介質極性對柔性玉米醇溶蛋白乳化性的影響

董世榮 ，玄麗琪，郭珊珊

（1.哈爾濱學院食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150086；2.內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司，北京 101100）

玉米醇溶蛋白（zein）是玉米中主要的貯藏蛋白，因具有非致敏性、可降解性、獨特的自組裝能力和良好的生物兼容性而得到廣泛關注。玉米醇溶蛋白含有超過50%的非極性氨基酸，特殊的氨基酸組成使其無法分散在純水介質中，但可以分散在60～95%乙醇水溶液或pH11.3～12.7 的水溶液中。玉米醇溶蛋白的分子結構非常特殊。Matsushima 等提出玉米醇溶蛋白分子是一個棱鏡（13 nm×1.2 nm×3 nm）模型，該模型中含有9～10 個以反平行方式排列的螺旋段，螺旋兩端由富含谷氨酰胺的橋連接。基于上述氨基酸組成和結構特點，玉米醇溶蛋白屬于雙親性蛋白質，具有很強的自組裝能力，可以自組裝形成規則的球狀納米顆粒。反溶劑法是制備玉米醇溶蛋白納米顆粒常用的方法。利用此方法制備的納米顆粒大小較為均勻，可以廣泛用于Pickering 乳化液、運載小分子活性物質等。由于天然玉米醇溶蛋白形成的球狀納米顆粒疏水性太高、剛性太強，對環境適應能力較差，在一定程度限制了其應用。

為了提高玉米醇溶蛋白的環境適應能力，利用堿結合熱修飾可以提高玉米醇溶蛋白的分子柔性。蛋白質分子柔性反映了分子結構對外界環境改變時的適應能力。柔性與蛋白質的一級、二級和三級結構均息息相關。分子間的氫鍵、范德華力、靜電作用力、疏水作用力和共價鍵等因素也均對蛋白質的柔性有影響。相關研究發現，蛋白質分子柔性越好，其越能夠表現出更好的功能特性。相關研究也發現利用堿結合熱修飾玉米醇溶蛋白提高了分子的柔性，進而表現出較好的乳化特性。一般而言，在乙醇水溶液中乙醇濃度越大，介質極性越小。相關研究發現乙醇濃度對玉米醇溶蛋白的聚集形態和結構性質影響顯著。Dong等在60%～92%醇水介質環境下獲得了不同柔性玉米醇溶蛋白，不同柔性玉米醇溶蛋白自組裝形成的納米顆粒表現出不同的乳化活性和乳化穩定性，介質極性越高，柔性玉米醇溶蛋白的乳化活性和乳化穩定性越好。換而言之，在強極性介質環境下，柔性玉米醇溶蛋白表現出更好的乳化活性和乳化穩定性。

基于玉米醇溶蛋白的強自組裝特性，其可以自組裝形成不同聚合物廣泛應用于生物、食品、化學等領域，而大部分生物、食品等體系并不是單一介質環境，且玉米醇溶蛋白在復雜體系中狀態和性質影響著其具體應用。因此，研究玉米醇溶蛋白在復雜介質環境下的狀態和性質是非常有必要的。采用水介質環境對玉米醇溶蛋白的柔性進行改進，然后研究介質極性對柔性玉米醇溶蛋白聚集形態和乳化性的影響，本研究利用堿和熱修飾玉米醇溶蛋白，得到柔性玉米醇溶蛋白。將柔性玉米醇溶蛋白分散至不同濃度（60%、70%、80%、90%、92%，v/v）的乙醇水溶液中，利用反溶劑法制備不同聚合物，觀察不同聚合物的微觀形態和粒徑的變化，同時比較不同聚合物的乳化活性和乳化穩定的差異，最后分析不同聚合物的表面疏水性和二級結構的變化，以期通過此研究為拓寬玉米醇溶蛋白的應用范圍提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Z3625 型玉米醇溶蛋白（蛋白質含量100%）、尼羅紅和尼羅藍 Sigma Aldrich 公司；其他化學試劑均為國產分析純。

