參竹降糖方對糖尿病氣陰兩虛證大鼠模型血糖、血脂及神經內分泌免疫功能的影響

孟智睿 李麗 邵紫萱 劉佳琪 扈覲璽 高晶 王景霞 孟慶飛 王曉茹 陳梅

在中醫理論中,2型糖尿病屬于消渴癥的范疇[1-2],在中醫臨床中被分為濕熱困脾、血瘀脈絡、陰虛熱盛、氣陰兩虛、陰陽兩虛等五種證型[3],其中氣陰兩虛是最常見的證型,常采用益氣養陰之法治療[4]。本文針對糖尿病氣陰兩虛證候類型,擬研發一款保健食品配方“參竹降糖方”,以輔助高危人群降血糖。輔助降血糖是目前中國保健食品的27個保健功能之一,據初步統計,輔助降血糖的保健食品90%是以中藥為原料的復方產品,其安全性比藥品高,生物活性比普通食品強。隨著健康意識的增強,這類輔助降血糖的保健食品的市場需求越來越大。但是,目前這類中藥保健食品只有現代保健功能,沒有中醫證候分型及相應的中醫功效。本研究通過建立氣陰兩虛型高血糖動物模型,評價其益氣養陰降血糖的作用,為開發針對氣陰兩虛型人群的降血糖的保健食品提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠60只,體質量(220±20)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養于SPF級屏障環境中,SPF級大鼠維持飼料由北京科澳協力飼料有限公司提供。特殊高脂飼料(豬油10%、蔗糖15%、蛋黃粉15%、酪蛋白5%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、碳酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、鼠維持飼料52.6%)購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。實驗符合北京中醫藥大學相關倫理學要求,倫理審查編號:BUCM-4-2019110201-4032。

1.2 實驗藥物

參竹降糖方組成:人參片1.5 g(批號:20190501-1)、桑葉3 g(批號:20190501)、葛根3 g(批號:20190501)、玉竹4 g(批號:20190501)、青錢柳3 g(批號:20190518)、蜂膠粉0.5 g(批號:20190618),除去蜂膠粉以外實驗藥品均用飲片經過水提濃縮而得,每次配藥時再等比例加入蜂膠粉。其中人參片、桑葉、葛根、玉竹均購于河北祁新中藥顆粒飲片有限公司;青錢柳購買于河北省保定市安國市祁州藥市;蜂膠粉(含70%蜂膠)由河南長葛提供。十味消渴膠囊(天津中新藥業集團股份有限公司,規格:0.44 g/粒,批號:09950063)。

1.3 主要試劑

鏈脲佐菌素(sigmag公司,批號:S0130),環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)試劑盒(優爾生生物科技有限公司,批號:L191114614),環磷酸鳥苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)試劑盒(優爾生生物科技有限公司,批號:L191008130),三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3)試劑盒(優爾生生物科技有限公司,L191114551),甲狀腺素(Thyroxine,T4)試劑盒(優爾生生物科技有限公司,L191104072),空腹胰島素(fasting insulin,FINS)試劑盒(優爾生生物科技有限公司,批號:L191102001),高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein,HDL)試劑盒(長春匯力生物技術有限公司,批號:2019007),低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein,LDL)試劑盒(長春匯力生物技術有限公司,批號:2019011),血清膽固醇(total cholesterol,TC)試劑盒(長春匯力生物技術有限公司,批號:2019009),甘油三酯(triglyceride,TG)試劑盒(長春匯力生物技術有限公司,批號:2019008),L-甲狀腺素鈉(BioRuler,批號:r5703),D(+)-無水葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20181205),4%多聚甲醛(武漢谷歌生物科技有限公司,批號:G1101)。

1.4 分組及給藥

大鼠適應性喂養5天,禁食過夜12小時后,使用便攜式血糖測定儀取尾靜脈血測量血糖值,測定給葡萄糖前(即0小時)血糖值,再測定給2.5 g/kg體脂量葡萄糖后0.5、2小時血糖值,作為該批次動物基礎值[5]。以0、0.5小時血糖水平分為6個組,每組10只,即空白組、模型組、十味消渴組(1.32 g/kg,相當于人體劑量7.92 g/天)、參竹降糖高劑量組(7.5 g/kg,相當于人體劑量45 g/天)、參竹降糖中劑量組(2.5 g/kg,相當于人15 g/天)、參竹降糖低劑量組(1.25 g/kg,相當于人體劑量7.5 g/天)。

