近紅外漫反射光譜法快速鑒別養(yǎng)胃顆粒*

陳 晴，楊 陽(yáng)，趙娜娜，葛 媛，張?zhí)m萍，畢 云，朱 斌

（徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮海醫(yī)院·中國(guó)人民解放軍陸軍第七十一集團(tuán)軍醫(yī)院藥劑科，江蘇 徐州 221004）

近紅外漫反射光譜（NIRDRS）法是將光譜測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)和基礎(chǔ)測(cè)試技術(shù)有機(jī)結(jié)合的分析方法［1］，可依據(jù)不同化學(xué)結(jié)構(gòu)藥品的近紅外吸收光譜特征不同，通過(guò)比較待測(cè)樣品光譜與參照光譜的差異進(jìn)行鑒別。檢測(cè)時(shí)，樣品基本無(wú)須預(yù)處理，且不破壞樣品、不消耗化學(xué)試劑、不造成環(huán)境污染，具有分析快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，固液氣樣品均適用，以及可同時(shí)分析多種化學(xué)成分等優(yōu)點(diǎn)，被美國(guó)藥典、歐洲藥典、英國(guó)藥典及中國(guó)藥典等收載［2-3］。目前，NIRDRS 法已廣泛應(yīng)用于食品成分和質(zhì)量控制［4］、農(nóng)作物谷物質(zhì)量評(píng)價(jià)［5］、現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和鑒別假藥［6］、制劑定性定量分析［7］及中藥鑒定和含量測(cè)定［8-9］等分析技術(shù)領(lǐng)域，可提高藥品篩查效率和抽樣針對(duì)性［10-11］。養(yǎng)胃顆粒由黃芪、延胡索、白芍、威靈仙、海螵蛸、甘草等10 味中藥組方，有溫中散寒、理氣止痛功效［12］，可抗胃潰瘍及鎮(zhèn)痛［13-14］。為進(jìn)一步拓展其質(zhì)量控制方法，本研究中建立了快速、準(zhǔn)確鑒別養(yǎng)胃顆粒的NIRDRS 法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

Vector 22/N 型傅里葉變換近紅外光譜儀，配有光纖探頭和漫反射積分球（光譜范圍13 330～4 000 cm-1、波數(shù)精度0.01 cm-1），購(gòu)自德國(guó)Bruker公司。

1.2 藥品

養(yǎng)胃顆粒正品23 批（由本院藥劑科制劑室提供，規(guī)格為15 g / 袋），編號(hào)（#01 至#23）與批號(hào)見(jiàn)表1。另取缺黃芪及海螵蛸的養(yǎng)胃顆粒偽品2 批（編號(hào)分別為#24、#25）。

表1 養(yǎng)胃顆粒正品樣品編號(hào)與批號(hào)Tab.1 Number and batch number of genuine Yangwei Granules samples

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

掃描范圍為近紅外光譜區(qū)（12 000～4 000 cm-1）；掃描次數(shù)為64次；分辨率為8 cm-1，以儀器內(nèi)置背景為參比。進(jìn)行21點(diǎn)平滑濾設(shè)預(yù)處理，平行測(cè)定5次。

2.2 光譜采集

取各批次樣品粉末（過(guò)80 目篩）適量，直接裝入測(cè)量用西林瓶中（覆蓋瓶底厚度約1 cm）。按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件采集光譜，用光纖探頭輕抵西林瓶瓶底，隨機(jī)在瓶底不同部位重復(fù)測(cè)定5次。光譜見(jiàn)圖1。

圖1 各批次養(yǎng)胃顆粒樣品近紅外漫反射光譜圖Fig.1 NIRDRS spectra of different batches of Yangwei Granules samples

2.3 一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ驮囼?yàn)

2.3.1 建立方法

建模樣品訓(xùn)練集選擇：采用23 批正品樣品的平均光譜作為建模樣品訓(xùn)練集，建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

建模譜段和預(yù)處理方法：選擇特征譜段8 545～3 727.7 cm-1；預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合矢量歸一化（導(dǎo)數(shù)化可消除基線漂移等因素帶來(lái)的影響，矢量歸一化可消除光程或樣品厚度帶來(lái)的影響［15-16］）；設(shè)定平滑點(diǎn)數(shù)21個(gè)，進(jìn)行平滑預(yù)處理；設(shè)定一致性指數(shù)（CI）值限度為5.00。

