絲素蛋白/聚左旋乳酸納米纖維紗線肌腱補片的制備及其性能

劉 蛟，陳韶娟，吳韶華

(青島大學 紡織服裝學院，山東 青島 266071)

肌腱是連接肌肉和骨骼之間的軟組織，是肌肉骨骼系統的重要組成部分。肌腱損傷是常見的運動型損傷，據統計，全球每年至少有3 000萬的肌腱損傷患者就醫[1-2]。原生肌腱是由結構致密的纖維結締組織構成，具有細胞含量低、成血管能力弱等缺陷，導致肌腱損傷后無法自我修復[3-4]，對于大尺度損傷的患者來說必須采用補片進行輔助治療。

近年來，盡管人工肌腱補片的種類層出不窮，但當前實現商業化的人工肌腱補片均采用紡織技術加工而成。與其他技術相比，紡織構型的肌腱補片具有三維可調的多孔結構以及剛柔并濟的力學特征，具備顯著的優勢[5-6]。然而，傳統紡織結構的肌腱補片仍存在許多缺點。例如：采用的紗線原料為聚酯纖維或碳纖維微米纖維紗線，植入人體后無法降解，容易引發炎癥，甚至誘發強烈的機體免疫反應，長期使用具有致畸性和致癌性；此外，微米纖維結構無法有效仿生原生肌腱細胞外基質(ECM)膠原蛋白纖維的納米尺度和結構，導致補片的生物活性差，不利于細胞生長和新生組織再生。新型靜電紡納米纖維成紗技術所生產的納米纖維紗線具有更高的比表面積，且能夠有效仿生原生肌腱組織ECM膠原纖維的納米束狀多級結構，更有利于細胞黏附和組織再生[7-8]。此外，在納米纖維成紗過程中，可選用生物可降解的高聚物材料，植入體內后伴隨肌腱組織的再生慢慢降解，最終通過新陳代謝排出體外，不會對機體造成安全隱患[9]。

目前，經美國食品與藥品監督局(FDA)認可的可生物降解高聚物，主要包括聚左旋乳酸(PLLA)、聚己內酯(PCL)、聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)和聚對二氧環己酮(PPDO)等[10-11]。此外，為進一步提高細胞在材料表面的黏附性，可添加一些生物活性高的天然高聚物，如明膠、膠原、殼聚糖以及絲素蛋白(SF)等[12]。基于此，本文通過自主研發的靜電紡納米纖維成紗技術結合傳統紡織機織工藝，設計并研發了幾款可生物吸收的納米結構肌腱補片。以 4種不同SF/PLLA配比的納米纖維紗線為主體材料，以傳統PLLA微米纖維紗線為輔助材料，采用機織工藝制備了4種不同的肌腱補片，對其形貌、結構、理化性能以及生物性能進行測試與分析，為今后可吸收納米結構人工肌腱補片的設計、研發以及臨床應用提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

聚左旋乳酸(PLLA，相對分子質量為1×105)，濟南岱罡生物科技有限公司；六氟異丙醇(HFIP)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PLLA微米纖維紗線(線密度為100 dtex(75 f))，青島叒米科技有限公司；桑蠶繭，青島盛天義商貿公司；無水碳酸鈉(Na2CO3)、溴化鋰(LiBr)、酒精，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、噻唑藍溶液(MTT)、二甲基亞砜溶液(DMSO)，索萊寶生物科技有限公司；低糖基礎培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素(P/S)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；鬼筆環肽染液，上海翎圣生物科技有限公司；Draq5染液，美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 絲素蛋白制備

用剪刀將桑蠶繭剪成硬幣大小狀，稱取桑蠶繭片加入含有0.02 mol/L Na2CO3的溶液中沸煮30 min，使之脫膠；然后，用玻璃棒攪拌并于清水中洗滌3次，置于通風櫥中過夜晾干。將配制好的9.3 mol/L的LiBr溶液倒進干燥的脫膠蠶絲中，然后于60 ℃溶解4 h，之后將完全溶解的蠶絲溶液于4 ℃離心機中離心去除雜質，再于室溫下透析3 d，于-20 ℃冰箱中冷凍過夜，最后在冷凍干燥機中冷凍干燥2 d，獲得海綿狀絲素蛋白(SF)。

