喙核桃組織培養(yǎng)污染內(nèi)生真菌的鑒定

張桂華，李 旦，何承忠

(1.西南林業(yè)大學(xué) 生物多樣性保護學(xué)院,云南 昆明 650224；2.云南生物多樣性研究院,云南 昆明 650224；3.西南林業(yè)大學(xué)亞太森林組織昆明中心,云南 昆明 650224；4.云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室,云南 昆明 650224)

1 引言

喙核桃(Annamocaryasinensis)屬于胡桃科(Juglandaceae)的高大喬木[1]，奇數(shù)羽狀復(fù)葉，小葉對生，呈長橢圓形，且上端小葉較大；雄性葇荑花序，雌性穗狀花絮；核果近球形或卵狀橢圓形，頂端具似“鳥嘴”的漸尖頭，花期5月份，果期10月份[2]。為《全國極小種群野生植物保護實施方案》中的保護物種，“中國植物紅皮書”中瀕危等級物種，2021年《國家重點保護野生植物名錄》中的二級保護植物。喙核桃在全世界僅在中國西南部和越南北部有分布，野外分布范圍極其狹窄，植株數(shù)量極少，急需對其展開保護研究[3]。

植物組織培養(yǎng)是依據(jù)植物細胞具有全能性的特性，使用生物技術(shù)手段在一定條件下，對離體植物的組織根據(jù)實驗?zāi)康倪M行誘導(dǎo)性的培養(yǎng)，一個單一的外植體可以在相對較短的時間和空間內(nèi)快速繁殖植株[4]。組織培養(yǎng)過程中常會發(fā)生一些問題，如材料污染、褐變和玻璃化等，嚴重影響組培效果，甚至導(dǎo)致組培失敗[5]。

內(nèi)生菌(Endophyte)是導(dǎo)致組織培養(yǎng)污染的一類污染源，其不同于植物體表的微生物，是一類在植物組織內(nèi)生活的微生物，包括真菌、細菌和放線菌等[6]。內(nèi)生真菌在大多數(shù)植物組織當(dāng)中都有所分布，可以通過水平以及垂直的傳播方式定植與生活在宿主當(dāng)中[7]。在植物花期間，內(nèi)生真菌可以利用菌絲進入到植物的胚珠當(dāng)中，經(jīng)由種子傳播到子代；可以形成孢子，經(jīng)由風(fēng)以及雨水進行水平式的傳播；也可以從植物根部所形成的傷口侵入，從而到達植物體內(nèi)并擴散到其他部位，即可以向上侵入到莖部、葉片等[8～10]。內(nèi)生真菌可以與植物間保持共生、中性關(guān)系，也可導(dǎo)致植物致病，這主要取決于宿主植物的基因型和所處的環(huán)境條件[11]，組織培養(yǎng)的實驗材料多數(shù)取自植物體的莖段和葉片，其內(nèi)部含有一定量的真菌數(shù)量，組織培養(yǎng)的條件改變原來宿主植物所處環(huán)境，達到部分真菌優(yōu)質(zhì)生長的條件水平，使其急劇增長，最終導(dǎo)致外植體的致病或死亡。

課題組前期對喙核桃進行的組織培養(yǎng)研究，均因內(nèi)生真菌污染問題導(dǎo)致實驗無法進行。因此，本研究選擇對出現(xiàn)在喙核桃組織培養(yǎng)研究中的內(nèi)生真菌進行分離鑒定，確定其種類，以期對其做出防治措施。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

2.1.1 材料

喙核桃組培實驗中出現(xiàn)的所有污染真菌為實驗所用材料。

2.1.2 主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar Medium，PDA);真菌DNA提取試劑盒(北京擎科生物科技有限公司)、通用引物ITS1(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')(北京擎科生物科技有限公司)、1×TSE101金牌mix(北京擎科生物科技有限公司)、TSINGKE 高純度低電滲瓊脂糖(北京擎科生物科技有限公司)、DNA 凝膠回收試劑盒(北京擎科生物科技有限公司)、DL5000 Marker(北京擎科生物科技有限公司)。