F-4500 熒光分光光度計、S-3400N 掃描電鏡日本日立公司；UV-2550 紫外可見光分光光度計日本島津公司；FSH-2A 可調高速勻漿機 常州金壇精達儀器制造有限公司；Nano-ZS 納米粒度電位儀英國Malvern Panalytical 公司；旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司；CD J-815 圓二色光譜儀 日本JASCO 公司；FDU-2110 冷凍干燥機 埃朗科技國際貿易（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 參考Dong 等制備柔性玉米醇溶蛋白的方法。將10 g 玉米醇溶蛋白分散至pH11.8的水介質中，利用0.01 mol/L NaOH 溶液精確調節pH 至11.8，用pH11.8 的水定容至1000 mL，然后再在70 ℃水浴鍋中加熱10 h，獲得柔性玉米醇溶蛋白，凍干備用。

利用反溶劑法制備不同聚合物，具體過程如下：稱取5 份2.5 g 柔性玉米醇溶蛋白分別溶解到100 mL 的60%、70%、80%、90%、92%（v/v）乙醇水溶液中，配制成濃度為2.5%（w/v）溶液。然后在室溫下將100 mL 的5 種柔性玉米醇溶蛋白溶液分別邊磁力攪拌（1000 r/min）邊滴加至5 份250 mL 的去離子水中，滴加完后繼續攪拌15 min，得到蛋白質濃度為0.71%（w/v）。然后利用旋轉蒸發儀將乙醇蒸發除去。得到不同蛋白濃度的5 份溶液均分別分成2 份，1 份以溶液形式儲備在4 ℃冰箱中，另1 份凍干備用。

1.2.2 微觀結構的測定 采用掃描電鏡觀察在不同濃度乙醇水溶液中柔性玉米醇溶蛋白形成聚合物的微觀結構。取少量凍干的5 種聚合物樣品涂抹在雙面導電膠上，然后進行噴金處理。在電壓為15 kV下觀察聚合物的形態，成像并保存照片。

1.2.3 粒徑的測定 將5 種聚合物溶液分別用去離子水稀釋成濃度為0.3%（w/v），利用Malvern 納米粒度電位分析儀測定溶液的粒徑大小和強度分布。其中水的折射率為1.33，樣品的折射率為1.53，測試溫度為室溫。

1.2.4 乳化性的測定 采用Pearce 等提出的濁度法測定5 種聚合物的乳化活性和乳化穩定性。分別取3 mL 濃度為1%（w/v）的5 種聚合物溶液置于5 mL量杯中，然后加入1 mL 大豆油。利用高速勻漿機在20000 r/min 下均質2 min，均質3 次，在均質后0 和10 min 時分別迅速從距離測量杯底部0.5 cm處取10 μL 乳狀液加入到5 mL 濃度為0.1%（w/v）的十二烷基苯磺酸鈉（SDS）溶液，在500 nm 處測定吸光值，以0.1%（w/v）的SDS 溶液空白調零。乳化活性（EAI）和乳化穩定性（ESI）計算公式如下：

式中：A-溶液在500 nm 下的吸光值；C-蛋白質濃度（g/mL）；-大豆油占乳化液的體積分數（=0.25）；A-乳化液靜止時間為10 min 時的吸光值；A-乳化液靜止時間為0 min 時的吸光值；D溶液稀釋的倍數。

1.2.5 乳液粒徑和電位的測定 將1.2.4 制備的乳化液分別用0.1%（w/v）的SDS 溶液釋成濃度為0.3%（w/v），利用Malvern 納米粒度電位分析儀測定乳化液粒徑強度分布、顆粒大小和電位高低，測試溫度為室溫。