1.3 SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片制備

SF/PLLA紡絲液配制：按照質量比為0∶100、20∶80、35∶65和50∶50分別稱取相應質量的SF和PLLA，然后溶于HFIP中配制0.1 g/mL的聚合物溶液，于室溫在磁力攪拌器上攪拌過夜，獲得均勻的共混紡絲液。

SF/PLLA納米纖維紗線的制備：將配制好的紡絲液靜置30 min，然后采用自制的靜電紡納米纖維成紗牽伸一體機紡制納米纖維紗線[13]。負載共混紡絲液的雙噴頭電壓設置為±12 kV，2個噴頭間距離為20 cm，紡絲液流速為0.8 mL/h，利用金屬圓盤和空心金屬棒(間距為10 cm)收集2個噴頭噴出的納米纖維，金屬圓盤旋轉(250 r/min)將納米纖維加工成紗線，然后經由初紗輥送入熱牽伸裝置(溫度為80 ℃)，經1倍牽伸后獲得納米纖維紗線并卷繞在輥筒上。

SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片的制備：以PLLA微米纖維紗線為經紗，自制的不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線作為緯紗，在SGA598型半自動織布小樣機上織造成布，經密為120 根/(10 cm)，緯密為260 根/(10 cm)。采用熱刀裁剪獲得4種不同材質的肌腱補片，補片縱向為織物緯紗方向，補片橫向為織物經紗方向。

1.4 形貌觀察

采用VEGA3型掃描電子顯微鏡(SEM)對4種補片的形貌進行觀察，觀察前利用小型離子濺射儀進行噴金處理，加速電壓為10 kV，工作距離為10 mm。

1.5 化學結構測試

采用5225 Verona RD型傅里葉變換紅外光譜儀對4種補片的化學基團進行分析，分辨率為4 cm-1，掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.6 晶體結構測試

采用Ultima IV型廣角X射線衍射儀對4種補片的晶體結構進行分析，掃描范圍(2θ)為5°～45°，掃描速度為5 (°)/min，掃描電壓為40 kV，電流為40 A。

1.7 拉伸力學性能測試

用數顯千分尺對4種補片的厚度進行測量，精度為0.001 mm。沿補片縱向裁取40 mm×20 mm(長×寬)的樣品，采用Instron-3300型單軸拉伸強力儀進行拉伸力學性能測試，每組分別測試5個樣品，取平均值作為測試結果。實驗夾持距離為20 mm，拉伸速度為120 mm/min，預加張力為1 N。

1.8 體外細胞培養實驗

樣品準備：將樣品裁剪成半徑約為3.5 mm的圓片狀，在生物安全柜內進行紫外光照射滅菌，樣品正反面各照射2 h，然后用70%酒精浸泡過夜，用滅菌的PBS緩沖溶液洗滌3次，最后放入細胞培養基中浸泡過夜。

細胞培養及接種：選取人的跟腱細胞為模型細胞對補片的細胞相容性進行測試，培養基主體是DMEM，含有10%的FBS和1%的P/S。按照密度為1×105個/圓片將細胞接種到樣品上。實驗過程中每2 d更換1次培養基，共培養7 d。

1.8.1 鬼筆環肽染色

細胞培養至第7天時，對接種細胞的樣品進行固定、透膜、封閉后，在避光條件下，采用鬼筆環肽染液對細胞骨架蛋白(F-actin)染色2 h，然后用Draq5染液對細胞核(Nuclei)染色30 min，最后利用Zeiss 900 CLSM型激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察染色情況。

1.8.2 細胞黏附性能測試

細胞培養至第7 天時，將接種細胞的樣品固定后，于30%、50%、70%、80%、90%、100%的梯度酒精中分別脫水5 min，于40 ℃干燥箱中干燥過夜，噴金90 s后通過SEM觀察細胞在樣品表面的黏附情況。

