麥粒灸干預甲狀腺功能減退大鼠免疫應答的實驗研究

韓效 屈玉明 郝重耀 張天生 趙季宇 王紅陽

甲狀腺功能減退(以下簡稱“甲減”)是因多種原因致甲狀腺激素產生釋放障礙或生理效應降低,引發機體全身性代謝降低的一種綜合證候[1]。各年齡段皆可見,好發于女性群體,患病率為17.8%[2]。甲減對機體的負面影響涉及生長發育、生活質量、學習記憶等諸多方面,免疫內環境紊亂是其不良鏈條的重要一環[3]。多項研究表明,甲狀腺自身抗體和炎癥因子介入了甲減的病程中并影響著甲狀腺功能活動[4-7]。

艾灸作為傳統的中醫療法,能溫經散寒、祛風除濕、溫陽益氣,適用于虛寒性疾病及久病體虛者。研究證明,艾灸可緩解甲減的癥狀,提升甲狀腺素血清濃度[8-9]。麥粒灸作為艾灸的一種,操作簡單,病患痛苦小,易于推行。本實驗采取丙硫氧嘧啶(propyl-thiouracil,PTU)灌胃的方法構建甲狀腺功能減退大鼠模型[10],通過觀察麥粒灸對自身免疫應答的影響,探討麥粒灸對甲減大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康4～6周齡SPF級SD大鼠30只(雌雄各半),體質量160～180 g,購自北京斯貝福生物技術有限公司,許可證編號:SCXK(京)2019-0010。實驗已獲得山西省針灸研究所生物醫學研究倫理委員會的準許(倫理科2020第003號)。

1.2 藥品與試劑

PTU為50 mg/100片,上海朝暉藥業有限公司,批號:2008N18;石蠟、甲醛,上海國藥集團,批號:690189691,10010018;廣譜二抗、DAB濃縮型試劑盒,上海長島生物技術有限公司,批號:D-3004、FL-6001;蘇木素,BASO公司,批號:714094;大鼠游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine,FT4)、促甲狀腺素(thyrotropin,TSH)試劑盒(貨號:SU-B31011、SUB31010、SU-B30271);甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibodies,TGAb)試劑盒(貨號:SU-B30541、SU-B30542);干擾素(interferonγ,IFN-γ)、白介素10(interleukin 10,IL-10)、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)試劑盒,批號:SU-B30194、SU-B31073、SU-B30173,均購于WKSUBIO公司。

1.3 儀器與設備

正置顯微鏡,OLYMPUS公司,型號:CX41;石蠟切片機,徠克公司,型號:SQ2125;攤片機,徠克公司,型號:PPTHK-21B;水浴鍋,Leica公司,型號:HI1210;數碼相機,NIKON公司,型號:D5100;移液器(吉爾森P型移液器),PiPetman;酶標儀,Rayto公司,型號:RT-6100;恒溫烤箱,上海恒一公司。

1.4 分組、模型制備及干預

適應性飼養7天后,依照隨機數字表法將30只SD大鼠平均分為空白組、模型組和麥粒灸組。將PTU研碎后配置成0.1%的PTU混懸液,灌胃劑量為1 mL/100 g[10]。空白組以生理鹽水灌胃,其余兩組予PTU灌胃,各組等量同時操作,每日一次,先連續灌胃4周。四周后,模型組和麥粒灸組繼續給予0.1%的PTU(因停藥后,大鼠甲狀腺功能狀態漸漸恢復,所以治療期間仍以PTU維持甲減狀態),劑量為10 mg/1 kg;空白組按1mL/100 g予等劑量生理鹽水,隔日一次,各組再連續灌胃4周。每周稱重換算以調整給藥劑量。

1.5 干預方法

把純艾絨用定制麥粒灸模具制成基底部2.5～3.0 mm,高度為4～5 mm的麥粒柱,于大鼠的大椎、命門、腎俞(雙)、脾俞(雙)處施灸,每個麥粒燃燒時間10～12秒,隔日一次,連續干預4周。取穴參照《實驗針灸學》[11],并結合動物比較學方法進行。

