奶牛源鼠李糖乳桿菌的12C6+重離子束誘變選育

蔣 威，沈文祥,2，鄭娟善,2，武小虎，楊雅媛，呂亞楠，王勝義，嚴作廷,

（1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050；2.西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌 712100）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠以碳水化合物為底物，發酵產生具有抑菌活性的有機酸、HO及細菌素等次級代謝物的細菌的統稱，此外還能夠產生功能性的胞外多糖，其在食品及醫藥中具有多種益生功能，菌體通常無芽孢，屬于革蘭氏陽性細菌，廣泛存在于健康動物的口腔、胃腸道及生殖道。乳酸菌種類繁多，作用廣泛，它們以其潛在的健康和營養益生作用而得名，因此被認為是“具有益生性能的微生物”或“當攝入足夠量的活的乳酸菌株，可對宿主健康產生益處”。鼠李糖乳桿菌是乳酸菌中益生性菌株的最重要來源之一，隨著人們物質生活水平的提高，人們對其需求也與日俱增，不管是食品發酵，還是以乳酸菌為主要菌種的益生菌制劑都對其生長、產酸及抑菌活性提出了新的要求；此外，利用乳酸菌活菌制劑或其代謝產物來對人類及動物疾病進行預防和治療，已切實可行。但從動物或自然界分離的乳酸菌株存在代謝物產量低或不穩定的問題。所以，探索提高應用乳酸菌性能的新策略是當前重點研究的方向，而誘變選育無疑是當前的最佳選擇之一。

誘變選育是借助各種誘變源或誘變劑的理化因素來處理細胞，加速基因突變，再建立適當的篩選方法以獲得所需的高產優良株的現代育種方式之一。誘變選育的理論是基于基因突變。經過多年的實踐，誘變選育技術已有了長足的發展，出現了傳統輻射誘變（X 射線、射線、紫外線和激光等）、化學誘變（甲基磺酸乙酯、氮芥、亞硝酸和亞硝基胍等）、紫外線-亞硝基弧復合誘變、常壓室溫等離子體誘變及太空誘變等。重離子束誘變具有能量沉積、動量傳遞和遺傳物質的質子轉移和重排、損傷后修復效應小及不易回復突變等突出特點。重離子的能量通常較高，一般每核子在GeV 量級甚至更高，地面上通過加速器獲得的重離子，能量可從keV 量級到GeV 量級。相較于常規X、及紫外線等, 重離子束在穿過生物介質時，將大量能量沉積在其移動的徑跡上，造成細胞核中DNA 分子的顯著損傷，故而表現出更高的誘變效率，所以通過重離子束輻照來改變微生物的生產性能，提高微生物的產出，是一種切實有效的菌種育種方法。

目前利用C重離子束輻照誘變技術在阿維鏈霉菌、嗜熱乳桿菌、谷氨酸棒狀桿菌的菌種改良中已經取得了很好的效果，但尚未見重離子束誘變鼠李糖乳桿菌的研究，故本研究利用C重離子束對奶牛源鼠李糖乳桿菌臨床分離株進行誘變選育，以期獲得體外益生性更強的鼠李糖乳桿菌菌株，為乳酸菌防治奶牛生殖道疾病的基礎研究提供標的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原始野生菌株鼠李糖乳桿菌臨床分離株JF12-1中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所奶牛創新團隊保存；大腸桿菌為ATCC29922 廣東環凱微生物科技；MRS 肉湯培養基及固體改良培養基 購自廣東環凱微生物科技；碳酸鈣AR 國藥集團化學試劑有限公司；溴甲酚紫99% 天津市永大化學試劑有限公司；葡糖糖AR 天津市大茂化學試劑廠；細菌DNA 提取試劑盒（Bacterial DNA Kit D3350）Omega Bio-Tek 公司；16S rDNA 通用引物 西安擎科生物；1.5%瓊脂糖凝膠粉 北京索萊寶生物。

