新外來中藥紫錐菊對虛寒、虛熱證小鼠生物學效應的影響

王禪締 余淑惠 朱映黎 楊彬睿 杜軍 劉曉菲 張建軍 王林元 陳亮 王淳

紫錐菊Echinacea purpurea(Linn.)Moench為菊科松果菊屬植物,原產于北美洲地區,1762年《弗吉尼亞植物志》最早記載,1996年肖培根院士[1]介紹了紫錐菊的化學成分、藥理作用、臨床應用等。紫錐菊作為19世紀北美、德國等地備受歡迎的天然植物草藥,以其獨特的提高免疫力、抗病毒[2-5]等生物活性成為近幾年醫學領域研究開發的一種熱點藥物[6]。紫錐菊作為免疫調節劑在全球范圍內日漸普及,其普遍的制劑為口服浸出液制劑,即不同濃度的乙醇浸出液,主要用于治療感冒、流感、關節炎、皮膚濕疹、免疫力低下等。

目前,國產紫錐菊保健食品已上市的有10種,主要與黃芪、西洋參、生姜進行配伍,用于增強免疫力、抗疲勞等;進口的有3種,主要用于增強免疫力。已有學者以外來中藥藥性研究策略[7]和范式[8]為指導,賦予紫錐菊中藥藥性[6],使其成為新外來中藥,促進其在我國的進一步發展。本實驗探討紫錐菊對虛熱、虛寒證小鼠環核苷酸、內分泌及物質代謝的影響,旨在求證紫錐菊的中藥寒熱藥性。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明種雄性小鼠110只,體質量18～22 g,由斯貝福動物實驗中心提供,動物合格證號1102290139911。

1.2 藥物

紫錐菊全草(由安徽常富國藥有限公司提供,批號:20201203);甲狀腺素片(上海中華藥業有限公司,批號:200602);氫化可的松(山西兆益生物有限公司,批號:20110102);人參配方顆粒(北京康仁堂藥業有限公司,批號:21006942);西洋參配方顆粒(廣東一方制藥有限公司,批號:412383T)。

1.3 試劑與儀器

環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)酶聯免疫試劑盒(批號:202103)、環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)酶聯免疫試劑盒(批號:202103)、三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3,批號:202105)、甲狀腺素(thyroxine,T4,批號:202105)均由江蘇科特提供。總蛋白(total protein,TP)試劑盒(批號:20210319)、白蛋白(albumin,ALB)試劑盒(批號:20210320)、總膽固醇(total cholesterol,TC)試劑盒批號:20210325)、甘油三酯(triglyceride,TG)試劑盒(批號:20210323)均由南京建成生物工程研究所提供。

Epoch2C型酶標儀(美國伯滕儀器有限公司),臺式冷凍離心機(Centrifuge 5424 R)。

1.4 藥物制備

受試藥參照陳秋玲等[9]對紫錐菊的提取方式進行提取和制備:紫錐菊全草,剪碎。80℃時用6倍量70%乙醇提取,提取3次,時間分別為2小時、2小時、1小時,合并濾液,濃縮到無醇。

1.5 分組和給藥

適應性喂養一周后,將110只小鼠隨機分為空白組、虛熱模型組、虛熱西洋參組(1 g/kg,相當于成人劑量6 g/d)、虛熱紫錐菊低劑量組、虛熱紫錐菊中劑量組、虛熱紫錐菊高劑量組、虛寒模型組、虛寒人參組(1 g/kg,相當于成人劑量6 g/d)、虛寒紫錐菊低劑量組、虛寒紫錐菊中劑量組、虛寒紫錐菊高劑量組,每組10只。虛熱組小鼠每天下午4:30灌胃給予甲狀腺片溶液160 mg/kg,虛寒組小鼠灌胃給予氫化可的松溶液25 mg/kg,每日1次,連續14天,制備虛熱及虛寒模型[10-11]。同時每日上午9:30開始灌胃給藥,各給藥組灌胃相應濃度的藥物,正常組和模型組給予等量生理鹽水,給藥體積為每0.2 mL/10 g,按體質量變化調整灌胃量。

紫錐菊臨床用量推薦3～6 g[6]。為保證藥性,以6 g為低劑量,取其40倍、20、10倍設高、中、低3個劑量組,即紫錐菊高劑量為4 g/kg(相當于成人劑量24 g/d)、中劑量為2 g/kg(相當于成人劑量12 g/d)、低劑量為1 g/kg(相當于成人劑量6 g/d)。