1.6 標本采集及指標檢測

1.6.1 實驗前后測量大鼠體質量 于適應性期飼養后、造模期后、干預期后用電子天平稱重,記錄三組大鼠體質量。

1.6.2 測量脾臟、胸腺質量及臟器指數 依體質量計算水合氯醛(0.3 mL/100 g)劑量麻醉大鼠,經腹主動脈取血于采血管,靜置30分鐘離心取上清液。將甲狀腺組織放入4%多聚甲醛固定液中;取脾臟、胸腺,用0.9%氯化鈉溶液清洗干凈,濾紙吸干后電子天平稱重,計算臟器指數(器官重量/體重)。

1.6.3 甲狀腺病理組織觀察 將甲狀腺于固定液中取出,各濃度乙醇逐級脫水,50%酒精+二甲苯透明,浸蠟包埋切片備HE染色,拍照采集切片標本。

1.6.4 血清細胞因子表達測定 將血清樣品解凍后混勻,按照ELISA試劑盒操作步驟嚴格進行,最后用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(optical density,OD),計算甲狀腺功能(FT3、FT4、TSH)、自身抗體(TPOAb、TGAb)以及炎癥因子(IFN-γ、TGFβ1、IL-10)濃度。

1.6.5 免疫組化染色組織 將甲狀腺切片組織脫蠟水化,于檸檬酸鈉中高壓修復后洗滌,加H2O2濕盒孵育后繼續洗滌;加非免疫、正常羊血清封閉非特異性抗原,濕盒孵育后PBS洗凈,滴加一抗孵育過夜。取出后室溫放置40分鐘,PBS洗滌后加HRP標記二抗(兔抗)孵育,DAB染色,自來水沖洗,蘇木精復染,酒精分化脫水,二甲苯透明后中性樹膠封片,拍照采集分析,計算炎癥因子的平均光密度值(average optical density,AOD)。

1.7 統計學方法

數據結果運用SPSS 25.0統計軟件進行分析,實驗結果為計量資料,以均數±標準差(±s)表示。所有計量數據檢驗后均符合正態性分布,經方差齊性檢驗,如方差齊,各組間比較選擇單因素方差(One-way ANOVA)分析;若方差不齊,則各組間比較選用韋爾奇(Welch)或布朗(Brown)檢驗;組間兩兩比較采取t檢驗,以P＜0.05認為存在統計意義。

2 結果

2.1 麥粒灸對甲減大鼠體質量的影響

三組大鼠在實驗前的體質量沒有明顯差異(P＞0.05);造模后,模型組和麥粒灸組大鼠較空白組體質量有大幅下降(P＜0.05)。觀察大鼠行為發現,模型組和麥粒灸組大鼠出現活動遲緩、畏寒蜷臥、喜聚堆、皮肉松懈、體毛枯疏無光等狀況;麥粒灸干預后,該組體質量較模型組上升(P＜0.05),大鼠體毛逐漸光亮、活動頻繁,雖仍低于空白組大鼠,但與其差別無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組甲狀腺功能減退大鼠實驗前后體質量變化比較(±s,g)

表1 各組甲狀腺功能減退大鼠實驗前后體質量變化比較(±s,g)

注:與空白組同一時間相比,a P＜0.05;與模型組干預后相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 體質量空白組10 實驗前 204.53±8.59 造模后 285.28±11.12 干預后 322.93±37.13模型組 10 實驗前 200.07±8.39 造模后 228.72±26.61a 干預后 227.30±30.26a麥粒灸組 10 實驗前 200.40±6.84 造模后 221.23±20.26a 干預后 284.60±32.25 b

2.2 麥粒灸對甲減大鼠脾和胸腺的影響

脾臟和胸腺在較大意義上代表了機體免疫功能狀態。與空白組相比,模型組和麥粒灸組的脾質量、脾指數、胸腺質量降低(P＜0.05),兩組的胸腺指數較空白組有下降趨勢,但無統計學差異(P＞0.05);與模型組相比,麥粒灸組臟器質量及指數無顯著差異(P＞0.05)。見表2。

表2 各組甲狀腺功能減退大鼠脾、胸腺質量及臟器指數比較(±s)

表2 各組甲狀腺功能減退大鼠脾、胸腺質量及臟器指數比較(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05。

