松果菊苷對人肺癌HCC827 細胞增殖、凋亡和遷移的影響*

李 猛，楊 力，朱建勇，尹義平，郭雅君

（湖北省十堰市人民醫院·湖北醫藥學院附屬人民醫院呼吸與危重癥醫學中心，湖北 十堰 442000）

肺癌是最常見癌癥，其中約有83%為非小細胞肺癌（NSCLC）［1］。雖然手術、化學藥物治療（簡稱化療）、放射治療（簡稱放療）、免疫治療等方案均可在一定程度上改善NSCLC 患者的預后，但對于腫瘤發生轉移者，其5 年相對生存率僅約15%［2］。松果菊苷屬苯乙醇苷類化合物，具有清除氧自由基、抑制炎癥和調節免疫等藥理活性［3］。松果菊苷能誘導乳腺癌細胞凋亡，同時抑制急性髓系白血病細胞增殖，但其對肺癌作用的研究較少［4-5］。上皮 -間充質轉化（EMT）與惡性腫瘤的遷移和侵襲密切相關，雖有大量研究揭示了EMT 在NSCLC 進展中的作用，但調控EMT 的分子機制尚未明確［6］。轉化生長因子-β1（TGF-β1）通過經典的Smad 信號或非典型信號傳導，成為NSCLC EMT 和轉移的驅動因素［7］。在TGF - β1信號通路中，TGF - β1通過結合TGF - βⅠ型受體（TβRⅠ）激活信號，進而通過磷酸化激活Smad 2和Smad 3，被激活的Smad2 和Smad3 進一步與Smad 4相互作用，激活或抑制其靶基因（如SNAIL）［8］。本研究中探討了松果菊苷對人肺癌HCC827 細胞增殖和遷移的影響，以及TβRⅠ/ Smad 信號通路在整個過程中的作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：3000T 型 CO2培養箱（美國 Thermo Revco 公司）；Sunrise型全自動酶標儀（瑞士Tecan公司）；CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；BD FACSCanto 型流式細胞儀、Stepone 型Real - time PCR 擴增儀和Mini Protean 3型BD垂直電泳儀（美國ABI公司）。

試藥：松果菊苷（蘇州潤新生物科技有限公司，批號為82854-37-3，純度 98%）；DMEM 培養基、胎牛血清（美國Hyclone 公司）；四氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國 Amresco 公司；AnnexinV/ PI 細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，批號為0220496）；Trizol（美國Invitrogen 公司，批號為170933）；基質金屬蛋白酶 - 9（MMP - 9）、mRNA 反轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）試劑盒（寶生物工程＜大連＞有限公司，批號分別為20210376，20211208）；RIPA裂解液（北京索萊寶生物技術公司，批號為SL059332）；TβRⅠ、Smad 2、Smad 3 和β - actin（美國 Santa Cruz 公司，批號分別為210383，210315，210564，211206）；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗鼠免球蛋白（IgG，美國Abcam公司，批號為AB21054372）。

細胞：人肺癌HCC827細胞（中國科學院細胞庫）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組

在37 ℃及5% CO2條件下，用含10%胎牛血清的DMEM 培養基培養HCC827 細胞，隔天換液。實驗分為陰性對照組（等體積培養基）、陽性對照組（順鉑80μmol/L）及松果菊苷低、中、高劑量組（實驗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ組，20，40，80 μmol/L）。

1.2.2 觀察指標及檢測

細胞增殖能力：采用MTT 法。取對數生長期細胞，接種于96 孔板（每孔3× 103個），在37 ℃及5%CO2條件下，每孔以0（對照），5，10，20，40，80，160 μmol/L 松果菊苷或0（對照），5，10，20，40，80，160，320 μmol/ L 順鉑孵育24 h，加入MTT（每孔20 μL），繼續培養4 h，棄上清液，加入DMSO（每孔200 μL）振蕩10 min，以酶標儀在570 nm波長處測定吸光度值（OD值），平行測定3次，并計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=OD用藥組/OD對照組×100%。以增殖率為50%時的藥品質量濃度為半數致死濃度（LC50）。

細胞遷移能力：采用細胞劃痕法。取各組對數生長期細胞，接種于6 孔板中（每孔1× 106個），以100μL 滅菌槍頭在單層細胞上呈“一”字劃痕，將細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗劃痕。各組以相應藥液孵育24 h，從每個劃痕傷口中隨機選擇5個視野，顯微鏡下觀察，以圖像分析儀測量劃痕寬度。劃痕越寬，表明細胞遷移能力越弱。

細胞凋亡情況：采用流式細胞術。取各組對數生長期細胞，接種于 6 孔板中（每孔1 × 106個），孵育細胞24 h，預冷PBS 洗滌，離心棄上清液，用Annexin V Binding Solution（1 ×）調整細胞密度為1 × 106/mL，懸浮于400μL V-FITC 溶液中，黑暗中室溫孵育15 min，加入PI 10 μL，4 ℃避光孵育5 min，以流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并計算凋亡率。