1.6 一般情況觀察

每日記錄小鼠精神狀態、毛發光澤度狀態等;并在第7天、14天、21天測體質量并加以記錄。于實驗第21天處死小鼠,將胸腺、脾臟稱重,并計算臟器指數=臟器質量/體質量(mg/g)。

1.7 檢測指標

實驗第22天早晨,小鼠摘眼球取血,靜置2～3小時,3500 r/min,離心15分鐘,吸取上層血清,采用ELISA檢測各組小鼠血清中cAMP、cGMP含量變化,并計算cAMP/cGMP比值。采用ELISA檢測各組小鼠血清中T3、T4指標的含量變化。采用比色法檢測各組小鼠血清TP含量變化,采用溴甲酚綠比色法檢測ALB含量變化,采用單試劑GPO-PAP法檢測TC、TG含量變化。

1.8 統計學處理

用SPSS 20.0統計軟件對實驗數據進行分析,實驗所得數據為計量資料且都符合正態分布,采用均數±標準差(±s)表示。虛熱組體質量、臟器指數、cAMP、cGMP、cAMP/cGMP、T3、T4、TP、ALB、TG、TC,虛寒組體質量、臟器指數、cAMP、T3、T4、TP、ALB、TC等指標符合方差齊性,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用LSD法;虛寒cGMP、cAMP/cGMP、TG等指標符合方差不齊性,采用Dunnett's檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學觀察

與空白組相比,虛熱組小鼠毛色及小便發黃、自主活動增加等,符合臨床虛熱癥狀。虛寒組消瘦、毛發無光澤、萎靡、蜷縮聚集等,符合臨床虛寒癥狀。與虛熱組小鼠相比,虛熱西洋參組小鼠的癥狀有一定程度的改善。與虛寒組相比,虛寒人參組小鼠的癥狀有一定改善。紫錐菊各劑量組小鼠與西洋參組小鼠狀態相似,對虛熱組小鼠有改善作用。

2.2 紫錐菊對虛熱、虛寒組小鼠體質量的影響

實驗第21天,與空白組相比,虛熱模型組小鼠體質量明顯減輕(P＜0.05)。與虛熱模型組相比,虛熱西洋參組及虛熱紫錐菊低、中、高劑量組小鼠體質量顯著增加(P＜0.05)。見表1。

表1 紫錐菊對虛熱組小鼠體質量的影響(±s,g)

表1 紫錐菊對虛熱組小鼠體質量的影響(±s,g)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與虛熱模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 第7天 第14天 第21天10 33.26±1.29 38.50±1.77 42.37±1.82虛熱模型組 10 33.75±2.09 38.09±1.32 39.02±2.89a虛熱西洋參組 10 34.14±0.78 38.15±1.02 41.62±1.90b虛熱紫錐菊低劑量組 10 33.55±0.60 37.56±1.41 41.36±1.75b虛熱紫錐菊中劑量組 10 33.46±1.29 37.96±1.36 42.10±2.21b虛熱紫錐菊高劑量組 10 33.84±1.01 38.41±1.73 42.35±2.47空白組b

實驗第21天,與空白組比較,虛寒模型組小鼠體質量明顯減輕(P＜0.05)。與虛寒模型組相比,虛寒人參組小鼠體質量明顯增加(P＜0.05);虛寒紫錐菊低、中、高劑量組小鼠體質量顯著降低(P＜0.05)。見表2。

表2 紫錐菊對虛寒組小鼠體質量的影響(±s,g)

表2 紫錐菊對虛寒組小鼠體質量的影響(±s,g)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與虛寒模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 第7天 第14天 第21天10 33.26±1.29 38.50±1.77 42.37±1.82虛寒模型組 10 34.07±1.08 37.11±1.92a 38.84±1.97a虛寒人參組 10 34.09±0.95 37.35±1.66 41.54±2.02b虛寒紫錐菊低劑量組 10 33.30±1.49 33.19±1.50b 33.75±2.25b虛寒紫錐菊中劑量組 10 33.89±0.60 33.03±0.97b 33.36±2.06b虛寒紫錐菊高劑量組 10 33.81±0.80 33.52±1.63b 33.19±1.89空白組b

2.3 紫錐菊對小鼠臟器指數的影響

與空白組相比,虛熱模型組小鼠脾臟、胸腺臟器指數顯著降低(P＜0.05)。與虛熱模型組相比,虛熱西洋參組及虛熱紫錐菊低、中、高劑量組小鼠脾臟、胸腺臟器指數明顯增加(P＜0.05)。見表3。

表3 紫錐菊對虛熱組小鼠臟器指數的影響(±s,mg/g)