從實驗第一天開始給每組動物進行預防給藥,灌胃時間連續33天(給藥體積:1 mL/100 g)。空白對照組不做處理,模型對照組給予同體積溶劑,其余各組灌胃相應藥物。

1.5 造模方法

參考《保健食品檢驗與評價技術規范(2003年版)》輔助降血糖功能評價方法中的胰島素抵抗糖/脂代謝紊亂模型,結合中醫氣陰兩虛證候的造模方法,建立由勞倦傷脾、T4皮下注射、高脂飼料喂養合并鏈脲佐菌素注射制備氣陰兩虛型高血糖大鼠模型[6]。

適應性喂養5天后,開始造模,造模周期維持33天:(1)第一周各組給予維持料飼養,一周后模型組、十味消渴組及參竹降糖高、中、低劑量組更換高熱能飼料,喂飼3周。(2)負重游泳力竭運動:在實驗的8～21天灌胃給藥結束1小時后進行負重力竭游泳運動,在大鼠尾根部負荷其體重10%的鉛塊,放入0.8 m×0.8 m×1 m的游泳桶內,水深0.7米,水溫(20±5)℃,使大鼠在水中不能用尾巴接觸桶底,每桶放置2只[7]。力竭標準:①游泳動作明顯失調,不能再堅持;②大鼠鼻尖沒過水里超過3秒不能回到水面。停止游泳,及時撈起,吹干毛發。(3)T4皮下注射:在實驗第22～28天下午14:00進行上頸部皮下注射T4混懸液(0.2 mg/kg)。(4)在實驗第28天T4注射結束后,模型組、十味消渴組及參竹降糖高、中、低劑量組禁食24小時(不禁水)[8],在實驗第29天給予2%鏈脲佐菌素溶液(30 mg/kg)一次性腹腔注射(現用現配,取適量鏈脲佐菌素,錫紙避光于冰塊之中避光保存,用0.1 mol/L檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液在冰浴中配置溶液,pH=4.5),注射量為1 mL/100 g體質量[9-12]。注射后繼續給予高熱能飼料喂飼5天,結束實驗。

實驗結束后,各組動物禁食12小時,檢測空腹血糖值(fasting blood glucos,FBG)、糖耐量、FINS、TC、TG水平。模型組空腹血糖值≥10 mmol/L或0.5小時、2小時任一時間點血糖升高或血糖曲線下面積升高,與空白組相比有顯著性差異,判斷糖代謝紊亂模型成立[5]。模型組TC或TG明顯升高,與空白組比較有顯著性差異,判定脂代謝紊亂模型成立。

1.6 檢測指標

1.6.1 大鼠證候表征的觀察 觀察大鼠造模前和造模后證候表征的變化,即大鼠毛色、尿量、排便情況、自主活動的表現。運用電子稱,在實驗第33天給各組大鼠稱量體質量。每日觀察記錄各組大鼠的肛溫、攝食量、飲水量、排尿量、排便量。

1.6.2 血糖測定及相關指數計算 用血糖試紙,按說明書操作,尾尖靜脈取血測FBG。胰島素抵抗指數(homeostasismodel assessment-insulin resistance,HOMA-IR)=胰島素/22.5e-ln FBG≈(FBG×FINS)/22.5;胰島β細胞功能指數(homeostasismodel assessment-β,HOMA-β)=20×FINS/(FBG-3.5);胰島素敏感指數(insulin sensitivity index,ISI)=ln(l/FINS×FBG)。

1.6.3 大鼠負重游泳力竭運動時間 實驗第34天早晨進行最后一次負重游泳力竭運動,記錄負重游泳時間。

1.6.4 臟器指數、血脂、胰島素、甲狀腺激素、環核苷酸等指標的檢測 實驗第33天灌胃結束后禁食不禁水,于第34天早晨進行最后一次負重游泳力竭運動,30分鐘后處死動物并取材。巴比妥鈉麻醉,腹主動脈取血,300 r/min、離心半徑2 cm環境下離心10分鐘,取上清,4℃保存待測,取胸腺、脾臟并稱重,計算各組大鼠胸腺、脾臟指數,臟器指數=臟器質量(g)/體質量(g)。采用比色法在全自動生化儀上測各組大鼠血清TC、TG、LDL、HDL的濃度。采用酶聯免疫法檢測血清T3、T4、FINS、cAMP和cGMP的含量,并計算cAMP/cGMP比值。

1.7 統計學處理

實驗所得數據為計量資料,使用SAS 9.4統計軟件進行統計分析。經檢驗所有數據均服從正態分布且方差齊,用均值±標準差(±s)表示,組間比較用單因素方差(Oneway ANOVA)分析,兩兩數據比較用LSD法,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠一般狀況的影響

