高效液相色譜法同時測定濕潤燒傷膏中12 種成分含量

庹 婭，劉小衛(wèi)，蔣 蕾

（重慶市南川區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，重慶 408400）

濕潤燒傷膏是由黃連、黃柏、黃芩、地龍及罌粟殼制成的軟膏劑，呈淺棕黃色至深棕黃色，具有麻油香氣，具有清熱解毒、止痛和生肌等功效，臨床主要用于各種燒、燙、灼傷的治療。臨床藥理學研究表明，其還對壓瘡、濕疹及糖尿病性皮膚潰瘍有較好療效［1-4］。濕潤燒傷膏收載于國家藥品標準［WS3- 043（Z - 005）-2002（Z）］，其中僅要求對鹽酸小檗堿及黃芩素進行定量檢測。目前，尚未見濕潤燒傷膏中有效成分含量的相關(guān)研究。為此，本研究中建立了測定濕潤燒傷膏中5 種黃酮類化合物（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A）及7 種生物堿類成分（黃柏堿、木蘭花堿、黃連堿、表小檗堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀）含量的高效液相色譜（HPLC）法，為該制劑質(zhì)量評價及標準提升提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；AB135 - S 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SK8210 HP 型超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

濕潤燒傷膏（汕頭市美寶制藥有限公司，批號分別為 190805，190806，191101，191202，200504，200508，200701，200802，200803，200805，規(guī)格為每支40 g）；鹽酸巴馬汀對照品（批號為110732 - 201812，含量97.6%），鹽酸黃柏堿對照品（批號為111895-201805，含量94.9%），鹽酸黃連堿對照品（批號為112026 -201802，含量94.0%），鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-201613，含量86.8%），鹽酸藥根堿對照品（批號為110733-201609，含量89.5%），黃芩苷對照品（批號為110715 - 201821，含量95.4%），漢黃芩苷對照品（批號為112002-201501，含量98.9%），黃芩素對照品（批號為111595-201607，含量98.5%），漢黃芩素對照品（批號為111514-201605，含量96.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；鹽酸表小檗堿對照品（批號為PB0043），氯化木蘭花堿對照品（批號為PX0026），均購自成都普利斯生物科技有限公司，含量均大于98%；千層紙素A 對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為100826，含量98%）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。黃連（批號為200510）、黃柏（批號為20201005）、黃芩（批號為191103）、地龍（批號為20190912）、罌粟殼（批號為201101 - 1）飲片均購自安徽亳州藥材大市場，經(jīng)重慶市南川區(qū)中醫(yī)醫(yī)院胡沈星副主任藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

5 種黃酮類成分：色譜柱為Phenomenex Luna C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）- 0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min 時8%A→18%A，5～12 min時18%A，12～20 min時18%A→25%A，20～32 min時25%A → 40%A，32～50 min 時40%A → 55%A，50～60 min 時 55%A，60～70 min 時 55%A → 8%A）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為275 nm；柱溫為35 ℃；進樣量為10μL。

7種生物堿類成分：色譜柱為Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動相為0.02 mol/ L 磷酸二氫鉀溶液（磷酸調(diào)pH 至4.0）- 乙腈（65∶35，V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為345 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為4.970，1.250，1.014，0.249，0.258 mg/ mL的混合對照品貯備液Ⅰ；精密量取1 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得混合對照品溶液Ⅰ。分別取鹽酸黃柏堿、氯化木蘭花堿、鹽酸黃連堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.839，3.479，7.634，3.956，2.495，25.547，7.276 mg/mL的混合對照品貯備液2，精密量取1 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得混合對照品溶液Ⅱ。

供試品溶液：取樣品約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）處理60 min，放冷，濾過，再次稱定質(zhì)量，用水飽和正丁醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按濕潤燒傷膏處方工藝及比例，分別制得缺黃芩和缺黃連、黃柏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，分別制成缺黃芩的陰性對照品溶液Ⅰ和缺黃連及黃柏的陰性對照品溶液Ⅱ。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：精密吸取2.2項下各溶液適量，按2.1項下相應(yīng)色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液Ⅰ和Ⅱ色譜相應(yīng)位置有吸收峰。理論板數(shù)按黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A峰計均應(yīng)不低于5 000，按小檗堿、黃連堿、黃柏堿及藥根堿峰計均應(yīng)不低于4 500，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1和圖2。

