復方現(xiàn)代化改革創(chuàng)新的需要，故本研究中將指紋圖譜技術和多成分測定引入提取工藝篩選，運用正交試驗法設計科學、合理、可靠的工藝方案，從不同角度有效地控制、提升產品的質量。在工藝研究過程中建立指紋圖譜和多成分測定方法，還可為后期中間體和成品的質量標準控制提供依據(jù)，以期建立一個系統(tǒng)的、動態(tài)的質量控制體系，實現(xiàn)中藥及其產品整個生產過程的質量控制、質量傳遞與質量追溯。

本研究中的高效液相色譜圖譜中共匹配了14個共有色譜峰，并指認出其中6 個。由于處方中成分的含量和紫外吸收程度各不相同，所建指紋圖譜的各個色譜峰的峰面積大小不一，指紋圖譜的模糊性易忽略各關鍵工藝參數(shù)對色譜峰1，2，3，5，7，13等含量較低成分的影響，若僅以指紋圖譜共有峰的峰面積總和作為關鍵質量屬性，仍無法全面考察提取工藝。主成分分析可根據(jù)實際需要提取較少的綜合變量，以盡可能反映原有變量信息，是一種科學有效的降維方法［15］，可解決指紋圖譜模糊性導致成分權重系數(shù)失重的弊端。因此將指紋圖譜研究和主成分分析結合，既可從整體上判斷各關鍵工藝參數(shù)對藥物成分的影響，又可從局部兼顧含量較低的藥效成分［16］。在此基礎上，本研究選擇分離度大于1.5 的4 種成分作為定量測定指標，其中3′-羥基葛根素、葛根素、大豆苷為方中臣藥葛根中的黃酮類成分，現(xiàn)代藥理學研究表明，葛根的總黃酮對偏頭痛、血管性頭痛及高血壓引起的頭痛、耳鳴、頭暈、項強等癥狀有顯著療效，尤以緩解頭痛、項強為著［2-4］；而丹酚酸B作為丹參的生物活性成分，具有多種藥理活性，對心血管、腦、肝臟、糖尿病腎病等疾病均有較好的保護作用［5-7］。故本研究中選取此4 個成分的總含量作為水提工藝的關鍵質量屬性。

綜上所述，本研究中結合中藥復方提取工藝特點及中藥復方配伍，采用正交試驗法，以多指標綜合的總評分為考察指標，加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)為考察因素，優(yōu)選出的頭痛方水提工藝穩(wěn)定、可行，可為該方的后續(xù)新藥研發(fā)奠定基礎。