實驗期間觀察模型組大鼠的狀態,力竭游泳結束后,大鼠懶動無力、便溏、爪色青紫。注射T4后,大鼠情緒出現躁動,大便稍變干、毛發枯槁、易掉落,飲水量、進食量增加,舌紅,小便黃,大便干。注射鏈脲佐菌素后,大鼠毛發枯黃、無光澤、易脫落,飲水量、飲食量皆顯著增加,舌色鮮紅,小便增多,大便干、色黑,呈現出氣陰兩虛的證候表現。在給藥后,參竹降糖各劑量組大鼠毛發光澤度增強、脫落現象減少、自主活動正常,舌色紅,爪色淡紅,大便干、色黑。

2.2 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠體重、飲水量、進食量、排尿量、排便量、肛溫的影響

實驗第33天,與空白組相比,模型組大鼠體質量顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較,十味消渴組及參竹降糖高、中、低劑量組大鼠體質量顯著升高(P＜0.01)。與空白組比較,模型組大鼠飲水量、進食量、排尿量、排便量、肛溫顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較,十味消渴組及參竹降糖高、中、低劑量組均能使大鼠飲水量、進食量、排尿量、排便量、肛溫顯著降低(P＜0.01)。見表1。

表1 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠體重、飲水量、進食量、排尿量、排便量、肛溫的影響(10只,±s)

表1 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠體重、飲水量、進食量、排尿量、排便量、肛溫的影響(10只,±s)

注:與空白組比較,a P＜0.01;與模型組比較,b P＜0.01。

組別 體質量(g) 飲水量(g) 進食量(g) 排尿量(g) 排便量(g) 肛溫(℃)10.36±1.21 36.27±0.20模型組 261.3±6.94a 202.9±3.60a 33.95±2.28a 122.8±1.81a 32.4±1.96a 37.66±0.18a十味消渴組 325.4±17.78b 154.8±8.62b 24.49±1.24b 82.7±1.89b 22.6±1.20b 36.99±0.22b參竹降糖低劑量組 299.5±15.88b 155.7±7.28b 22.92±2.83b 81.2±4.59b 22.5±2.17b 36.74±0.25b參竹降糖中劑量組 319.5±15.73b 156.6±6.57b 23.72±2.51b 80.0±4.11b 22.9±2.31b 36.91±0.31b參竹降糖高劑量組 282.8±19.61b 156.9±6.06b 21.85±1.95b 85.4±2.41b 23.23±2.04b 36.82±0.13空白組 378.1±24.58 105.6±3.93 22.3±1.81 31.0±1.49 b

2.3 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-β、ISI的影響

與空白組比較,模型組大鼠FBG、HOMA-IR顯著升高,FINS、HOMA-β、ISI顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較,十味消渴組及參竹降糖高、中、低劑量組大鼠FINS、HOMA-β、ISI顯著升高,FBG、HOMA-IR顯著降低(P＜0.01)。見表2。

表2 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-β、ISI的影響(10只,±s)

表2 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-β、ISI的影響(10只,±s)

組別 FBG(mmol/L) FINS(pg/mL) HOMA-IR HOMA-β ISI空白組 5.19±0.47 237.11±14.49 51.10±4.90 2909.50±857.90 -7.04±0.10模型組 15.68±4.92a 183.60±18.54a 143.00±53.07a 610.6±216.30a -8.01±0.38a十味消渴組 6.54±0.44b 214.86±28.04b 58.31±9.18b 1410.8±209.70b -7.27±0.18b參竹降糖低劑量組 8.29±2.07b 220.53±9.96b 75.68±24.76b 1375.3±584.10b -7.28±0.29b參竹降糖中劑量組 7.26±2.10b 214.91±27.88b 79.71±20.20b 973.0±357.60c -7.37±0.29b參竹降糖高劑量組 7.29±1.54b 203.93±6.34b 69.89±18.04b 1214.3±462.00c -7.27±0.19 b

2.4 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠血脂的影響

與空白組比較,模型組大鼠TC、TG、LDL顯著升高,HDL顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較,十味消渴組及參竹降糖高、中、低劑量組大鼠TC、TG、LDL顯著降低(P＜0.01),HDL顯著升高(P＜0.05,P＜0.01)。見表3。

表3 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠血脂的影響(10只,±s,mmol/L)

表3 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠血脂的影響(10只,±s,mmol/L)