C重離子束 中科院蘭州物理研究所提供；LAI-3-T 厭氧培養箱 廣州瑞豐實驗設備有限公司；WP-UP 超純水機 賽默飛有限公司；細菌濁度儀北京天安聯合科技有限公司；UV-BlueStarPlus 紫外-可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司；PHSJ-F 型pH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司；SBA-40D 生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所； LDZX-30KB 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；1108-150 型游標卡尺 中巽云科技有限公司；BSA224S 型十萬分之一分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DYCP-31DN 瓊脂糖核酸電泳儀 北京六一有限公司；Biometra TOne 96G PCR 儀 德國耶拿公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的制備 種子及斜面培養基：準確稱取MRS 固體改良培養基成品54 g，溶解于1 L 蒸餾水中，用鹽酸調節pH 至7.0±0.3，121 ℃，高壓滅菌15 min；發酵培養基：稱取MRS 成品固體改良培養基54 g，加入10%葡萄糖，滅菌方法同上；溴甲酚紫-碳酸鈣固體篩選培養基（簡稱SMBVC）：MRS 固體改良培養基成品中加入0.01%溴甲酚紫和0.25%的碳酸鈣，滅菌方法同上。

1.2.2 原始野生菌株JF12-1 特性測定

1.2.2.1 生長曲線繪制 將斜面保存的原始野生菌株JF12-1 用接種環刮下，接種于種子培養基，于37 ℃恒溫厭氧培養24 h 以復壯，4 ℃，4000×g 離心15 min，以獲得菌體，PBS 洗滌2 次，利用細菌濁度儀重懸調整濃度至1.0×10CFU/mL，獲得復壯后初始種子菌懸液。取菌懸液按1%（V/V）的接種量接種于MRS培養基，37 ℃、300 r/min 厭氧振蕩培養24 h，每隔2 h 取樣，測定菌液的OD，參照DIANA 等報道，以時間為橫坐標，對應OD 值為縱坐標，繪制原始野生菌株的生長曲線。

1.2.2.2 生物傳感儀測定乳酸含量 SBA-40D 型生物傳感儀利用專一性和高效性的固定化酶為分子識別的原件，具有兩支生物性的探測電極，并由微電腦控制，可自動進樣檢測發酵樣品中乳酸含量。將1.2.2.1 復壯后初始種子菌懸液按10%的比例接種于發酵培養基（250 mL 錐形瓶裝入100 mL 發酵培養基），于37 ℃、300 r/min 振蕩厭氧發酵24 h，每隔2 h 取樣發酵上清，參照張金露等報道，利用生物傳感儀測定各發酵時間點樣品的乳酸含量（g/L），以時間值為橫坐標，產乳酸量為縱坐標，繪制原始野生菌株的產乳酸曲線。

1.2.2.3 酸斑值測定 取1.2.2.1 復壯后初始種子菌懸液，連續稀釋10倍之后取100 μL，利用涂布棒均勻涂布于溴甲酚紫-碳酸鈣固體篩選培養基（SMBVC），于37 ℃厭氧培養24 h，由于乳酸菌的產酸特性會在菌落周圍產生融鈣圈，測定融鈣圈和菌落直徑，按（1）式計算酸斑值（HC）。

式中，HC 為酸斑值，D為菌落周圍產生的融鈣圈直徑（cm），而D為菌落自身直徑（cm）。

1.2.3 鼠李糖乳桿菌的C重離子束輻照 取1.2.2.1 復壯后初始種子菌懸液2 mL 置輻照皿中，設置重離子束C的輻射參數，利用重離子束C，在吸收劑量率為40 Gy/min 的條件下，分別于0、40、80、120、160、200、300、400 Gy 的輻照劑量下對原始野生菌株懸浮液分別進行輻照處理，每個輻照劑量下設置3 個平行。

