lncRNA XIST和miR-124在支氣管哮喘患兒外周血單個核細胞中表達關系研究

齊莎莎 張國偉 孟凡威 付曉梅 張旭亞

支氣管哮喘是常見的慢性炎癥性呼吸系統疾病，在嬰幼兒時期即可發病[1]。隨著經濟快速的發展和環境污染問題的日益嚴重，哮喘發病率有逐漸上升的趨勢，嚴重影響兒童生命健康及家庭生活質量[2]。微小RNA-124(microRNA-124，miR-124)是一種腦組織中特異性較高的miRNA，廣泛參與神經系統發育[3]。長鏈非編碼RNA X染色體失活特異性轉錄本(long non-coding RNA X inactive specific transcript，LncRNA XIST)是位于X染色體失活中心的XIST基因的轉錄產物[4]。Li等[5]研究結果顯示，哮喘患者血漿中miR-124呈低表達，且本研究前期通過生物信息學預測網站(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測發現，LncRNA XIST與miR-124存在靶向關系。但目前關于lncRNA XIST、miR-124共同參與支氣管哮喘的研究較少。因此，本研究通過檢測支氣管哮喘患兒外周血單個核細胞中lncRNA XIST、miR-124水平，探討二者與肺功能指標及炎癥因子的關系，以期為兒童支氣管哮喘的預防和評估提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年3月因支氣管哮喘于河南大學第一附屬醫院門診及病房接受治療的168例患兒為研究對象，其中急性發作期82例(急性發作組)、緩解期86例(緩解組)；同期選取84例健康體檢兒童作為對照組。收集各組患兒年齡、性別、身體質量指數(body mass index，BMI)、哮喘家族史、病程等一般資料。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①患兒符合支氣管哮喘診斷標準[6]；②3～13歲兒童，本試驗經醫院臨床研究倫理委員會批準，所有受試兒童家長自愿參加研究，并簽署知情同意書；③患兒臨床資料完整，可配合治療；④入組前4周無糖皮質激素應用史者。排除標準：①有感染性疾病、過敏性鼻炎、喘息性疾病、因感染引起的咳喘及其他呼吸系統疾病者；②有β2受體激動劑過敏史者；③有銀屑病、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病者。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及處理 采集各組兒童清晨空腹外周靜脈血。①血清收集：部分離心15 min后收集血清，用于炎癥因子檢測；②外周血單個核細胞收集：部分加同等體積生理鹽水，混勻后加入到含有人外周血淋巴細胞分離液的離心管中，離心30 min后取出，此時離心管最上層為血漿，血漿層下白色薄層為外周血單個核細胞層，收集單個核細胞層，離心后棄上清，收集乳白色細胞，并采用PBS緩沖液洗滌，用于lncRNA XIST、miR-124水平檢測。

1.3.2 外周血單個核細胞lncRNA XIST和miR-124水平檢測 RNA提取試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)提取總RNA后反轉錄得cDNA，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測各組外周血單個核細胞中lncRNA XIST、miR-124水平。qRT-PCR反應條件：95℃，5 min；95℃、30 s，63℃、30 s，40個循環；72℃，10 min。qRT-PCR反應體系：上下游引物(10 μM)各0.5 μL，AceQ qPCR SYBR?Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，ddH2O 3.0 μL。lncRNA XIST、miR-124及其內參引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法對外周血單個核細胞lncRNA XIST、miR-124水平進行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 肺功能指標、炎癥因子水平檢測 采用肺功能儀(北京西化儀科技有限公司)檢測各組患兒第一秒用力呼氣量(forced expiratory volume in one second，FEV1)。采用酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測各組兒童炎癥因子白介素(interleukin，IL)-17、IL-1β、IL-10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平。其中IL-17 ELISA試劑盒購自南京北魚生物科技有限公司，IL-1β ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司；IL-10 ELISA試劑盒購自美國Sciencell公司。

2 結果

2.1 對照組、緩解組、急性發作組一般資料比較 對照組、緩解組、急性發作組年齡、性別、BMI、哮喘家族史比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與緩解組比較，急性發作組病程較短，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 對照組、緩解組、急性發作組一般資料比較

2.2 對照組、緩解組、急性發作組外周血單個核細胞lncRNA XIST和miR-124水平比較 與對照組比較，緩解組、急性發作組外周血單個核細胞lncRNA XIST水平升高，miR-124水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與緩解組比較，急性發作組外周血單個核細胞lncRNA XIST水平升高，miR-124水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 對照組、緩解組、急性發作組外周血單個核細胞lncRNAXIST和miR-124水平比較

2.3 對照組、緩解組、急性發作組肺功能指標、炎癥因子水平比較 與對照組比較，緩解組、急性發作組IL-17、IL-1β、TNF-α水平升高，FEV1、IL-10水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與緩解組比較，急性發作組IL-17、IL-1β、TNF-α水平升高，FEV1、IL-10水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 對照組、緩解組、急性發作組肺功能指標、炎癥因子水平比較

2.4 支氣管哮喘患兒外周血單個核細胞lncRNA XIST與miR-124水平相關性 Pearson法相關性分析結果顯示，支氣管哮喘患兒外周血單個核細胞lncRNA XIST與miR-124水平呈負相關(r=-0.668，P<0.001)。見圖1。