檢驗(yàn)集選擇：選擇全部樣品的平均光譜作為檢驗(yàn)集。

2.3.2 模型建立與檢驗(yàn)

根據(jù)2.3.1項(xiàng)下建模條件，建立養(yǎng)胃顆粒的一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ停斠?jiàn)圖2。一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)正品及偽品樣品的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。可見(jiàn)，參與建模的#23樣品的NIRDRS 處于CI區(qū)間范圍內(nèi)，而#24、#25 樣品的CI值分別為-12.26，9.81，其結(jié)果溢出近紅外光譜所在區(qū)間。由此說(shuō)明，#24、#25 樣品與正品樣品主成分有顯著差異，可判定#24、#25樣品為假藥或劣藥。

圖2 養(yǎng)胃顆粒的一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ虵ig.2 The conformity test model of Yangwei Granules

圖3 養(yǎng)胃顆粒正品及偽品的一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蜋z測(cè)結(jié)果Fig.3 Test results of genuine Yangwei Granules and fake ones by the conformity test model

2.4 相關(guān)系數(shù)模型試驗(yàn)

2.4.1 建立方法

建模樣品訓(xùn)練集選擇：同2.3.1項(xiàng)下方法建立相關(guān)系數(shù)模型。

建模譜段和預(yù)處理方法：選擇譜段12 000～4 000 cm-1；設(shè)定相關(guān)系數(shù)閾值為0.95；余同2.3.1項(xiàng)。

檢驗(yàn)集選擇：選擇部分正品樣品（編號(hào)見(jiàn)表2）及偽品樣品（#24、#25）的平均光譜作為檢驗(yàn)集。

表2 養(yǎng)胃顆粒部分正品和偽品樣品之間的相關(guān)系數(shù)Tab.2 Correlation coefficient between partial genuine samples Granules and fake ones

2.4.2 模型建立與檢驗(yàn)

根據(jù)2.4.1項(xiàng)下建模條件，建立養(yǎng)胃顆粒的相關(guān)系數(shù)模型并進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)集樣品相互之間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。#01 和#24 樣品的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，樣品之間的相關(guān)系數(shù)，正品間均大于0.95，正品和偽品間均小于0.95，表明正品與偽品的相關(guān)系數(shù)限度設(shè)置為0.95可行。

圖4 養(yǎng)胃顆粒的近紅外漫反射光譜相關(guān)性圖譜Fig.4 The correlation NIRDRS spectra of Yangwei Granules

3 討論

近紅外光譜分析方法屬弱信號(hào)分析范疇，在快速鑒別中藥、中成藥真?zhèn)畏矫婢哂忻黠@優(yōu)勢(shì)［17］。任何藥品成分或輔料發(fā)生改變，均能在NIRDRS 中體現(xiàn)［18］。本研究中有針對(duì)性地選擇并制備了處方缺黃芪、缺海螵蛸的養(yǎng)胃顆粒偽品樣品，黃芪、海螵蛸均為方中君藥，且海螵蛸處方用量最大，黃芪處方用量次之，故使用缺黃芪、缺海螵蛸處方進(jìn)行偽品驗(yàn)證具有一定的代表性和實(shí)用性。

一致性檢驗(yàn)為簡(jiǎn)單便捷的譜圖比較方法，通過(guò)設(shè)定合理的CI值限度建立一個(gè)吸光度值合理波動(dòng)的置信區(qū)間，再通過(guò)比較譜圖中每個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)處的吸光度值，判斷圖譜一致性［19］。CI值限度應(yīng)根據(jù)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)定，并通過(guò)嚴(yán)格的試驗(yàn)條件研究藥品質(zhì)量變化與CI值變化的關(guān)系［20］。若待測(cè)樣品每一波長(zhǎng)處的吸光度均位于該區(qū)間內(nèi)，表現(xiàn)為待測(cè)光譜的CI值小于設(shè)定的CI值限度，即待測(cè)樣品光譜與參考樣品光譜具有一致性，則待測(cè)樣品通過(guò)一致性檢驗(yàn)，可判定待測(cè)樣品與參考樣品之間無(wú)差異。建立NIRDRS 一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ停軐?duì)測(cè)試集樣品作出準(zhǔn)確無(wú)誤的判別分類［21］。建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蜁r(shí)，注意訓(xùn)練集樣品數(shù)量應(yīng)多于20個(gè)批次，以保證模型穩(wěn)定，能更加全面、客觀地反映樣品的實(shí)際情況，降低誤判率。本研究中采用了23個(gè)批次的正品樣品作為訓(xùn)練集樣品建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ停Y(jié)果模型中最大CI值約為3.00，低于設(shè)定的CI值限度5.00，表明采用的正品一致性較好，各批次間差異較小，其制劑工藝固定，制劑生產(chǎn)較規(guī)范。經(jīng)檢測(cè)，養(yǎng)胃顆粒偽品與正品可明顯識(shí)別區(qū)分，且通過(guò)模型判斷正偽品準(zhǔn)確無(wú)誤。