表3 紫錐菊對虛熱組小鼠臟器指數的影響(±s,mg/g)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與虛熱模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 脾臟臟器指數 胸腺臟器指數空白組10 2.71±0.39 1.74±0.25虛熱模型組 10 1.48±0.30a 1.20±0.40a虛熱西洋參組 10 2.53±0.38b 1.65±0.37b虛熱紫錐菊低劑量組 10 2.62±0.30b 1.68±0.38b虛熱紫錐菊中劑量組 10 2.68±0.41b 1.60±0.23b虛熱紫錐菊高劑量組 10 2.61±0.35b 1.68±0.25 b

與空白組相比,虛寒模型組小鼠脾臟、胸腺臟器指數顯著降低(P＜0.05)。與虛寒模型組相比,虛寒人參組小鼠脾臟、胸腺臟器指數明顯增加(P＜0.05)。見表4。

表4 紫錐菊對虛寒組小鼠臟器指數的影響(±s,mg/g)

表4 紫錐菊對虛寒組小鼠臟器指數的影響(±s,mg/g)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與虛寒模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 脾臟臟器指數 胸腺臟器指數空白10 2.71±0.39 1.74±0.25虛寒模型組 10 1.58±0.25a 0.52±0.20a虛寒人參組 10 2.86±0.36b 1.53±0.20b虛寒紫錐菊低劑量組 10 1.60±0.26 0.50±0.26虛寒紫錐菊中劑量組 10 1.35±0.33 0.48±0.21虛寒紫錐菊高劑量組10 1.37±0.21 0.45±0.29

2.4 紫錐菊對小鼠環核苷酸水平的影響

與空白組相比,虛熱模型組小鼠cAMP、cGMP、cAMP/cGMP顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比,虛熱西洋參組及虛熱紫錐菊低、中、高劑量組cAMP、cAMP/cGMP顯著降低(P＜0.05),虛熱西洋參組及虛熱紫錐菊低、中劑量組cGMP顯著升高(P＜0.05)。見表5。

表5 紫錐菊對虛熱組小鼠環核苷酸水平的影響(±s)

表5 紫錐菊對虛熱組小鼠環核苷酸水平的影響(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與虛熱模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 cAMP(nmol/L) cGMP(nmol/L)cAMP/cGMP空白組10 30.62±4.41 11.04±1.54 2.64±0.31虛熱模型組 10 37.42±4.60a 13.98±2.73a 3.11±0.48a虛熱西洋參組 10 27.85±4.52b 18.56±2.22b 1.56±0.31b虛熱紫錐菊低劑量組 10 29.22±5.72b 18.83±2.99b 1.52±0.25b虛熱紫錐菊中劑量組 10 30.47±5.20b 18.09±3.05b 1.71±0.28b虛熱紫錐菊高劑量組 10 27.29±4.67b 12.86±0.81 1.89±0.42 b

與空白組相比,虛寒模型組cAMP、cAMP/cGMP顯著降低(P＜0.05),cGMP顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比,虛寒人參組cAMP、cAMP/cGMP顯著升高(P＜0.05),虛寒人參組及虛寒紫錐菊低、中、高劑量組cGMP顯著降低(P＜0.05)。見表6。

表6 紫錐菊對虛寒組小鼠環核苷酸水平的影響(±s)

表6 紫錐菊對虛寒組小鼠環核苷酸水平的影響(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與虛寒模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 cAMP(nmol/L) cGMP(nmol/L)cAMP/cGMP空白組10 30.62±4.41 11.04±1.54 2.64±0.31虛寒模型組 10 22.39±3.29a 22.45±1.76a 1.03±0.11a虛寒人參組 10 30.60±4.79b 11.20±0.83b 2.85±0.45b虛寒紫錐菊低劑量組 10 22.11±5.23 15.56±0.73b 1.31±0.43虛寒紫錐菊中劑量組 10 23.80±5.55 16.17±1.82b 1.49±0.40虛寒紫錐菊高劑量組 10 20.16±3.57 15.65±0.90b 1.20±0.34

2.5 紫錐菊對小鼠甲狀腺激素水平的影響

與空白組相比,虛熱模型組T3、T4含量顯著升高(P＜0.05)。與模型組小鼠相比,虛熱紫錐菊低、中、高組T3含量顯著降低(P＜0.05),虛熱西洋參組及虛熱紫錐菊中、高劑量組T4含量顯著降低(P＜0.05)。見表7。

表7 紫錐菊對虛熱組小鼠甲狀腺激素水平的影響(10只,±s,pmol/L)

