喙核桃組織培養污染內生真菌的鑒定

張桂華，李 旦，何承忠

(1.西南林業大學 生物多樣性保護學院,云南 昆明 650224；2.云南生物多樣性研究院,云南 昆明 650224；3.西南林業大學亞太森林組織昆明中心,云南 昆明 650224；4.云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室,云南 昆明 650224)

1 引言

喙核桃(Annamocaryasinensis)屬于胡桃科(Juglandaceae)的高大喬木[1]，奇數羽狀復葉，小葉對生，呈長橢圓形，且上端小葉較大；雄性葇荑花序，雌性穗狀花絮；核果近球形或卵狀橢圓形，頂端具似“鳥嘴”的漸尖頭，花期5月份，果期10月份[2]。為《全國極小種群野生植物保護實施方案》中的保護物種，“中國植物紅皮書”中瀕危等級物種，2021年《國家重點保護野生植物名錄》中的二級保護植物。喙核桃在全世界僅在中國西南部和越南北部有分布，野外分布范圍極其狹窄，植株數量極少，急需對其展開保護研究[3]。

植物組織培養是依據植物細胞具有全能性的特性，使用生物技術手段在一定條件下，對離體植物的組織根據實驗目的進行誘導性的培養，一個單一的外植體可以在相對較短的時間和空間內快速繁殖植株[4]。組織培養過程中常會發生一些問題，如材料污染、褐變和玻璃化等，嚴重影響組培效果，甚至導致組培失敗[5]。

內生菌(Endophyte)是導致組織培養污染的一類污染源，其不同于植物體表的微生物，是一類在植物組織內生活的微生物，包括真菌、細菌和放線菌等[6]。內生真菌在大多數植物組織當中都有所分布，可以通過水平以及垂直的傳播方式定植與生活在宿主當中[7]。在植物花期間，內生真菌可以利用菌絲進入到植物的胚珠當中，經由種子傳播到子代；可以形成孢子，經由風以及雨水進行水平式的傳播；也可以從植物根部所形成的傷口侵入，從而到達植物體內并擴散到其他部位，即可以向上侵入到莖部、葉片等[8～10]。內生真菌可以與植物間保持共生、中性關系，也可導致植物致病，這主要取決于宿主植物的基因型和所處的環境條件[11]，組織培養的實驗材料多數取自植物體的莖段和葉片，其內部含有一定量的真菌數量，組織培養的條件改變原來宿主植物所處環境，達到部分真菌優質生長的條件水平，使其急劇增長，最終導致外植體的致病或死亡。

課題組前期對喙核桃進行的組織培養研究，均因內生真菌污染問題導致實驗無法進行。因此，本研究選擇對出現在喙核桃組織培養研究中的內生真菌進行分離鑒定，確定其種類，以期對其做出防治措施。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

2.1.1 材料

喙核桃組培實驗中出現的所有污染真菌為實驗所用材料。

2.1.2 主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potato Dextrose Agar Medium，PDA);真菌DNA提取試劑盒(北京擎科生物科技有限公司)、通用引物ITS1(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')(北京擎科生物科技有限公司)、1×TSE101金牌mix(北京擎科生物科技有限公司)、TSINGKE 高純度低電滲瓊脂糖(北京擎科生物科技有限公司)、DNA 凝膠回收試劑盒(北京擎科生物科技有限公司)、DL5000 Marker(北京擎科生物科技有限公司)。

2.2 材料處理方法

2.2.1 菌株的分離和純化

挑取組培實驗中污染真菌菌落邊緣菌絲，將菌絲以三點接種法接種到滅菌后的 PDA 培養基上，使之呈“品”字形，進行分離處理，并重復兩組實驗；將已接種的 PDA平板置于恒溫培養箱中在 28℃的條件下培養，待真菌長成菌落后，將形態不同的真菌分別挑出，接種到新的 PDA 培養基上進行菌種純化處理，重復實驗直至得到單一菌落并對其進行形態學觀察。將純化得到的單一菌落送至北京擎科生物科技有限公司進行進一步處理。

2.2.2 菌株DNA提取、PCR擴增及電泳檢測

使用擎科真菌DNA提取試劑盒(通用型)提取真菌DNA，提取的DNA樣品適量稀釋后作為PCR模板，以真菌通用引物ITS1(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')對真菌 ITS 基因進行 PCR 擴增。以擎科1×TSE101金牌mix進行擴增，反應條件及擴增程序為98℃預變性2 min，35個循環數(98 ℃變性10 s；56 ℃退火10 s；72 ℃延伸10 s),然后72℃延伸5 min，最終 4 ℃停止并保存。將擴增好的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(2 μL樣品+6 μL溴酚藍)。

2.2.3 測序比對

將PCR產物進行一代測序，用Contig Express拼接測序結果，并去除兩端不準的部分，將拼接好的序列在NCBI數據庫(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中進行比對。