1.2.6 表面疏水性的測定 采用8-苯氨基-1-奈磺酸（ANS）熒光探針法測定5 種聚合物的表面疏水性。用磷酸緩沖液（c=0.01 mol/L，pH7.0）分別將5 種聚合物溶液稀釋成5 個濃度梯度（0.03%、0.015%、0.0075%、0.00375%、0.001875%（w/v））。分別取6 mL 稀釋后的不同濃度溶液，加入20 μL 的ANS熒光探針（8 mmol/L），然后充分混勻，反應15 min（室溫條件），加入探針、混勻和反應的操作均需避光。熒光強度測定參數如下：激發波長390 nm，發射波長470 nm，狹縫均為5 nm。以熒光強度值為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標作圖，以線性關系良好的回歸曲線的斜率作為評定表面疏水性的指標。每個樣品重復3 次。

1.2.7 二級結構的測定 用去離子水分別將5 種聚合物溶液濃度稀釋成0.01%（w/v），分別取100 μL 樣品置于直徑為0.2 cm 的石英比色皿中，然后對樣品進行掃描。參數設置如下：掃描范圍190～260 nm，掃描速率100 nm/min。用去離子水作為基線。根據Yang 等提出計算-螺旋百分含量的方法，公式如下：

式中：[]-波長為222 nm 特征峰的CD 橢圓度值；Y-波長222 nm 處掃描的能量變化值。

1.3 數據處理

本研究中的數據均以平均值±標準差表示（n=3）。試驗數據采用origin9.0 和Statisix8.1 軟件對試驗數據進行統計分析（＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 微觀形態的分析

在水介質環境下，利用堿結合熱修飾玉米醇溶蛋白，獲得柔性玉米醇溶蛋白。將柔性玉米醇溶蛋白分別分散至60%、70%、80%、90%和92%（v/v）乙醇水溶液中，借助于反溶劑法誘導玉米醇溶蛋白自組裝形成聚合物，聚合物的形態見圖1。乙醇濃度對柔性玉米醇溶蛋白自組聚合物形態有顯著的影響。當分散至60%和70%乙醇水溶液中時，柔性玉米醇溶蛋白形成了膠束狀的聚合物（圖1a 和圖1b），膠束狀聚合物可能有更多的親水端分布在聚合物表面，進而很好的分散于水介質中。當分散至80%乙醇濃度時，柔性玉米醇溶蛋白形成顆粒狀的聚集形態（圖1c），但形成的顆粒聚合物被一層薄膜狀聚合物包裹。當乙醇濃度增加至90%和92%時，柔性玉米醇溶蛋白形成無規則的但排布均勻的聚合物（圖1d 和圖1e）。Yu 等也發現乙醇濃度對玉米醇溶蛋白自組裝聚合物的形態有很大的影響，且乙醇濃度越高，蛋白質聚集趨勢越高。乙醇濃度高，介質的疏水性強，增加了蛋白質之間的聚集能力。

圖1 介質極性對柔性玉米醇溶蛋白聚集形態的影響Fig.1 Effect of solvent polarity on the aggregation morphology of the flexible zein

2.2 粒徑的分析

利用粒度儀測定了柔性玉米醇溶蛋白形成的不同聚合物的粒徑強度分布和顆粒大小，結果見圖2和表1。從粒徑強度分布的結果可以看出，不同聚合物的粒徑強度分布并沒有形成典型的單峰分布，而且乙醇濃度對柔性玉米醇溶蛋白聚合物的顆粒大小影響顯著（＜0.05）。在60%乙醇介質中，柔性玉米醇溶蛋白形成的聚合物的顆粒大小為134.55 nm；在70%乙醇介質中，聚合物的粒徑為161.75 nm；在80%乙醇介質中，聚合物的粒徑為177.10 nm；在90%乙醇介質中，聚合物的粒徑增加至189.14 nm，在92%乙醇介質中，聚合物的粒徑進一步增加至293.90 nm。Kim 等研究發現，乙醇濃度的增加，尤其是增加至92%時，玉米醇溶蛋白的結構發生了逆轉，由親水端朝向介質環境轉變為疏水端朝向介質環境。隨著乙醇濃度的增加，玉米醇溶蛋白疏水基團得到更充分的暴露，疏水作用力起主導作用，進而誘導蛋白質分子間形成更大的顆粒。賴嬋娟等也發現隨著乙醇濃度的增加，玉米醇溶蛋白形成的顆粒越大。結果表明，隨著介質極性的降低，聚合物的顆粒呈現增加的趨勢。這些結果也反映了柔性玉米醇溶蛋白可以隨著介質極性的變化而形成顆粒大小不同的聚合物。