1.2.4 誘變菌株HC 值與產乳酸關系的建立 參照王雨辰報道的方法，將重離子束輻照誘變后的各輻照梯度菌懸液，分別稀釋至10倍之后各取100 μL，均勻涂布于溴甲酚紫-碳酸鈣固體篩選培養基（SMBVC），置于37 ℃厭氧培養箱培養24 h，統計各梯度存活菌落數，計算各菌落的HC 值；同時將HC 值不同菌落分別接種于發酵培養基，37 ℃發酵培養18 h，同1.2.2.2 所述方法測定各突變菌株的產乳酸量，得到突變菌株HC 值與其產乳酸量之間的關系，建立利用突變菌株HC 值進行初篩的方法。

1.2.5C重離子束誘變致死率及突變率測定 重離子束輻照結束后，將輻照后的菌懸液進行連續稀釋后，吸取0.1 mL 均勻涂布于MRS 固體培養基上（3 個重復），于37 ℃恒溫厭氧培養24 h，通過平板菌落計數統計存活菌落數并確定致死率，繪制圖得到致死率隨輻照劑量變化曲線。同上將突變后的菌懸液均勻涂布于SMBVC 上，形成的單菌落在SMBVC上可以形成透明的溶鈣圈，統計溶鈣圈直徑及菌落直徑，計算HC 值，按式（2）計算致死率，按式（3）和式（4）計算正負突變率，繪制致死率和正、負突變率曲線。最后根據致死率及突變率確定最佳輻照誘變劑量。

式中，N是輻照后生長的菌落數，N是輻照對照組（0 Gy）生長菌落數。N是HC 值比原始野生菌株提高20%及以上菌落數，N是HC 值比原始野生菌株降低20%及以上菌落數，N是該輻照劑量下的菌落總數。

1.2.6 突變菌株的酸斑法初篩 將最佳輻照劑量下的各突變菌株接種于SMBVC 上，計算各突變菌株的HC 值，篩選出HC 值較原始野生菌株提高25%以上的突變菌株作為初篩后突變菌株。

1.2.7 突變菌株的抑菌圈法復篩 將初篩后的突變菌株在接種于發酵培養基，于37 ℃恒溫厭氧培養24 h，以大腸桿菌為致病指示菌，對其體外抑菌活性進行測定，篩選出抑菌圈直徑較原始野生菌株提高15%以上的菌株，作為復篩后突變菌株。

1.2.8 突變菌株遺傳穩定性測定 將復篩后突變菌株于發酵培養基中連續傳代9 次，每隔2 代利用1.2.2.2 所述方法測定其產乳酸量，依據其產乳酸變化檢測突變菌株遺傳穩定性。

1.2.9 穩定突變株16S rDNA 鑒定 按細菌DNA提取試劑盒操作說明提取原始野生菌株和穩定突變菌株基因組DNA，利用PCR 儀特異性擴增各菌株的16S rDNA 片段，引物序列：27F 5′-GAGCGGATAA CAATTTCACACAGG-3′，1492R 5′-CGCCAGGGTTT TCCCAGTCACGAC-3′，50 μL 的反應體系，PCR 反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min，30 個循環，72 ℃延伸5 min。PCR 產物經電泳檢測后進行測序，測序結果經過Seq-man軟件拼接后與NCBI 核酸數據庫比對，MEGA-X 構建系統發育樹。

1.3 數據處理

所有實驗均進行三次獨立重復實驗，試驗結果數據除HC 增加值用百分比表示外，其余結果均采用平均值±標準差的形式表示；利用Excel 2019 和SPSS 25.0 統計軟件進行數據處理。本試驗組間比較選用單因素ANOVA 檢驗。若假定等方差則用LSD 檢驗，若不假定等方差則用鄧尼特T檢驗，＜0.05，則差異顯著，具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 原始野生菌株的生長特性