3 結果分析

3.1 菌株分離純化結果

根據不同的形態型，共分離純化得到6株不同的污染真菌，其中A菌株在PDA培養基上28 ℃培養14 d后，菌落呈白色絨狀，菌落表面凸起，中間凹陷，菌落背面呈淡橘黃色，孢子單胞，透明，紡錘狀，表面光滑，直徑為6～8 μm(圖1A、圖1a)。B菌株在PDA培養基上28 ℃培養14 d后，菌落呈墨綠色，菌落邊緣白色，菌落不平，較厚，質地絲絨狀，中央凹陷、黃褐色絨狀突起，背面顏色為黃褐色，分生孢子球形，粗糙，直徑5～8 μm(圖1B、圖1b)。C菌株在PDA培養基上28 ℃培養14 d后，菌落中部深綠色，邊緣白色，平展，表面可見輻射狀溝紋，表面具有黃色水珠，背面為黃色，分生孢子梗三級結構，整體呈帚狀，分生孢子球形，光滑，呈團狀，直徑約4～6 μm(圖1C、圖1c)。D菌株在PDA培養基上28 ℃培養14 d后，菌落較為致密，呈絮狀無限生長，菌落最外層為灰白色，向內為灰色，培養基背面呈黑褐色，單孢子短卵、橢圓或倒棒槌形(圖1D、圖1d)。E菌株在PDA培養基上28 ℃培養14 d后, 菌落致密，菌絲體毛絮狀，中央菌絲體由白色轉為紫色，菌落背面紫色，大型分生孢子呈鐮刀形或紡錘形，無色透明，小型分生孢子長卵形、梨形或腎形，無色透明，大小5～8 μm(圖1E、圖1e)。F菌株在PDA培養基上28 ℃培養14 d后，菌落菌絲成白色毛狀，邊緣整齊，菌落背面棕色，具大型分生孢子和小型分生孢子，大小5～8 μm，小型分生孢子有腎形、橢圓形、卵形，大型分生孢子鐮刀狀，略彎曲(圖1F、圖1f)。

注：A、B、C、D、E、F皆為菌株編號；a為A菌株孢子結構；b為B菌株孢子結構；c為C菌株孢子結構；d為D菌株孢子結構；e為E菌株孢子結構；f為F菌株孢子結構。

3.2 鑒定結果

利用真菌鑒定通用引物ITS1和ITS4對從喙核桃組培實驗中分離到的污染真菌做菌體PCR，各菌株的PCR產物測序結果在Gene Bank中做Blast比對分析，結果表明(表1)：菌株A與AcremoniumsclerotigenumMK336606.1 序列的相似度達到 100%，則菌株A為菌核枝頂孢霉(Acremoniumsclerotigenum)；菌株B與AspergillusversicolorMN547369.1序列的相似度為100%，則菌株B為雜色曲霉(Aspergullusversicolor)；C菌株與PenicilliumrubensMN413181.1序列的相似度為 100%，則C菌株為產紅青霉(Penicilliumrubens)；D菌株與AlternariaalternataMT548677.1序列的相似度為 100%，則D菌株為交鏈格孢菌(Alternariaalternata)；菌株E與FusariumproliferatumMT466521.1序列的相似度為100%，則菌株E為層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)；菌株F與FusariumsolaniMF687193.1序列的相似度為100%，則菌株F為茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)。這6種菌屬于子囊菌門盤菌亞門的枝頂孢屬、曲霉菌屬、青霉菌屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬的真菌，證明導致喙核桃組織培養實驗污染的內生真菌為菌核枝頂孢霉、雜色曲霉、產紅青霉、交鏈格孢菌、層出鐮刀菌、茄病鐮刀菌。

表1 內生真菌測序鑒定結果

4 討論與結論

對喙核桃組培實驗中出現的污染內生真菌進行鑒定，共鑒定出菌核枝頂孢霉、雜色曲霉、產紅青霉、交鏈格孢菌、層出鐮刀菌和茄病鐮刀菌6種真菌。李培謙等[12]將菌核枝頂孢霉接種健康葡萄、番茄和蘋果均能引起果實腐爛，說明了其具有致腐特性，曾慧蘭[13]等確定引起龍牙百合軟腐病的病原菌為菌核枝頂孢霉。Viega等[14]研究表明雜色曲霉能代謝產生雜色曲霉毒素(sterigmatocystin,ST)，對動物和人類的健康有極大的危害。而在喙核桃組培研究中，被這些真菌污染的外植體，即使在經過及時的轉瓶處理后，外植體依舊停止生長或緩慢生長，最后死亡。推測喙核桃組培苗的生長環境適宜這6種真菌的生長和繁殖，但真菌生長繁殖速度遠大于組培苗的生長速度，隨著組培時間的推進，內生真菌菌絲占據整個外植體內、外部空隙，阻斷外植體對營養物質、水分、氧氣、二氧化碳等物質的吸收，且部分真菌會分泌次生代謝物如萜類、酚類、環肽、蒽醌類、生物堿類等物質，部分代謝物可能會促使外植體褐化以及對外植體產生毒害作用。

進一步對喙核桃展開組織培養研究，必須克服這類真菌的污染問題。董丹等[15]研究表明，鏈霉素、慶大霉素、青霉素、氯霉素、羧芐青霉素、利福平等藥物對雜色曲霉有抑制作用。劉弘等[16]研究表明25%腐霉·福美雙600倍、25%咪鮮胺750倍、60%甲硫·異菌脲500倍對交鏈格孢菌的抑制率達100%。敬雪敏等[17]研究表明甲基托布津在稀釋500倍時對層出鐮刀菌的抑制效果最好。韓鳳英等[18]研究表明：甲基硫菌靈可濕性粉劑可明顯抑制茄病鐮刀菌生長。上述研究結果表明可以通過使用抗生素及殺菌劑來抑制或消滅出現在組培實驗中的部分真菌，但殺菌劑在喙核桃組培實驗中是否有正向作用以及其用法用量等問題，還未有明確的研究結果。喙核桃樹木稀少，能用來展開研究的實驗材料更是稀少，被污染的材料越多，其造成的損失就越大。因此，對于污染的內生真菌應做好多方面的防控，減少提供此類真菌的生長基質，改變培養條件，同時探究有效的抑菌劑在組培中的應用將是未來研究的方向。

致謝：

本研究依托西南林業大學云南生物多樣性研究院完成。