2.2 材料處理方法

2.2.1 菌株的分離和純化

挑取組培實驗中污染真菌菌落邊緣菌絲，將菌絲以三點接種法接種到滅菌后的 PDA 培養(yǎng)基上，使之呈“品”字形，進行分離處理，并重復(fù)兩組實驗；將已接種的 PDA平板置于恒溫培養(yǎng)箱中在 28℃的條件下培養(yǎng)，待真菌長成菌落后，將形態(tài)不同的真菌分別挑出，接種到新的 PDA 培養(yǎng)基上進行菌種純化處理，重復(fù)實驗直至得到單一菌落并對其進行形態(tài)學(xué)觀察。將純化得到的單一菌落送至北京擎科生物科技有限公司進行進一步處理。

2.2.2 菌株DNA提取、PCR擴增及電泳檢測

使用擎科真菌DNA提取試劑盒(通用型)提取真菌DNA，提取的DNA樣品適量稀釋后作為PCR模板，以真菌通用引物ITS1(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')對真菌 ITS 基因進行 PCR 擴增。以擎科1×TSE101金牌mix進行擴增，反應(yīng)條件及擴增程序為98℃預(yù)變性2 min，35個循環(huán)數(shù)(98 ℃變性10 s；56 ℃退火10 s；72 ℃延伸10 s),然后72℃延伸5 min，最終 4 ℃停止并保存。將擴增好的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(2 μL樣品+6 μL溴酚藍)。

2.2.3 測序比對

將PCR產(chǎn)物進行一代測序，用Contig Express拼接測序結(jié)果，并去除兩端不準的部分，將拼接好的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中進行比對。

3 結(jié)果分析

3.1 菌株分離純化結(jié)果

根據(jù)不同的形態(tài)型，共分離純化得到6株不同的污染真菌，其中A菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)14 d后，菌落呈白色絨狀，菌落表面凸起，中間凹陷，菌落背面呈淡橘黃色，孢子單胞，透明，紡錘狀，表面光滑，直徑為6～8 μm(圖1A、圖1a)。B菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)14 d后，菌落呈墨綠色，菌落邊緣白色，菌落不平，較厚，質(zhì)地絲絨狀，中央凹陷、黃褐色絨狀突起，背面顏色為黃褐色，分生孢子球形，粗糙，直徑5～8 μm(圖1B、圖1b)。C菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)14 d后，菌落中部深綠色，邊緣白色，平展，表面可見輻射狀溝紋，表面具有黃色水珠，背面為黃色，分生孢子梗三級結(jié)構(gòu)，整體呈帚狀，分生孢子球形，光滑，呈團狀，直徑約4～6 μm(圖1C、圖1c)。D菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)14 d后，菌落較為致密，呈絮狀無限生長，菌落最外層為灰白色，向內(nèi)為灰色，培養(yǎng)基背面呈黑褐色，單孢子短卵、橢圓或倒棒槌形(圖1D、圖1d)。E菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)14 d后, 菌落致密，菌絲體毛絮狀，中央菌絲體由白色轉(zhuǎn)為紫色，菌落背面紫色，大型分生孢子呈鐮刀形或紡錘形，無色透明，小型分生孢子長卵形、梨形或腎形，無色透明，大小5～8 μm(圖1E、圖1e)。F菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)14 d后，菌落菌絲成白色毛狀，邊緣整齊，菌落背面棕色，具大型分生孢子和小型分生孢子，大小5～8 μm，小型分生孢子有腎形、橢圓形、卵形，大型分生孢子鐮刀狀，略彎曲(圖1F、圖1f)。

注：A、B、C、D、E、F皆為菌株編號；a為A菌株孢子結(jié)構(gòu)；b為B菌株孢子結(jié)構(gòu)；c為C菌株孢子結(jié)構(gòu)；d為D菌株孢子結(jié)構(gòu)；e為E菌株孢子結(jié)構(gòu)；f為F菌株孢子結(jié)構(gòu)。