圖2 介質極性對柔性玉米醇溶蛋白聚合物粒徑強度分布的影響Fig.2 Effect of solvent polarity on the intensity distribution and particle size of the flexible zein aggregations

表1 介質極性對柔性玉米醇溶蛋白聚合物粒徑的影響Table 1 Effect of solvent polarity on the particle size of the flexible zein aggregations

2.3 乳化活性和乳化穩定性的變化

乳化性反映指標包括乳化活性和乳化穩定性。柔性玉米醇溶蛋白在不同濃度乙醇介質中形成了不同聚合物，這些聚合物制備的乳化液的乳化活性和乳化穩定性存在很大差異（表2）。隨著介質極性的降低（乙醇濃度從60%增加至92%），乳化活性呈現下降的趨勢，從3.12 m/g 降低至2.24 m/g；但是乳化穩定性呈現增加的趨勢，從67.97%增加至86.47%。

表2 介質極性對柔性玉米醇溶蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響Table 2 Effect of solvent polarity on the emulsifying activity and emulsifying stability of flexible zein

乳化液的粒度分布在一定程度上可反映乳化液的穩定性。不同聚合物制備的乳化液放置24 h后，利用粒度儀測定乳化液液滴的粒徑體積分布和顆粒大小（圖3 和表3）。在越高濃度的乙醇介質中形成的聚合物的乳化液的液滴越小，顆粒越小說明乳化液的穩定越好。不同聚合物形成的乳化液均形成兩個峰的粒徑體積分布特征，且顆粒大小存在明顯差異（＜0.05）。當乙醇濃度從60%增加至92%時，不同聚合物形成的乳化液的粒徑從355.60 nm 降低至251 nm，多分散系數（PDI）均較小，在0.18～0.25 之間，說明測定粒徑的數據可靠性強。劉昊等發現，酸修飾玉米醇溶蛋白的結構發生變化，進而改變了玉米醇溶蛋白與其他物質的相互作用。乳化性的改變可能源于在不同介質中酸修飾玉米醇溶蛋白，改變了其結構，進而改變了蛋白質的乳化能力。堿修飾玉米醇溶蛋白提高了其分子柔性，對環境具有更強的適應能力。當介質環境由乙醇水介質到油水介質時，柔性玉米醇溶蛋白結構順應環境改變而聚集形成不同顆粒大小的聚合物。

圖3 柔性玉米醇溶蛋白聚合物乳化液的粒徑強度分布Fig.3 Intensity distribution and particle size of the emulsion stabilized by the aggregations formed from the flexible zein in different polarity solvents

表3 柔性玉米醇溶蛋白聚合物乳化液粒徑大小Table 3 Particle size of the emulsion stabilized by the aggregations formed from the flexible zein in different polarity solvents

2.4 不同聚合物乳化液電位的變化

圖4的結果顯示不同聚合物形成乳化液液滴表面電荷的大小。隨著乙醇濃度的增加，乳化液液滴表面的電荷呈現增加的物質，但是差異并不顯著（0.05）。從乙醇濃度為60%時的-40 mV 變化至乙醇濃度為92%時的-42.85 mV。乳化液液滴的電荷越高，其穩定性越好。這些結果說明乳化液穩定性好也歸因于乳化液表面電荷的增大。柔性玉米醇溶蛋白對環境有較強的適應能力。隨著介質極性的降低（乙醇濃度的增加），柔性玉米醇溶蛋白暴露在表面的帶電氨基酸不同，進而賦予乳化液不同的電荷量。