注:與空白組比較,a P＜0.01;與模型組比較,b P＜0.01,c P＜0.05。

組別TC TG LDL HDL空白組2.26±0.19 0.93±0.14 1.07±0.08 0.16±0.02模型組 2.49±0.11a 1.14±0.06a 1.26±0.10a 0.10±0.01a十味消渴組 2.14±0.20b 0.87±0.11b 1.11±0.08b 0.12±0.01b參竹降糖低劑量組 2.05±0.14b 0.83±0.03b 0.94±0.05b 0.11±0.01b參竹降糖中劑量組 2.08±0.19b 0.95±0.04b 1.08±0.09b 0.13±0.03b參竹降糖高劑量組 2.03±0.19b 0.82±0.07b 1.03±0.10b 0.13±0.03 c

2.5 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠T3、T4、cAMP、cGMP、cAMP/cGMP的影響

與空白組進行比較,模型組大鼠T3、T4、cAMP及cAMP/cGMP顯著升高(P＜0.01),cGMP顯著降低(P＜0.01)。與模型組進行比較,十味消渴組大鼠T3有下降趨勢,T4、cAMP、cAMP/cGMP顯著降低(P＜0.01),cGMP顯著升高(P＜0.01);參竹降糖方各劑量組T3、T4、cAMP均顯著降低(P＜0.01),cGMP顯著升高(P＜0.01)。見表4。

表4 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠T3、T4、cAMP、cGMP、cAMP/cGMP的影響(10只,±s)

表4 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠T3、T4、cAMP、cGMP、cAMP/cGMP的影響(10只,±s)

注:與空白組比較,a P＜0.01;與模型組比較,b P＜0.01,c P＜0.05。

組別 T3(pg/mL) T4(ng/mL) cAMP(pg/mL) cGMP(pg/mL)cAMP/cGMP空白組 586.70±101.70 20.29±1.85 2586.83±384.84 49 1.50±58.35 5.67±0.84模型組 767.67±87.59a 31.17±3.27a 3451.34±495.19a 285.50±33.86a 6.91±0.76a十味消渴組 713.53±106.39 26.07±2.97c 2213.07±381.11c 323.01±43.80b 5.81±0.76c參竹降糖低劑量組 579.82±122.67c 26.37±1.90c 2401.86±256.12c 363.65±37.55c 5.59±0.58c參竹降糖中劑量組 469.48±102.26c 23.52±3.66c 1904.04±392.90c 331.32±40.87b 5.53±0.93c參竹降糖高劑量組 327.53±35.90c 16.05±0.55c 1227.01±254.00c 620.02±187.53c 1.80±0.30 c

2.6 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠脾臟、胸腺的影響

與空白組比較,模型組大鼠脾臟指數、胸腺指數顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較,十味消渴組及參竹降糖高、中、低劑量組大鼠脾臟指數、胸腺指數均顯著升高(P＜0.01)。見表5。

表5 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠脾臟、胸腺的影響(10只,±s)

表5 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠脾臟、胸腺的影響(10只,±s)

注:與空白組比較,a P＜0.01;與模型組比較,b P＜0.01。

組別 脾臟指數 胸腺指數空白組0.00238±0.00034 0.00143±0.00033模型組 0.00180±0.00017a 0.00101±0.00016a十味消渴組 0.00230±0.00016b 0.00162±0.00026b參竹降糖低劑量組 0.00240±0.00020b 0.00145±0.00020b參竹降糖中劑量組 0.00248±0.00023b 0.00136±0.00026b參竹降糖高劑量組 0.00267±0.00026b 0.00140±0.00016 b

2.7 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠力竭游泳的影響

與空白組比較,模型組大鼠力竭游泳時間顯著降低(P＜0.01)。與模型組進行比較,十味消渴組及參竹降糖高、中、低劑量組均能延長大鼠力竭游泳時間(P＜0.01)。結果見表6。

表6 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠力竭游泳的影響(±s,秒)

表6 參竹降糖方對氣陰兩虛型高血糖大鼠力竭游泳的影響(±s,秒)

注:與空白組比較,a P＜0.01;與模型組比較,b P＜0.01。

組別 鼠只 力竭游泳時間空白組10 141.90±23.43模型組 10 53.10±8.35a十味消渴組 10 132.70±40.63b參竹降糖低劑量組 10 121.10±8.99b參竹降糖中劑量組 10 135.00±15.64b參竹降糖高劑量組 10 132.90±16.86 b