MMP-9，TβRⅠ，Smad 2，Smad 3 mRNA表達水平：采用qPCR 法。取各組對數生長期細胞，接種于6孔板中（每孔1×106個），孵育細胞24 h，用預冷PBS洗滌，離心棄上清液，用Trizol提取總RNA，反轉錄制備cDNA。PCR反應條件為，95 ℃預變性10 s；94 ℃變性15 s，40個循環；55 ℃退火30 s；70 ℃延伸30 s 終止反應。以 2-△△Ct法計算MMP-9，TβRⅠ，Smad 2，Smad 3 mRNA 的相對表達量。各組設3個復孔，實驗重復3次。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer′s sequence

TβRⅠ，Smad 2，Smad 3 蛋白表達水平：采用Western blot法。取各組對數生長期細胞，接種于6孔板中（每孔1× 106個），孵育細胞24 h，用預冷PBS 洗滌，離心棄上清，加入RIPA 裂解液裂解2 h，離心取上清，電泳，轉到聚偏二氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封閉 1 h，將膜與 TβRⅠ（1∶400）、Smad 2（1∶200）、Smad 3（1∶300）和 β - actin（1∶1 000）抗體孵育，4 ℃過夜，將HRP 標記山羊抗鼠 IgG（1∶10 000）在室溫下孵育30 min，顯色，采集圖像，利用Image J 軟件分析目的條帶與內參條帶灰度比值，即為各目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 細胞增殖能力和LC50

隨著松果菊苷濃度的增加（10～160 μmol / L）與0 μmol/L 比較，細胞增殖率顯著降低（P＜ 0.05）。當松果菊苷濃度為40μmol/L 時，增殖率約為50%，LC50為（47.50±6.21）μmol/L，故選擇40μmol/L為松果菊苷干預濃度。隨著順鉑濃度的增加（10～320 μmol/ L）與0 μmol/L 比較，細胞增殖率顯著降低（P＜ 0.05），當順鉑濃度為 80 μmol/ L 時，增殖率約為 50%，LC50為（76.85 ± 14.89）μmol/L，故選擇80 μmol/L 為順鉑干預濃度。結果見表2。

表2 松果菊苷及順鉑對HCC827細胞增殖的影響（，%，n=3）Tab.2 Effects of echinacoside and cisplatin on the proliferation of HCC827 cells（，%，n=3）

表2 松果菊苷及順鉑對HCC827細胞增殖的影響（，%，n=3）Tab.2 Effects of echinacoside and cisplatin on the proliferation of HCC827 cells（，%，n=3）

注：與0 μmol/L比較，#P ＜ 0.05。Note：Compared with those at 0 μmol/L，#P ＜ 0.05.

序號松果菊苷濃度（μmol/L）F值P值順鉑濃度（μmol/L）F值P值1 2 3 4 5 6 7 8 0 5 1 0 0 5 1 0 20 40 80 160細胞增殖率（%）100.00±12.43 97.25±8.68 84.56±2.59#69.40±8.10#55.29±8.13#29.62±6.07#5.41±1.41#64.813＜0.00120 40 80 160 320細胞增殖率（%）100.00±8.28 95.28±3.39 85.11±4.43#73.20±5.21#62.16±5.27#47.26±4.46#26.58±5.84#7.17±1.83#52.142＜0.001

2.2 細胞遷移和凋亡情況

與陰性對照組比較，陽性對照組及實驗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ組細胞遷移距離縮短，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。詳見表3和圖1、圖2。

圖1 HCC827細胞遷移情況Fig.1 The migration of HCC827 cells

圖2 HCC827細胞凋亡情況Fig.2 The apoptosis of HCC827 cells

2.3 細胞中mRNA 及蛋白表達水平

與陰性對照組比較，陽性對照組及實驗Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ組細胞中TβRⅠ，Smad 2，Smad 3 mRNA 及蛋白表達水平均顯著降低（P＜ 0.05）。詳見表3。

表3 各組HCC827細胞遷移、凋亡情況及細胞中mRNA和蛋白表達水平比較（，n=3）Tab.3 Comparison of migration，apoptosis and the mRNA and protein expression levels of HCC827 cells in each group （，n=3）

表3 各組HCC827細胞遷移、凋亡情況及細胞中mRNA和蛋白表達水平比較（，n=3）Tab.3 Comparison of migration，apoptosis and the mRNA and protein expression levels of HCC827 cells in each group （，n=3）

注：與陰性對照組比較，*P ＜0.05。Note：Compared with those in the negative control group，*P ＜ 0.05.