對原始野生菌株生長情況進行研究，為后期誘變菌株的選育提供依據。鼠李糖乳桿菌JF12-1 菌體隨時間生長規律如圖1-a，可知0～4 h 階段，菌體生長緩慢，與培養環境的適應有關；4～12 h，呈指數級增長，為對數生長期，此階段乳酸菌株代謝最旺盛、活力最好，適合菌株性狀研究；12～20 h 階段為穩定期，其階段菌株代謝穩定，適合菌株代謝物研究；20 h 之后開始逐漸步入衰亡期，菌體死亡數開始增多。此乳酸菌株的生長曲線與徐穎等研究中報道的鼠李糖乳桿菌Lr-1 和Lr-2 相同，均于12 h 達對數末期；而與羅素賢等關于鼠李糖乳桿菌JX-1 的生長曲線研究結果不同，該菌株于10 h 末便開始進入穩定期，這可能與菌株來源及特異性有關。

發酵生長過程中乳酸產量變化如圖1-b，可知，此鼠李糖乳桿菌菌株在2 h 內，代謝緩慢，產乳酸變化不明顯，2～10 h 產乳酸量急劇升高，10～16 h 產乳酸量較前一階段有所放緩，但仍然在升高，16～24 h 產乳酸量基本保持恒定，產乳酸量最高峰值為7.12 g/L。

圖1 原始野生菌株鼠李糖乳桿菌JF12-1 生長曲線（a）和產乳酸曲線（b）Fig.1 Growth curve (a) and lactic acid production curve (b) of primitive wild strain Lactobacillus rhamnosus JF12-1

乳酸菌在特定的篩選培養基上，菌落會在代謝產生的有機酸作用下于其周圍產生黃色的融鈣圈，其HC 值已作為與突變株比較的優良株篩選標準之一。本實驗中鼠李糖乳桿菌JF12-1 在溴甲酚紫-碳酸鈣篩選培養基中產生了明顯的融鈣圈，如圖2。對篩選培養基上同一菌株的5 個不同菌落的HC 值進行統計，作為原始野生菌株的HC 值，作為后續突變株篩選的依據，結果如表1，結果顯示原始野生菌株鼠李糖乳桿菌JF12-1 平均HC 值為3.23。

圖2 原始野生菌株鼠李糖乳桿菌JF12-1 融鈣圈效果圖Fig.2 Effect diagram of the original wild strain Lactobacillus rhamnosus JF12-1 melting calcium ring

表1 原始野生菌株鼠李糖乳桿菌JF12-1 的菌落HC 值Table 1 HC values of the original wild strain Lactobacillus rhamnosus JF12-1

2.2 誘變后菌株HC 值與其產乳酸關系

將輻照誘變后的所有突變菌株分別接種到溴甲酚紫-碳酸鈣固體篩選培養基（SMBVC），測定融鈣圈，計算菌株HC 值和其對應產乳酸量，結果發現輻照誘變之后的菌株HC 值與其產乳酸量之間存在顯著的正相關性，以300 Gy 輻照梯度下的誘變后10 株菌株的HC-產乳酸關系為例（如圖3），由此可見誘變后菌株HC-產乳酸關系能夠作為高產乳酸突變菌株的篩選方法。

圖3 突變菌株HC 值與其產乳酸量之間的相關性Fig.3 Correlation between HC value and lactic acid production of mutant strains