圖4 柔性玉米醇溶蛋白聚合物乳化液的電位變化Fig.4 Changes of Zeta potential of the emulsion stabilized by the aggregations formed from the flexible zein in different polarity solvents

2.5 表面疏水性的變化

表面疏水性是影響乳化液穩定的一個重要因素。圖5 顯示了不同聚合物的表面疏水性。隨著乙醇濃度的增加，形成的聚合物的表面疏水性的呈現增加的趨勢（＜0.05）。隨著介質極性的降低（60%增加至92%），柔性玉米醇溶蛋白聚合物的表面疏水性從2448.55 增加至3658.25。表面疏水性的變化可以一定程度反映聚合物表面疏水氨基酸的暴露程度。蛋白質內部疏水基團的暴露對乳化能力的提升起到積極的作用。柔性蛋白質的結構可隨環境的變化而發生改變。隨著介質極性的降低（乙醇濃度的增加），柔性玉米醇溶蛋白暴露在表面的疏水氨基酸增加，從而表現出較高的表面疏水性，進而賦予較好的乳化穩定性。

圖5 柔性玉米醇溶蛋白聚合物表面疏水性的變化Fig.5 Changes of surface hydrophobicity of the aggregations formed from the flexible zein in different polarity solvents

2.6 二級結構的變化

圖6和表4 分別顯示了柔性玉米醇溶蛋白在不同極性介質中圓二色光譜和-螺旋含量的變化。從圖6 結果可以得出，柔性玉米醇溶蛋白中-螺旋含量隨著乙醇濃度的增加而增加。天然玉米醇溶蛋白的-螺旋含量為50%～60%左右，堿和熱修飾會很大程度破壞玉米醇溶蛋白分子中-螺旋。當柔性玉米醇溶蛋白重新分散至不同濃度的乙醇介質后，其-螺旋一定程度得到恢復。當分散至60%乙醇后，其-螺旋含量為8.50%，當進一步增加乙醇濃度至70%時，-螺旋含量為8.68%，當進一步增加乙醇濃度至80%、90%和92%時，-螺旋含量分別增加至9.92%、11.68%和14.62%。這些結果說明柔性玉米醇溶蛋白對環境適應能力較好，二級結構可以隨著介質極性的變化而變化。二級結構影響著蛋白質的功能性質。在低極性介質（高乙醇濃度）環境下，柔性玉米醇溶蛋白可以獲得較高的-螺旋含量，進而表現出良好的乳化穩定性。

圖6 不同極性介質中柔性玉米醇溶蛋白圓二色光譜Fig.6 Typical stacked Far-UV CD spectra of the flexible zein in different polarity solvents

表4 不同介質中柔性玉米醇溶蛋白的α-螺旋的含量Table 4 α-Helix content of the flexible zein in different polarity solvents

3 結論

通過調節乙醇濃度獲得不同極性介質環境。介質極性影響了柔性玉米醇溶蛋白的聚集形態，聚合物顆粒隨著介質極性的增加而降低。在高極性介質環境下柔性玉米醇溶蛋白形成的聚合物的乳化活性更高，但是乳化穩定性更低。當乙醇濃度從60%增加至92%時，乳化穩定性從67.97%增加至86.47%，液滴大小從355.60 nm 降至251.00 nm，-螺旋含量從8.50%增加到14.62%。柔性玉米醇溶蛋白在高乙醇濃度下形成的聚合物具有較高的乳化穩定性，這可能是因為柔性玉米醇溶蛋白對介質環境具有較強的適應能力。在低極性（高乙醇濃度）介質環境下，柔性玉米醇溶蛋白獲得更高的表面疏水性和較高的-螺旋含量。