相關(guān)系數(shù)法是一種簡(jiǎn)單易行的質(zhì)量判別方法［22］，其通過(guò)在選定的譜段范圍內(nèi)比較待測(cè)樣品光譜與參考樣品光譜，得到相關(guān)系數(shù)（相似度越高，其值越接近1），以判斷待測(cè)樣品與參考樣品在某種性質(zhì)上是否一致［23］。如果測(cè)定的相關(guān)系數(shù)值大于設(shè)定的閾值，即待測(cè)樣品通過(guò)相關(guān)系數(shù)檢測(cè)，可判定待測(cè)樣品與參考樣品之間無(wú)差異。相關(guān)系數(shù)法對(duì)光譜數(shù)量不作要求，建立相關(guān)系數(shù)模型時(shí)，應(yīng)充分利用近紅外光譜的指紋特性，有針對(duì)性地選擇對(duì)活性化學(xué)成分或輔料變化高度敏感的光譜區(qū)域，計(jì)算相關(guān)系數(shù)并比較相似程度。本研究中偽品與正品樣品的相對(duì)系數(shù)均約為0.90，但考慮到模型傳遞、操作者、測(cè)定儀器及測(cè)定環(huán)境等易產(chǎn)生誤差，加之樣品為復(fù)方中藥制劑，中藥材成分復(fù)雜且來(lái)源質(zhì)量可能存在批次差異，均會(huì)影響模型的穩(wěn)定性，故略提高閾值，設(shè)定為0.95。結(jié)果顯示，該模型方法簡(jiǎn)單易行，閾值合理，能較好地區(qū)分養(yǎng)胃顆粒正品及偽品。

關(guān)于兩種模型的異同點(diǎn)，采用一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ汀⑾嚓P(guān)系數(shù)模型進(jìn)行分析，均無(wú)須花費(fèi)大量時(shí)間收集大量代表性樣品的訓(xùn)練集構(gòu)建定性定量模型，僅需建立一定數(shù)量的特定參考光譜并設(shè)定合理的閾值，通過(guò)比較指紋圖譜之間的差異，實(shí)現(xiàn)真?zhèn)嗡幤返目焖勹b別。兩種分析模型在藥品真?zhèn)闻袆e上具有高度的一致性，其鑒別能力相似。若建模樣品具有一定的差異性和不確定性，應(yīng)多采集代表性光譜，使用一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ停蝗艚悠穬?nèi)部差異較小，則可采集少量代表性光譜，使用相關(guān)系數(shù)模型。

本研究中納入養(yǎng)胃顆粒正品樣品23 個(gè)、偽品樣品2 個(gè)，數(shù)量較少，可能導(dǎo)致模型代表性不佳，下一步需繼續(xù)收集更多批次的養(yǎng)胃顆粒正品，加大樣本量，進(jìn)一步優(yōu)化更新模型。此外，在后續(xù)工作中，還要驗(yàn)證缺其他單味中藥、或缺多味中藥（除黃芪、海螵蛸）等多樣化的偽品光譜，以進(jìn)一步確證本法的適用性，確保所建模型足夠穩(wěn)定、精準(zhǔn)。

綜上所述，本研究中采用NIRDRS 法結(jié)合一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ汀⑾嚓P(guān)系數(shù)模型對(duì)中藥復(fù)方制劑養(yǎng)胃顆粒進(jìn)行定性質(zhì)量控制，其操作可行、方法可靠，能快速、準(zhǔn)確地鑒別養(yǎng)胃顆粒的真?zhèn)巍?/p>