脾組別 鼠只質量(g) 指數(0.01g/g)胸腺質量(g) 指數(0.01 g/g)10 0.56±0.11 0.19±0.04 0.46±0.16 0.14±0.04模型組 10 0.33±0.03a 0.14±0.02a 0.26±0.05a 0.10±0.02麥粒灸組 10 0.38±0.08a 0.13±0.03a 0.28±0.12a空白組0.11±0.04

2.3 麥粒灸對甲減大鼠病理組織的影響

HE染色鏡下見空白組濾泡較大,呈卵圓形較且均勻分布,腔內充滿淡粉色膠樣物質;濾泡為圓核的單層柱狀上皮細胞。與空白組比,模型組則濾泡腔內膠樣物減少,濾泡形態各異,散亂排列,增生較多,細胞較肥大。與模型組比較,麥粒灸組濾泡腔內膠狀物增多且分布較均勻,濾泡大小較為一致,結構較清晰。見圖1。

圖1 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺組織病理學觀察(HE,×200)

2.4 麥粒灸對甲減大鼠血清甲狀腺功能的影響

模型組的FT3、FT4濃度較空白組有較大程度下降,TSH濃度有大幅度的升高,均存在統計學差異(P＜0.05);與模型組比較,麥粒灸組TSH濃度較大程度下降(P＜0.05),血清FT3、FT4濃度上升(P＜0.05);與空白組比較,TSH濃度無統計學意義(P＞0.05),FT3、FT4濃度顯著下降(P＜0.05)。見表3。

表3 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中甲狀腺功能水平比較(10只,±s)

表3 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中甲狀腺功能水平比較(10只,±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

組別 FT3(pmol/L)FT4(pmol/L)TSH(mU/L)6.42±0.35 16.40±1.20 7.81±0.91模型組 3.37±0.56 a 6.20±0.81 a 19.10±0.85 a麥粒灸組 4.19±0.34 ab 12.94±0.81 ab 10.31±3.09空白組b

2.5 麥粒灸對甲減大鼠甲狀腺自身抗體的影響

作為反映甲減免疫狀態紊亂的顯著指征,模型組大鼠TPOAb與TGAb含量遠大于空白組(P＜0.05);雖然麥粒灸組血清TPOAb含量稍有降低趨勢,但其差異與模型組相比無統計學意義(P＞0.05);TGAb水平較模型組顯著降低,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中TPOAb和TGAb含量變化(±s)

表4 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中TPOAb和TGAb含量變化(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 TPOAb(U/mL) TGAb(IU/mL)10 7.44±1.70 35.45±6.55模型組 10 13.65±1.40 a 90.40±10.25 a麥粒灸組 10 12.99±1.37 a 72.23±13.22空白組b

2.6 麥粒灸對甲減大鼠血清細胞因子表達的影響

與空白組相比,模型組IFN-γ及轉換因子濃度明顯升高(P＜0.05),血清IL-10濃度顯著下降(P＜0.05);麥粒灸組血清IFN-γ、TGF-β1含量較模型組有所下降(P＜0.05),血清IL-10含量有所上升(P＜0.05)。對比空白組,麥粒灸組血清IFN-γ、TGF-β1濃度水平較高(P＜0.05),IL-10血清濃度水平較低(P＜0.05)。見表5。

表5 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中免疫因子表達程度比較(10只,±s)

表5 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中免疫因子表達程度比較(10只,±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

組別 IFN-γ(pg/mL)TGF-β1(ng/mL)IL-10(pg/mL)517.99±160.62 41.44±8.60 50.02±5.15模型組 1623.92±201.47 a 86.15±8.24a 27.20±8.76a麥粒灸組 1218.95±220.10 ab 75.53±3.32ab 38.87±5.62空白組ab

2.7 麥粒灸對甲減大鼠組織因子AOD值的影響

模型組IFN-γ的AOD高于空白組(P＞0.05),但差異無統計學意義,其TGF-β1的AOD值與空白組差異比較無統計學意義(P＞0.05),IL-10的AOD值顯著低于空白組(P＜0.05)。與模型組相比,麥粒灸組IFN-γ、IL-10的AOD值顯著低于模型組(P＜0.05),TGF-β1的AOD值與模型組的差異比較無統計學意義(P＞0.05)。如表6。

表6 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺中免疫因子的AOD值變化(10只,±s)