1.8.3 MTT增殖實驗

接種細胞的樣品培養至第1、3、7 天時，通過MTT實驗測試細胞的增殖活性。避光條件下，將5 mg/mL MTT溶液加入接種細胞的樣品中孵育4 h后，先將MTT溶液吸出棄掉后再加入DMSO溶液，在脫色搖床上使得細胞中生成的藍紫色結晶——甲瓚(Formazan)完全溶解，然后吸取甲瓚/DMSO溶液置于96孔板中，于Infinite M Nano型酶標儀上讀取吸光度值。每組樣品每個時間節點分別設置5組對照樣，用吸光度值定量表征細胞在樣品上隨著時間增加的生長和增殖情況。

2 結果與討論

2.1 肌腱補片的形貌結構

圖1示出4種不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片及其內部納米纖維紗線和納米纖維的電鏡照片。可知：4種肌腱補片均由納米纖維紗線和微米纖維紗線交織而成，紗線之間構成明顯的孔隙；4種SF/PLLA納米纖維紗線表面光滑且無雜絲；納米纖維連續分布無斷裂點，縱向分布均勻，取向度較高。

圖1 不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片的掃描電鏡照片Fig.1 SEM images of nanofiber yarns-based tendon patches with different SF/PLLA mass ratios

圖2示出4種SF/PLLA紗線內部納米纖維的直徑分布直方圖。可知，質量比為0∶100、20∶80、35∶65和50∶50的SF/PLLA納米纖維的平均直徑分別為(477±226)、(421±132)、(336±115)、(281±129) nm，即隨著SF占比的增加，納米纖維直徑逐漸變細。這是由于在靜電紡絲過程中，SF的添加導致紡絲液電導率增加，從而提高了射流的牽伸程度，致使最終獲得的纖維直徑變小[14-15]。以橫軸為基準，取垂直于橫軸逆時針方向的角度為納米纖維取向度，測試結果如圖3所示。可知，4種納米纖維的取向度均集中分布在75°～105°之間，分布頻率分別為94%、84%、88%、70%，說明4種納米纖維均具有較高的取向度，這得益于較低的成紗捻度以及熱牽伸的牽伸作用[8]。

圖2 不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片納米纖維直徑Fig.2 Nanofiber diameter of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

圖3 不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片納米纖維取向度分布Fig.3 Orientation distribution of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

2.2 肌腱補片的分子基團及結晶結構

圖4 不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片FT-IR和XRD曲線Fig.4 FT-IR (a) and XRD (b) curves of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

4種SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片的X射線衍射光譜曲線如圖4(b)所示。可知，SF/PLLA納米纖維肌腱補片均在約16.4°附近出現細而高的衍射峰，對應著PLLA晶型中α′晶體的衍射峰(110)/(200)；隨著SF占比的增加，衍射峰的強度逐漸變弱。由于熱牽伸過程中的處理溫度(80 ℃)高于PLLA的玻璃化轉變溫度，致使PLLA內部雜亂排列的晶體開始滑移，牽伸作用導致晶體取向排列轉變為取向α′晶體，取向排列的α′晶體的出現致使紗線的結晶衍射峰強度增加[17-18]。然而，SF的添加會抑制晶體在熱處理過程中的取向排列[19]，且隨著SF占比的增加，抑制作用增強，導致PLLA晶型中α′晶體結晶能力變弱，衍射峰強度變低。

2.3 肌腱補片的拉伸力學性能

4種SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片縱向的載荷-伸長曲線如圖5所示，相關力學性能指標計算結果見表1。從圖5可以看出，4種肌腱補片的載荷-伸長曲線具有相似的拉伸變形過程。在拉伸起始階段，經歷了微弱的腳趾區(toe)后，進入線性彈性階段，緊接著經過非彈性變形直至拉伸至斷裂。由表1可以看出，斷裂載荷隨著SF占比增加呈現出逐漸減小的趨勢，但均高于100 N；其中SF與PLLA質量比為0∶100和20∶80的納米纖維紗線肌腱補片的斷裂載荷甚至能達到200 N以上，滿足組織再生所需的力學性能要求[2]。與此同時，肌腱補片的斷裂強度和初始模量也均隨著SF占比增加呈現出逐漸降低的趨勢，這與X射線衍射光譜圖的變化趨勢具有一致性，主要是由于SF的增加抑制了PLLA內部取向排列α′晶體的形成，從而導致力學性能逐漸下降。