2.3 誘變的最佳輻照劑量

建立致死率曲線和正負突變率曲線，確定最佳誘變吸收劑量。致死率反映了菌落的存活情況，C重離子束誘變鼠李糖乳桿菌JF12-1 后，各輻照劑量下的致死率變化如圖4-a。致死率隨輻照劑量的增大呈現出先升高后下降，之后又急劇升高的變化規律。當輻照劑量為0～80 Gy 時，致死率隨輻照劑量的增加而急劇上升；80～120 Gy 時，致死率隨輻照劑量的增加而出現降低；120～400 Gy 時，致死率隨輻照劑量的增加而再度急劇升高；菌落半致死輻照劑量約為160 Gy，300 Gy 時致死率79.86%，400 Gy 時致死率接近95.39%。本研究中致死率變化呈馬鞍形，與王雨辰等關于植物乳酸菌JTL 在經過不同輻照劑量的C重離子束輻照后的研究結果相一致，其致死率雖然隨著輻照吸收劑量的增大而增大，但關系并非呈線性而呈馬鞍形。但與都雯玥在重離子輻照選育截短側耳素高產菌株研究中報道的致死率曲線呈線性的報道相反，這可能與菌株特異性有關。起初在低輻照劑量下，重離子束產生自由基對細胞生物膜和DNA、蛋白質等生物大分子直接造成損傷，使輻照菌株致死率急劇增大；隨著重離子累積注入量的增加，細胞表面損傷嚴重，能量沉積及動量傳遞繼續對菌株產生損傷，使其致死率仍呈上升趨勢，這種作用的持續會短暫激活細胞的某種損傷修復機制，使得致死率出現短暫下降；但當輻照累積量增加到一定值時，多種物理效應產生的漸變性損傷累積，勢必會對菌株造成不可逆的物化損傷。

圖4 致死率（a）、正負突變率（b）隨輻照劑量變化曲線Fig.4 Fatality rate （a）, positive and negative mutation rate （b）curve with radiation dose

正、負突變率反映了誘變過程中正、負突變菌株數占全部被誘變菌株數的比率，隨輻照劑量的變化而變化，C重離子束各輻照劑量下的正、負突變率變化如圖4-b。一定輻照劑量范圍內，雖然提高輻照劑量能提高致死率，亦可提高正突變率，但負突變率也會相應增加，為此在最大限度的提高致死率（提高正向突變率）情況下，還要保證負突變率不會明顯的增大，才能誘變成功（即找到一個最佳輻照劑量），而多數研究所報道的當致死率處于80%時，會得到一個理想的輻照結果。蔡聰等在產左旋乳酸的乳酸菌誘變研究中，發現當被誘變菌株的致死率在70%～80%范圍內，誘變后菌株才會出現較多的正向突變株，對應的誘變劑量才是最佳劑量。楊佩斯對菌株進行ARTP 誘變，發現當在約80%致死率時，菌株誘變較理想，若致死率更高，正突變率雖然可能也有所增加，但在此情況下，負突變率都會較高，不宜優良突變菌株的篩選。本研究中輻照吸收劑量為300 Gy時，致死率較高接近80%；而400 Gy 時致死率雖然更高，但負突變率相較于300 Gy 時有了明顯的升高，達到了11.49%，不利于理想突變株的篩選，故選擇300 Gy 為最佳輻照劑量較為合適。

2.4 突變乳酸菌菌株的初篩

對最佳輻照誘變劑量300 Gy 下的正向突變菌株采用1.2.6 所述的方法進行篩選，以原始野生菌株JF12-1 的平均HC 值3.26 作為初篩對照，篩選出20株HC 值相較于原始野生菌株HC 值增加25%以上的突變菌株，篩選結果見表2，其中突變株JF11和JF16的HC 值增加最高，分別較原始野生菌株增加了49.69%和49.97%，但多數突變后菌株的HC 值增加百分比介于30%～50%之間。突變后菌株融鈣圈如圖5，較原始野生菌株有明顯變大，說明誘變后菌株產有機酸量有明顯提升。

圖5 初篩突變菌株融鈣圈Fig.5 Preliminary screening of calcium melting circle of mutant strain