圖1 支氣管哮喘患兒外周血單個核細胞lncRNA XIST與miR-124水平相關性

2.5 支氣管哮喘患兒lncRNA XIST、miR-124與肺功能指標、炎癥因子水平相關性 Pearson法分析結果顯示，支氣管哮喘患兒lncRNA XIST與IL-17、IL-1β、TNF-α呈正相關(P<0.05)，與FEV1、IL-10呈負相關(P<0.05)。miR-124與FEV1、IL-10呈正相關(P<0.05)，與IL-17、IL-1β、TNF-α呈負相關(P<0.05)。見表5。

表5 支氣管哮喘患兒lncRNA XIST、miR-124與肺功能指標、炎癥因子水平相關性

3 討論

哮喘是世界范圍內常見的難治性慢性疾病之一，兒童支氣管哮喘的預防和治療也成為世界性的醫學課題[7]。研究[8]表明，支氣管哮喘是多種組分、多種細胞共同參與、共同作用的結果。支氣管哮喘發病時多表現為咳嗽、呼吸困難、反復發作性喘息，但其病因復雜，具體發病機制目前尚不十分清楚，增加了臨床診療難度[9]。因此，急需尋找相關的生物標志物用于支氣管哮喘的臨床診治。

LncRNA是一類缺少完整閱讀框的非編碼RNA，對基因表達、細胞分化以及炎癥反應均有重要影響[10]。lncRNA XIST是哺乳動物X染色體失活時的關鍵起始物，研究發現其在乳腺癌、膀胱癌等腫瘤中表達失調[11-12]。lncRNA XIST在炎癥性疾病中的作用有待進一步探究。miRNA是一類高度保守的單鏈、非編碼RNA，參與細胞增殖、發育、代謝等一系列生理過程，miRNA同時還是促炎細胞因子的重要調節因子[13]。miR-124在中樞神經系統中的表達量較高，其在神經細胞損傷及神經炎癥中發揮重要調節作用[14]。本研究結果中顯示，與健康兒童相比，支氣管哮喘患兒外周血單個核細胞lncRNA XIST水平升高，miR-124水平降低，且隨哮喘疾病活動度的增加，其變化趨勢更為明顯。Atashbasteh等[15]研究顯示，與健康人群比較，哮喘患者血清中miR-124表達下調，與本研究中miR-124表達趨勢基本一致。提示本研究lncRNA XIST、miR-124表達水平可能與兒童支氣管哮喘的發生發展有關。研究顯示，miR-124與變應性鼻炎的疾病風險、嚴重程度及炎癥相關，且miR-124可通過調控Toll樣受體相關通路中因子表達水平，發揮抗炎作用[16-17]。結合生物信息學預測結果中二者的靶向關系及上述研究[16-17]中miR-124在炎癥疾病中的作用機制推測：哮喘病理發展初期，lncRNA XIST表達水平升高，通過負向調節miR-124使其表達下降，miR-124無法抑制Toll樣受體相關通路中IL-1受體相關激酶1和TNF受體相關因子6的表達，使得其下游核因子-κB活化增加，造成miR-124抗炎作用被抑制，參與支氣管哮喘的疾病進程，導致患兒病情加重。此外，本研究中lncRNA XIST與miR-124表達水平呈明顯負相關。而Li等[5]研究中顯示，lncRNA NEAT1與miR-124在哮喘患兒血清中表達呈負相關。推測在哮喘發病過程中miR-124的表達可能受不同的基因調控，進而在哮喘疾病的發生發展中發揮重要作用。

相關研究[18-19]顯示，炎癥反應在支氣管哮喘的病理學機制中起重要作用，IL-17、IL-1β、TNF-α、IL-10等炎癥因子可能是導致支氣管哮喘患兒氣道癥狀出現的直接因素。而本研究中與健康兒童比較，支氣管哮喘患兒IL-17、IL-1β、TNF-α水平升高，FEV1、IL-10水平降低，且隨支氣管哮喘活動度增加，IL-17、IL-1β、TNF-α水平依次升高，FEV1、IL-10水平依次降低。提示支氣管哮喘患兒呼吸道炎癥水平相對較高，且肺功能可能受損。此外，本研究結果中lncRNA XIST、miR-124與肺功能指標及炎癥因子均呈一定的相關性。而廖偉榮等[20]研究同樣顯示lncRNA NEAT1/miR-124軸表達量與哮喘患兒肺通氣功能及炎癥水平相關。本研究中lncRNA XIST可能通過負向調節miR-124表達，使其表達水平降低，miR-124調控炎癥的作用降低，進而影響患兒肺功能及其病情進展。

綜上所述，支氣管哮喘患兒外周血單個核細胞lncRNA XIST高表達，miR-124低表達，且二者與肺功能指標FEV1及炎癥因子IL-17、IL-1β、TNF-α、IL-10均呈一定的相關性。lncRNA XIST、miR-124可能通過影響炎癥反應進而影響支氣管哮喘的病情進展，提示臨床重視哮喘患兒lncRNA XIST、miR-124的水平變化，為今后哮喘的治療及預防提供了新的靶點和思路。本研究仍存在不足之處：本研究僅從臨床水平上探究了lncRNA XIST、miR-124在支氣管哮喘患兒外周血單個核細胞中的表達情況，今后將進一步進行體外細胞或動物實驗研究證實相關機制；且本研究納入病例數有限，所有樣本均來自同一家醫院，為單中心研究，且部分干擾因素未能排除，今后將排除其他各類干擾因素，進一步采用大樣本量、多中心的前瞻性研究驗證實驗結果。