表6 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺中免疫因子的AOD值變化(10只,±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

組別 IFN-γ IL-10 TGF-β 1 0.234±0.032 0.308±0.007 0.346±0.003模型組 0.269±0.008 0.278±0.014a 0.311±0.009麥粒灸組 0.208±0.020b 0.241±0.001ab 0.291±0.021空白組a

免疫組化結果顯示:大鼠甲狀腺組織中IL-10、IFN-γ和TGF-β1陽性顆粒體主要表現為棕黃色,存在于甲狀腺濾泡細胞的胞漿中。三種免疫因子在甲狀腺組織中表達差異性較大。空白組IL-10和TGF-β1陽性顆粒體染色深,表達多,范圍廣;而IFNγ陽性顆粒體則染色較淺,表達較少,范圍較小。模型組甲狀腺上皮細胞IFN-γ陽性顆粒體染色更深,表達更多,范圍更大;但是其IL-10、TGF-β1陽性顆粒體染色較淺,表達更少,范圍更小。麥粒灸組甲狀腺上皮細胞IFN-γ、TGF-β1及IL-10陽性顆粒體均染色更淺,表達更少,范圍更局限。如圖2～4所示。

圖2 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺組織中IFN-γ的IHC表達狀況(DAB×200)

圖3 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺組織中TGF-β1的IHC表達狀況(DAB×200)

圖4 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺組織中IL-10的IHC表達狀況(DAB×200)

3 討論

現代研究表明,麥粒灸作為直接灸穴的理療方法,對多種慢性炎癥疾病的免疫功能有著良性調節作用[12-13]。它的治療原理主要是利用艾柱燃盡時那種短暫、快速、強烈的燒灼皮膚的持續性局部炎癥反應,“以火促通”,促進機體發生良性的免疫反應[14]。甲狀腺功能減退作為一種免疫微環境紊亂的慢性病[15],麥粒灸干預甲減疾病的免疫應答的實驗研究較少。

細胞免疫因子的表達與甲狀腺功能的表達息息相關,同時參與了甲狀腺疾病的病理變化[16]。免疫因子的異常表達不僅造成了甲狀腺素的分泌和作用失常,而且也引起了生物體的免疫內環境失調[17]。本實驗結果證實,麥粒灸能夠提高血清FT3、FT4的水平(P＜0.05),降低TGAb的含量(P＜0.05),證明麥粒灸對甲狀腺有一定的保護作用,展示了艾灸調節免疫失衡的優勢。為深入研究艾灸對甲減生物體的保護作用,因而觀察麥粒灸對T細胞和B細胞因子的作用。

研究發現,甲狀腺功能減退患者TPOAb、TGAb及 細 胞 因 子IL-10、IFN-γ、TGF-β1異 常 表 達。TPOAb、TGAb經B細胞產生,介導體液免疫,主要以IgG1、IgG2及IgG4構成,通過抗體依賴性的細胞毒作用,破壞甲狀腺濾泡上皮細胞[18],損傷甲狀腺組織。IFN-γ主要由Th1細胞分泌,能夠讓CD8+T細胞對甲狀腺細胞產生免疫反應;也可以活化并增殖甲狀腺組織內的T細胞,擴大免疫反應;IFN-γ表達增多可以抑制鈉碘轉運體,降低攝碘率[19]。Treg細胞釋放的TGF-β1,能干預淋巴細胞的增殖,保證免疫內環境有序循環。IL-10是一種免疫抗炎因子,能夠抵抗T細胞激活[20],拮抗Th1促炎因子的表達。有研究就證明,亞臨床甲減病與IL-10、TGF-β1異常表達密切相關[20]。本研究結果發現,與空白組相比,模型組TPOAb、TGAb滴度升高,血清IFN-γ和TGF-β1表達增強,IL-10表達減弱,其可能借由促進T細胞和B細胞介導的免疫應答在甲減病程中發揮作用。麥粒灸干預后,TGAb滴度下降,IFN-γ和TGF-β1表達減弱,IL-10表達增強。

免疫組化結果表明,甲狀腺組織中存在輕微的免疫紊亂現象,其具體原因有待進一步研究研究。

由此表明麥粒灸可能主要通過良性調節血清中細胞和體液免疫應答發揮作用。