表2 最佳誘變劑量下的正向突變株Table 2 Positive mutants at optimum mutagenic dose

2.5 突變乳酸菌菌株的復篩

對初篩后的突變菌株參照1.2.7 所述方法進行大腸桿菌體外抑菌實驗，以原始野生菌株JF12-1 對大腸桿菌平均抑菌圈直徑19.95 mm 為參照，發現20 株初篩菌株中，只有8 株菌株的抑菌圈直徑較原始野生菌株JF12-1 差異地提高（＜0.05），分別為JF3、 JF4、 JF5、 JF9、 JF10、 JF11、 JF14及JF16，其抑菌圈直徑分別為23.89、23.94、24.54、23.67、24.34、24.60、25.25 及24.33 mm，較原始野生菌株JF12-1 提高了18.65%～26.57%，結果見圖6。最后確定這8 株突變菌株為復篩后突變菌株。

圖6 原始野生菌株及復篩突變菌株抑菌性Fig.6 Bacteriostasis of original wild strain and double screening mutant strain

2.6 突變菌株的遺傳穩定性

對篩選出的8 株產酸及抑菌性良好的突變菌株連續傳代，隔代接種發酵對其產乳酸量進行測定，結果見表3。發菌株JF12-1 及各正向突變菌株隔代乳酸含量相比于第1 代變化不顯著（＞0.05），說明遺傳穩定性良好。以原始野生菌株12-1 的平均產乳酸量7.92 g/L 為對照，發現各正向突變株的產乳酸量較原始野生菌株有明顯提升，其中突變菌株JF16的平均產乳酸量為12.57 g/L，較原始野生菌株提高了58.74%。突變后菌株的產乳酸量及抑菌性除取決于相關基因所控制的代謝產物的表達量外，在很大程度上與菌株的培養條件密不可分。因此后續還需要研究培養基的營養配比來篩選最佳發酵條件，以使突變后的基因得以充分的表達，以進一步研究突變后菌株優良特性的表達。

表3 突變株傳代產乳酸量的穩定性（g/L）Table 3 Stability of lactate production in subculture of mutant strains(g/L)

2.7 突變菌株的16S rDNA 測序結果

通過瓊脂糖凝膠電泳拍照，原始野生菌株和穩定突變菌株的16S rDNA 序列擴增成功，如圖7 所示，分子量均為1500 bp，與原始野生型菌株JF12-1 的分子量相同。測序比對結果與同源相似序列構建的系統發育樹如圖8，很好地顯示了誘變前后各菌株與鼠李糖乳桿菌的親緣關系。本研究誘變選育后菌株的16S rRNA 基因片段未發現堿基突變，這與WANG 等對植物乳桿菌太空誘變菌株的序列研究相似，說明乳酸菌株16s rRNA 基因片段普遍具有保守性，這與其物種的親緣關系有關。而促使其產酸、抑菌功能增強的突變位點可能存在于其他基因區段，這需要進一步對誘變選育后菌株的全基因組序列進行研究才能確定。

圖7 原始野生菌株及復篩突變菌株的16S rDNA 電泳圖Fig.7 16S rDNA electrophoresis of the original wild strain and the double-screened mutant strain

圖8 原始野生菌株JF12-1 及誘變后菌株的發育進化樹Fig.8 The phylogenetic tree of primitive wild strain JF12-1 and the mutated strain

3 結論

本研究成功利用C重離子束對奶牛源鼠李糖乳桿菌JF12-1 進行了輻照誘變及選育。誘變確定300 Gy 為最佳輻照劑量，該劑量下致死率為79.86%，正突變率為30.33%，負突變率為5.38%，正向突變株最多；對最佳輻照劑量下的突變菌株初篩，得到20 株HC 值較原始野生菌株提高25%突變株，復篩得到JF3、JF4、JF5、JF9、JF10、JF11、JF14及JF16為體外對大腸桿菌抑菌性較原始野生菌株提高18.65%～26.57%的菌株；連續傳代后接種發酵，發現這8 株突變乳酸菌株產乳酸較原始野生菌株提高了43.92%～58.74%且具有良好的遺傳穩定性。說明C重離子束在優良穩定鼠李糖乳桿菌菌株選育中的使用是切實可行的。