表7 紫錐菊對虛熱組小鼠甲狀腺激素水平的影響(10只,±s,pmol/L)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

組別T3 T4空白組40.13±4.13 1205.00±304.16虛熱模型組 44.41±5.66a 1415.00±166.51a虛熱西洋參組 41.92±2.95 1091.25±162.77b虛熱紫錐菊低劑量組 37.43±2.68b 1275.00±273.55虛熱紫錐菊中劑量組 33.36±3.87b 985.00±157.81b虛熱紫錐菊高劑量組 34.43±2.96b 1063.75±258.86 b

與空白組相比,虛寒模型組小鼠T3、T4含量顯著降低(P＜0.05)。與模型組相比,虛寒紫錐菊低、中、高組小鼠T3含量顯著降低(P＜0.05),虛寒人參組T4含量顯著升高(P＜0.05),虛寒紫錐菊中、高劑量組T4含量顯著降低(P＜0.05)。見表8。

表8 紫錐菊對虛寒組小鼠甲狀腺激素水平的影響(10只,±s,pmol/L)

表8 紫錐菊對虛寒組小鼠甲狀腺激素水平的影響(10只,±s,pmol/L)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與虛寒模型組相比,b P＜0.05。

組別T3 T4空白組40.13±4.13 1205.00±304.16虛寒模型組 35.41±4.37a 932.50±240.16a虛寒人參組 36.63±3.73 1391.25±207.67b虛寒紫錐菊低劑量組 32.01±3.24b 758.75±167.41虛寒紫錐菊中劑量組 31.26±2.76b 440.00±147.48b虛寒紫錐菊高劑量組 28.25±2.73b 302.50±200.13 b

2.6 紫錐菊對小鼠物質代謝的影響

與空白組相比,虛熱模型組小鼠TP、ALB、TC、TG顯著降低(P＜0.05)。與虛熱模型組相比,虛熱西洋參組小鼠ALB顯著升高(P＜0.05);虛熱紫錐菊低劑量組小鼠TP、ALB顯著升高(P＜0.05);虛熱紫錐菊中、高劑量組小鼠TP、ALB、TG顯著升高(P＜0.05)。見表9。

表9 紫錐菊對虛熱組小鼠物質代謝的影響(±s)

表9 紫錐菊對虛熱組小鼠物質代謝的影響(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與虛熱模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 TP(g/L) ALB(g/L) G(mmol/L) TC(mmol/L)空白組 10 62.71±7.78 30.59±3.42 1.87±0.42 3.97±0.50虛熱模型組 10 54.85±2.93a 24.99±2.94a 1.43±0.24a 2.43±0.43a虛熱西洋參組 10 59.27±4.30 29.05±1.92b 1.63±0.27 2.74±0.52虛熱紫錐菊低劑量組 10 61.48±5.80b 29.67±2.04b 1.65±0.33 2.58±0.49虛熱紫錐菊中劑量組 10 63.00±7.04b 29.36±1.83b 2.05±0.43b 2.41±0.41虛熱紫錐菊高劑量組 10 61.60±5.95b 28.15±1.70b 1.83±0.18b 2.08±0.44

與空白組相比,虛寒模型組小鼠TP、ALB、TC、TG顯著升高(P＜0.05)。與虛寒模型組相比,虛寒人參組及虛寒紫錐菊醇提物低、中、高劑量組小鼠TP、ALB、TC、TG含量變化無統計學意義(P＞0.05)。見表10。

表10 紫錐菊對虛寒組小鼠物質代謝的影響(±s)

表10 紫錐菊對虛寒組小鼠物質代謝的影響(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與虛寒模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 TP(g/L) ALB(g/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L)空白組 10 62.71±7.78 30.59±3.42 1.87±0.42 3.97±0.50虛寒模型組 10 71.26±4.90a 36.23±2.50a 3.06±0.88a 5.30±0.96a虛寒人參組 10 76.15±9.75 34.42±2.94 2.94±0.41 5.92±0.99虛寒紫錐菊低劑量組 10 70.22±5.09 35.92±3.26 2.68±0.48 4.86±1.00虛寒紫錐菊中劑量組 10 69.63±6.98 37.98±2.25 2.56±0.39 5.76±0.85虛寒紫錐菊高劑量組 10 73.13±6.70 36.20±3.56 2.33±0.30 5.76±0.75