組別mRNA 蛋白濃度（μmol/L）0 80 20 40 80 HCC827細胞遷移距離（μm）38.15±4.59 16.52±3.49*31.10±4.58*24.29±3.61*19.54±2.39*15.841＜0.001 Smad 3 0.47±0.05 0.16±0.05*0.39±0.08*0.31±0.04*0.23±0.05*14.620＜0.001細胞凋亡率（%）0.16±0.06 1.14±0.34*0.21±0.05*0.32±0.06*0.83±0.09*27.306＜0.001陰性對照組陽性對照組實驗Ⅰ組實驗Ⅱ組實驗Ⅲ組F值P值TβRⅠ1.00±0.10 0.43±0.08*0.91±0.04*0.82±0.05*0.61±0.12*12.637＜0.001 Smad 2 1.00±0.06 0.16±0.05*0.76±0.08*0.60±0.15*0.37±0.09*25.339＜0.001 Smad 3 1.00±0.05 0.38±0.06*0.84±0.09*0.69±0.04*0.53±0.07*19.205＜0.001 TβRⅠ0.53±0.08 0.12±0.03*0.33±0.05*0.25±0.07*0.18±0.04*23.352＜0.001 Smad 2 0.41±0.05 0.09±0.02*0.29±0.04*0.20±0.05*0.14±0.02*26.173＜0.001

3 討論

松果菊苷可通過誘導肝癌細胞凋亡抑制肝癌進展，對胰腺癌、乳腺癌等腫瘤細胞也有抑制作用［9］。研究發現，松果菊苷通過抑制EMT，進而抑制急性髓系白血病細胞體外遷移［4］，但松果菊苷對HCC827 細胞的抗轉移作用尚未見報道。本研究中，松果菊苷以劑量依賴的方式抑制HCC827 細胞的遷移和增殖，并誘導其凋亡；同時，松果菊苷可抑制TβRⅠ/Smad 信號通路，作用雖無順鉑強，但潛在副作用較低。

EMT 在腫瘤細胞轉移早期起著至關重要的作用，因為細胞失去黏附，獲得了更強的遷移和侵襲能力，向遠處組織擴散。EMT 的調控涉及多種信號通路，其中TGF- β 信號通路較典型［10］。TGF- β 主要由白細胞介素4（IL-4）或白細胞介素13（IL-13）刺激免疫細胞分泌，也可由TGF - β 激活的Ⅱ型肺泡上皮細胞、成纖維細胞、細胞外基質釋放［11］。TβRⅠ與TβR Ⅱ結合形成一種能識別并結合配體的復合物（TGF - β）。TGF - β 可上調TβRⅠmRNA 和蛋白表達，誘導細胞內TβRⅠ肽磷酸化，激活細胞內信號轉導，包括Smad 通路和非Smad 通路的信號轉導［12］。在 TβRⅠ / Smad 通路中，激活TβRⅠ使Smad 2/3 磷酸化水平升高，并與Smad 4 結合形成 Smad 2/3-4 復合物［13］。Smad 7 屬 Smad 通路拮抗劑，它可抑制Smad 2/3 的磷酸化和Smad 2/3-4 復合物的形成，并且抑制TGF - β 下調［14］。Smad 2/ 3 - 4復合物隨后易位進入細胞核，作為轉錄因子，導致纖維化轉錄因子上調［15］。靶向 TβRⅠ的抑制劑，如 LY -2157299、EW7197、SD - 208 和 SB431542，成功地抑制了臨床前模型和Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗中的腫瘤進展［16］。本研究結果顯示，松果菊苷可降低HCC827細胞中TβRⅠmRNA 和蛋白表達水平，并抑制Smad 2 和Smad 3 mRNA 和蛋白表達，表明松果菊苷具有抑制HCC827 細胞增殖和遷移的作用。

此外，TβRⅠ也可直接激活非Smad信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶/ c - Jun 氨基末端激酶（MAPK/JNK）、MAPK/p38和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，可直接或間接調控細胞凋亡［17］。在MAPK/ JNK 和MAPK/ p38 信號通路中，體外結果顯示，經 SP - 600125 處理 24 h 后也降低了 JNK 和 p38 的磷酸化水平，誘導腫瘤細胞凋亡［18］。同時，SD - 208 對MAPK/ JNK 和MAPK/ p38 信號通路的抑制作用被SB203580 處理逆轉［19］。本研究結果顯示，松果菊苷可誘導HCC827 細胞凋亡，這可能與TβRⅠ可直接激活非Smad 信號通路有關，但本研究中未對TβRⅠ非smad 信號通路進行研究，后續將持續完善。

綜上所述，松果菊苷可抑制HCC827 細胞增殖及遷移，并促進細胞凋亡，機制可能與其抑制TβRⅠ/Smad信號通路激活有關。