3 討論

本研究依據中醫對氣陰兩虛證的病機認識,從中醫整體觀念的角度出發,采用強迫大鼠進行負重力竭游泳模擬中醫勞倦傷脾,高脂飼料模擬肥甘厚味傷脾損氣所致氣虛證的發生,T4注射致陰虛,再結合小劑量鏈脲佐菌素注射,建立高血糖的氣陰兩虛證候模型[13-14]。參竹降糖方由人參、桑葉、葛根、玉竹、青錢柳、蜂膠組成,方以人參、桑葉為君,益氣養陰;葛根、玉竹、青錢柳為臣,生津止渴;蜂膠為佐,補虛化濁止渴。諸品合用,共奏益氣養陰、生津止渴之功。根據方中藥物的藥性藥效及主要的功能主治,基于中醫方證對應和證效相關理論,此方可用于氣陰兩虛證,因此可采用以上病證結合模型研究其降血糖功能及益氣養陰功效。本實驗選取的陽性對照藥為十味消渴膠囊(國藥準字Z19990033),是由天津中新藥業集團股份有限公司樂仁堂制藥廠生產的已經上市的降糖中藥復方制劑,同樣具有益氣養陰、生津止渴的中醫功效,因其療效確切,被廣泛用于消渴病。因此,以十味消渴膠囊對比研究中藥復方益氣養陰降血糖作用。

本實驗顯示,模型大鼠空腹血糖顯著升高,TC、TG、LDL顯著升高,FINS顯著降低,HOMA-IR明顯升高,ISI、HOMA-β下降,說明模型大鼠機體內存在糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗。給予參竹降糖方后,能夠穩定的控制血糖,使模型大鼠的TG、TC、LDL顯著降低,FINS、HDL顯著升高,HOMA-IR指數降低,ISI指數、HOMA-β指數提高。說明參竹降糖方能降低血糖,調節脂代謝紊亂,緩解胰島素抵抗,提高胰島素敏感性及增強胰島β細胞功能,顯示其具有輔助降血糖的功能。

T3、T4作為下丘腦—垂體—甲狀腺軸中甲狀腺分泌的關鍵激素,調節機體產熱的功能,同時還有調控機體能量代謝的作用[15]。cAMP、cGMP是反映體液免疫功能的重要指標。cAMP、cGMP作為第二信使參與細胞內能量的代謝,調控能量代謝信號的正常傳遞,是機體內能量代謝的重要標志,其含量可影響機體神經內分泌功能[16]。在本實驗中,與空白組相比,模型組T3、T4顯著升高,cAMP升高而cGMP降低,cAMP/cGMP比值顯著升高,表明本實驗模型組大鼠存在陰虛證候狀態。參竹降糖高、中、低劑量組顯著降低血清T3、T4含量,降低cAMP含量,升高cGMP含量,顯著降低cAMP/cGMP比值[17]。表明參竹降糖方可以調節氣陰兩虛高血糖大鼠陰虛證候的相關指標,具有養陰生津止渴的功效。

中醫認為勞則氣耗,大鼠負重力竭游泳時間可以作為氣虛的指標[18]。另外,現代研究顯示,脾氣虛證與免疫功能關系密切,主要表現在細胞免疫、非特異性免疫功能低下。胸腺與脾臟是機體重要的免疫器官,其結構的正常與否直接影響機體的免疫功能。胸腺指數與脾臟指數是反映機體胸腺和脾臟免疫功能的重要指征之一[19]。本實驗中模型組大鼠力竭游泳時間與空白組相比明顯縮短,脾臟指數、胸腺指數均顯著降低。參竹降糖高、中、低劑量組均能明顯延長大鼠力竭游泳時間,提高脾臟指數、胸腺指數,表明參竹降糖方具有健脾益氣的功效。

同時從模型大鼠的癥狀上看,飲食量、飲水量、排尿量都顯著升高,肛溫也明顯升高,精神不振、毛發枯黃,無光澤,易脫落、體質量下降、舌色淡紅等癥狀,與臨床上氣陰兩虛證的癥狀表現相符[20]。參竹降糖方能使模型大鼠飲水量、進食量、排尿量、排便量、肛溫降低,體質量逐漸增加,毛色恢復光澤,毛發脫落減少,情緒較為穩定,說明其對氣陰兩虛證侯表征也有明顯的改善作用。

綜上,參竹降糖方不僅具有輔助降血糖功能,還能調節脂代謝紊亂,緩解胰島素抵抗,又能益氣養陰、生津止渴,改善體質癥狀。本配方保健食品,與藥物相比作用溫和,具有更高的安全性,同時基于辨證保健理論,針對氣陰兩虛證候狀態的血糖偏高人群,為進一步進行中醫辨證分型的人體試驗研究評價,實現精準保健提供了實驗依據。