3.2 鑒定結(jié)果

利用真菌鑒定通用引物ITS1和ITS4對從喙核桃組培實驗中分離到的污染真菌做菌體PCR，各菌株的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在Gene Bank中做Blast比對分析，結(jié)果表明(表1)：菌株A與AcremoniumsclerotigenumMK336606.1 序列的相似度達到 100%，則菌株A為菌核枝頂孢霉(Acremoniumsclerotigenum)；菌株B與AspergillusversicolorMN547369.1序列的相似度為100%，則菌株B為雜色曲霉(Aspergullusversicolor)；C菌株與PenicilliumrubensMN413181.1序列的相似度為 100%，則C菌株為產(chǎn)紅青霉(Penicilliumrubens)；D菌株與AlternariaalternataMT548677.1序列的相似度為 100%，則D菌株為交鏈格孢菌(Alternariaalternata)；菌株E與FusariumproliferatumMT466521.1序列的相似度為100%，則菌株E為層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)；菌株F與FusariumsolaniMF687193.1序列的相似度為100%，則菌株F為茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)。這6種菌屬于子囊菌門盤菌亞門的枝頂孢屬、曲霉菌屬、青霉菌屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬的真菌，證明導(dǎo)致喙核桃組織培養(yǎng)實驗污染的內(nèi)生真菌為菌核枝頂孢霉、雜色曲霉、產(chǎn)紅青霉、交鏈格孢菌、層出鐮刀菌、茄病鐮刀菌。

表1 內(nèi)生真菌測序鑒定結(jié)果

4 討論與結(jié)論

對喙核桃組培實驗中出現(xiàn)的污染內(nèi)生真菌進行鑒定，共鑒定出菌核枝頂孢霉、雜色曲霉、產(chǎn)紅青霉、交鏈格孢菌、層出鐮刀菌和茄病鐮刀菌6種真菌。李培謙等[12]將菌核枝頂孢霉接種健康葡萄、番茄和蘋果均能引起果實腐爛，說明了其具有致腐特性，曾慧蘭[13]等確定引起龍牙百合軟腐病的病原菌為菌核枝頂孢霉。Viega等[14]研究表明雜色曲霉能代謝產(chǎn)生雜色曲霉毒素(sterigmatocystin,ST)，對動物和人類的健康有極大的危害。而在喙核桃組培研究中，被這些真菌污染的外植體，即使在經(jīng)過及時的轉(zhuǎn)瓶處理后，外植體依舊停止生長或緩慢生長，最后死亡。推測喙核桃組培苗的生長環(huán)境適宜這6種真菌的生長和繁殖，但真菌生長繁殖速度遠大于組培苗的生長速度，隨著組培時間的推進，內(nèi)生真菌菌絲占據(jù)整個外植體內(nèi)、外部空隙，阻斷外植體對營養(yǎng)物質(zhì)、水分、氧氣、二氧化碳等物質(zhì)的吸收，且部分真菌會分泌次生代謝物如萜類、酚類、環(huán)肽、蒽醌類、生物堿類等物質(zhì)，部分代謝物可能會促使外植體褐化以及對外植體產(chǎn)生毒害作用。

進一步對喙核桃展開組織培養(yǎng)研究，必須克服這類真菌的污染問題。董丹等[15]研究表明，鏈霉素、慶大霉素、青霉素、氯霉素、羧芐青霉素、利福平等藥物對雜色曲霉有抑制作用。劉弘等[16]研究表明25%腐霉·福美雙600倍、25%咪鮮胺750倍、60%甲硫·異菌脲500倍對交鏈格孢菌的抑制率達100%。敬雪敏等[17]研究表明甲基托布津在稀釋500倍時對層出鐮刀菌的抑制效果最好。韓鳳英等[18]研究表明：甲基硫菌靈可濕性粉劑可明顯抑制茄病鐮刀菌生長。上述研究結(jié)果表明可以通過使用抗生素及殺菌劑來抑制或消滅出現(xiàn)在組培實驗中的部分真菌，但殺菌劑在喙核桃組培實驗中是否有正向作用以及其用法用量等問題，還未有明確的研究結(jié)果。喙核桃樹木稀少，能用來展開研究的實驗材料更是稀少，被污染的材料越多，其造成的損失就越大。因此，對于污染的內(nèi)生真菌應(yīng)做好多方面的防控，減少提供此類真菌的生長基質(zhì)，改變培養(yǎng)條件，同時探究有效的抑菌劑在組培中的應(yīng)用將是未來研究的方向。

致謝：

本研究依托西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院完成。