圖1 黃酮類成分高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of flavonoids

圖2 生物堿類成分高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of alkaloids

線性關(guān)系考察：取混合對照品貯備液Ⅰ和Ⅱ，加70%甲醇溶液分別制成系列混合對照品溶液，按2.1項下相應(yīng)色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各成分質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表1。

檢測限與定量限考察：精密吸取混合對照品溶液Ⅰ和Ⅱ，加70%甲醇倍比稀釋，按2.1 項下相應(yīng)色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）為3∶1 和10∶1 時的進樣量分別記作檢測限和定量限。結(jié)果見表1。

精密度試驗：取供試品溶液適量，按2.1 項下相應(yīng)色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果見表1，表明方法精密度良好。

表1 方法學考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the methodological investigation（n=6）

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，3，6，9，12，15，18，24 h 后，按2.1 項下相應(yīng)色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果見表1，表明室溫下供試品溶液放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品適量，按2.2 項下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項下相應(yīng)色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算各成分含量。結(jié)果見表1，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品1.0 g，精密稱定，平行6 份，置具塞錐形瓶中，每份精密加入2.2 項下相應(yīng)混合對照品貯備液Ⅰ和Ⅱ各2.5 mL，再按2.2項下供試品溶液制備方法處理，按2.1項下相應(yīng)色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

取樣品10 批，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下相應(yīng)色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算12種成分的含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of 12 components in samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 成分解析

黃連、黃芩同屬苦寒之品，有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，黃連偏瀉心胃之火，黃芩善解肺及大腸之熱，二者常配對使用，以協(xié)同發(fā)揮療效［5］。黃芩中主要含有黃酮類、木脂素和揮發(fā)油等多種成分，其中黃酮類化合物為其主要藥理活性成分，如黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 等［6］。藥理學研究表明，黃芩素可抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡，黃芩苷具有抗氧化、抗心肌缺血、抗腫瘤及抗炎等功效，漢黃芩素可抑制多種腫瘤細胞生長增殖［7-11］。黃連的主要活性成分為表小檗堿、小檗堿、黃連堿、巴馬汀等異喹啉類生物堿，具有抗菌、消炎、增強機體免疫功能、抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡等作用［12-14］。黃連- 黃芩配伍主治上焦、中焦火邪及清熱毒，黃柏則入腎經(jīng)、大腸經(jīng)、膀胱經(jīng)，清下焦火；黃柏的活性成分主要為生物堿類，包括小檗堿、藥根堿、木蘭花堿、黃柏堿等［15-16］。

3.2 色譜條件優(yōu)化

本研究中12 種成分可分為黃酮類及生物堿類成分，化學結(jié)構(gòu)差異較大，預(yù)試驗中參考文獻［17］方法，以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相，同時測定12種成分，但基線噪音較大，色譜峰分離效果欠佳，尤其巴馬汀與小檗堿難以分離。為得到較好的分離效果和信號強度，最后采用不同色譜條件分別測定濕潤燒傷膏中兩大類成分，且選擇不同流動相進行分離。通過對12種成分進行紫外-可見光全波長紫外掃描，發(fā)現(xiàn)7種生物堿類成分在345 nm 波長處均有較強吸收，而5 種黃酮類化合物在275 nm 波長處有較強吸收，所以本研究中設(shè)置兩種檢測波長。

3.3 提取方式選擇

楊麗宏等［17］分別采用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、純凈水等不同極性試劑，提取黃連解毒湯中生物堿類及黃酮類化合物，得出以飽和正丁醇溶液提取效果最好的結(jié)論，預(yù)試驗中分別比較了不同濃度的甲醇溶液、飽和正丁醇溶液及0.1%甲酸溶液對各成分的提取效果，結(jié)果與文獻結(jié)果一致，故以飽和正丁醇為提取溶劑，超聲提取濕潤燒傷膏中12種成分。

3.4 方法評價

本研究中首次實現(xiàn)了濕潤燒傷膏中5 種黃酮類化合物（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A）及7 種生物堿類成分（黃柏堿、木蘭花堿、黃連堿、表小檗堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀）含量的同時測定，方法精密度高、準確性和重復(fù)性好，可為該制劑質(zhì)量評價和標準提升提供參考。