3 討論

中藥藥性是中藥理論的核心組成部分,是中醫藥學形成與發展的中藥基礎,寒熱溫涼四氣是中藥藥性研究的核心和主題內容[12]。陶弘景在《本草經集注》中明確指出:“藥物甘苦之味可略,為冷熱須明。”李中梓在《醫宗必讀》中也強調:“寒熱溫涼,一匕之謬,覆水難收。”可見四氣在藥性理論中的地位。中醫認為,虛熱是因機體陰液虧耗,制約陽熱功能減退,陰不制陽,出現燥熱、升動和化氣太過等陽相對亢盛的虛熱內生的病理狀態[13]。寒熱證病人出現中樞神經系統功能的異常變化,腦內神經遞質也發生相應變化。甲狀腺激素對機體產熱過程影響極大,可通過影響垂體-甲狀腺軸功能和細胞鈉泵活性,從而造成機體能量代謝的異常。環核苷酸是重要的細胞間信號轉導第二信使,與機體物質代謝有密切關系。內生致熱原引起發熱時,腦積液和下丘腦的cAMP含量明顯增加,所以陰虛發熱時,cAMP升高,cAMP/cGMP比值升高,虛寒時,cAMP、cAMP/cGMP降低[14],此指標是中醫微觀辨證的指標之一[15-17],是整體性調節機制影響細胞功能的中間樞紐,在維持機體平衡中起重要作用[18]。已有研究表明[19],虛熱狀態下cAMP/cGMP值明顯升高,并增加T3、T4等激素的釋放,提高產熱。黃俊山等[20]研究表明陰虛狀態下,T3、T4升高,基礎代謝率升高,產熱增多;陽虛狀態下,T3、T4含量降低,基礎代謝率降低,產熱減少。甲亢狀態下血脂與甲狀腺素水平呈負相關性[21],TG、TC、TP、ALB水平過低[22-24];陽虛狀態下TG、ALB、TP含量明顯高于正常組[25-26]。本實驗虛熱模型組cAMP、cAMP/cGMP、T3、T4顯著升高,TP、ALB、TC、TG顯著降低;虛寒模型組cAMP、cAMP/cGMP、T3、T4顯著降低,TP、ALB、TC、TG顯著升高,表明本實驗造模成功。

有學者研究仙茅辛熱藥性的表達,實驗以左歸丸為陽性藥,仙茅在甲狀腺功能、腎上腺功能、環核苷酸水平及物質代謝水平等方面與左歸丸表現一致,佐證了仙茅的辛熱藥性[26]。李琳[27]基于能量代謝及基因表達研究枳實寒熱屬性,實驗以熱藥干姜、寒藥大黃為陽性藥,通過PLSR散點圖結果分析,枳實的干預效果介于干姜和大黃之間,佐證了枳實藥性微溫。本實驗結果顯示紫錐菊能增加虛熱模型動物的體質量及胸腺、脾臟等臟器指數,與西洋參的作用趨勢一致。能降低虛寒模型動物的體質量及胸腺、脾臟等臟器指數,與人參的作用趨勢相反。人參性溫,西洋參性涼,因此,證明紫錐菊的藥性與西洋參趨同,為寒涼性質。與虛寒模型組相比,虛寒人參組cAMP、cAMP/cGMP、T4含量顯著升高;虛寒紫錐菊組cAMP、cAMP/cGMP、TP、ALB、TG、TC含量無明顯變化,T3、T4含量顯著降低,表明紫錐菊與人參作用相反。與虛熱模型組相比,虛熱西洋參組cAMP、cAMP/cGMP、T4含量顯著降低,ALB、TP、TG、TC含量顯著升高或有升高的趨勢;虛熱紫錐菊組cAMP、cAMP/cGMP、T3、T4含量顯著降低,TP、ALB、TG含量顯著升高,表明紫錐菊與西洋參作用相似,藥性寒涼。

紫錐菊是近代國際上以免疫調節、抗病毒等生物活性受到普遍重視的天然植物草藥,其普遍的制劑為乙醇浸出液制劑,因此本實驗以指導臨床應用為導向,研究紫錐菊醇提物的寒熱藥性。隨著現代科技的進步,對中藥寒熱藥性理論的研究方法不斷提升,除了對物質基礎進行研究外,還開始探尋其內在機制,不斷向微觀領域深入,如基因組學、蛋白組學、代謝組學等研究方法[28]。本實驗通過環核苷酸、內分泌、物質代謝水平對紫錐菊醇提物的寒熱藥性進行驗證,為紫錐菊在中藥藥性指導下進行下一步的中醫功效研究奠定實驗基礎,后期仍需對其寒熱藥性的物質基礎及機制進行深入的研究。