圖5 不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片載荷-伸長曲線Fig.5 Load-elongation curves of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

表1 不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片力學性能Tab.1 Mechanical properties of SF/PLLA nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

2.4 細胞在肌腱補片上的鬼筆環肽染色

將人的跟腱細胞分別在4種SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片上培養7 d后，其細胞核(Nuclei)-細胞骨架蛋白(F-actin)熒光照片如圖6所示。可看出：細胞核均較大，呈現圓形或橢圓狀，表明所制備的肌腱補片無毒且有利于細胞生長；細胞骨架沿著纖維取向方向生長并幾乎覆蓋了整個肌腱補片，表明所制備的肌腱補片具有良好的生物相容性，有利于細胞黏附和生長。此外，添加SF的肌腱補片相較于未添加SF的肌腱補片具有更多的細胞，且隨著SF占比增加，細胞骨架覆蓋的面積更多，這表明SF有利于促進細胞的黏附和生長。

圖6 不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片鬼筆環肽染色照片Fig.6 Phalloidin staining images of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

2.5 細胞在肌腱補片上的黏附圖像

將人的跟腱細胞分別在4種SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片上培養7 d，其細胞黏附掃描電鏡照片如圖7所示。可以觀察到，細胞均能在4種肌腱補片上黏附生長，并且細胞幾乎覆蓋了整根納米纖維紗線。

圖7 不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片細胞黏附掃描電鏡照片Fig.7 Cell adhesion SEM images of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

2.6 細胞在肌腱補片上的增殖活性

將人的跟腱細胞在4種SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片上分別培養1、3和7 d，其細胞增殖情況如圖8所示。可看出，隨著培養時間增加，細胞在肌腱補片上的吸光度值逐漸增加，表明細胞逐漸增殖。同時，采用Scheffé 事后檢驗對比分析了不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線基肌腱補片的增殖活性。結果表明：隨著SF占比的增加，肌腱補片的吸光度值呈現逐漸增加的趨勢，細胞培養至第3天時，50∶50肌腱補片相較于0∶100和20∶80肌腱補片，呈現出顯著性增殖；培養至第7 天時，50∶50肌腱補片相較于0∶100和20∶80肌腱補片進一步呈現出顯著性差異，35∶65肌腱補片相較于0∶100和20∶80肌腱補片也呈現出顯著性增殖。

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。圖8 不同質量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補片的吸光度Fig.8 Absorbance values of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

3 結 論

本文利用靜電紡紗結合機織工藝共制備了0∶100、20∶80、35∶65、50∶50質量比的絲素蛋白/聚左旋乳酸(SF/PLLA)納米纖維紗線肌腱補片，研究了SF和PLLA質量比對補片形態結構、理化性能以及生物性能的影響。結果表明：隨著SF占比增加，肌腱補片中紗線內部納米纖維的平均直徑逐漸減小，納米纖維取向度均集中分布在75°～105°之間，呈現出較高的取向度；肌腱補片均在16.4°附近出現了結晶衍射峰，且隨著SF占比增加，結晶衍射峰的強度逐漸降低；斷裂載荷、斷裂強度、初始模量也均隨著SF占比的增加逐漸降低，但4種肌腱補片的斷裂載荷均在100 N以上，能夠滿足組織再生所需的力學性能要求，其中0∶100和20∶80肌腱補片的斷裂載荷甚至達到200 N以上。體外細胞實驗表明，人的跟腱細胞能夠在4種肌腱補片上黏附、生長并增殖，細胞數量隨著培養時間的增加而逐漸增多；此外，細胞數量隨著SF占比的增加而逐漸增加，表明肌腱補片能進一步促進細胞的生長、增殖。

本文以納米纖維紗線代替傳統用微米纖維紗線制備的可生物吸收納米結構肌腱補片，具有較高的取向度，較強的力學性能以及促進細胞黏附、增殖的能力，從而有利于受損肌腱的組織再生與功能重建，為未來人工肌腱的性能優化以及臨床應用提供一定的參考。

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