基于傳統培養和高通量測序分析德州扒雞優勢腐敗菌及相關抑菌劑價效評定

叢筠格，梁 杉，張 敏,

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京工商大學，北京 100048；2.北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

德州扒雞作為我國傳統醬鹵肉制品，因風味獨特受到消費者的喜愛。但醬鹵肉制品在生產、加工和儲運過程中，極可能被操作人員、加工設備和原料本身等所攜帶的細菌污染，在合適的環境條件下易腐敗變質。目前德州扒雞主要通過包裝前高溫滅菌處理或直接氣調包裝來延長貨架期，但高溫滅菌會影響產品口感和品質。氣調包裝是采用良好阻隔性包裝材料并將食品周圍氣體進行更換或剔除的一種保藏方式，氣調包裝未經高溫滅菌的德州扒雞銷售半徑小，銷售量易受到季節限制，已成為限制德州扒雞產業發展的瓶頸。

研究德州扒雞腐敗菌相組成，有助于解決德州扒雞乃至整個醬鹵肉制品的貨架期問題。隨著科技的發展，食品中腐敗微生物的研究方法逐漸增多，高通量測序作為新一代測序技術，具有信息量大、效率高的優點，能夠更加準確、全面反映樣本的微生物群落結構，但也存在難以確定具體菌種且無法區分細菌死活的缺點。傳統培養技術可培養的條件有限，分析結果不能完全反映樣品中微生物群落情況，但分離出的菌體純度較高，可以驗證高通量測序結果的準確性，因此在微生物研究中仍占有重要地位。將兩種技術同時應用于菌相的研究，提高了檢驗通量和準確性。曹榮等將傳統培養和高通量測序技術相結合研究牡蠣菌群結構，發現兩種方法得到的結果一致。但目前將這兩種方法同時應用在醬鹵肉制品上的研究較少，且國內對于氣調包裝醬鹵肉制品的研究處于初級階段，對其致腐微生物菌群結構分析較少。

添加抑菌劑是抑制食品中腐敗菌生長的常用方法。近年來，天然抑菌劑對醬鹵肉制品中腐敗菌的抑制作用研究逐漸增多，乳酸鏈球菌素（Nisin）用作為抑菌劑不會對食品的感觀產生不良影響，因此在肉制品加工中有著廣泛的應用。-聚賴氨酸（-poly-Llysine，-PL）復配抑菌劑用于肉制品的防腐保鮮，有提升保質期和口感的雙重優勢。茶多酚（tea polyphenols，TP）和溶菌酶（lysozyme，LZ）作為安全性較高的抑菌劑，在抑制肉制品細菌生長、維持肉制品品質等方面具有顯著效果。李德紅對氣調包裝醬鴨食管分離出的優勢腐敗菌進行抑菌研究，結果表明抑菌劑的最佳配方為-PL 0.05 g/kg、Nisin 0.2 g/kg、TP 0.12 g/kg；徐靜等研究表明0.05% LZ、0.1%雙乙酸鈉、0.05% Nisin、3%乳酸鈉的復合保鮮劑對紅燒牛肉中微生物可以起到有效抑制作用。但由于貯藏條件及產品本身特性等原因，導致不同產品腐敗的腐敗菌也具有差異，目前針對低溫貯藏條件下充氮包裝德州扒雞特定腐敗菌的抑菌研究鮮有報道。

本研究將充氮包裝的雞肉在低溫（4 ℃）條件下貯藏，通過高通量測序技術研究低溫貯藏條件下菌群結構變化，并通過傳統純培養技術對腐敗末期優勢菌進行鑒定。結合文獻報道有針對性地選擇-PL、Nisin、TP、LZ 等天然抑菌劑，以單一抑菌效果為指標篩選出兩種抑菌效果較好的抑菌劑，評價它們對各腐敗菌的MIC，旨在為延長德州扒雞的貨架期和控制產品質量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

德州扒雞 山東德州扒雞股份有限公司；PCA培養基、LB 營養肉湯培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司；PBS 緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；-PL、Nisin 純度99%，浙江新銀象生物工程有限公司；TP 純度98%，安徽紅星藥業股份有限公司；LZ 活性2000 U/mg，南寧龐博生物工程有限公司。

BC/BD-232HD 電冰柜 青島海爾特種電冰柜有限公司；GR85DF 高壓蒸汽滅菌鍋 美國致微公司；BCL-1360 超凈工作臺 北京亞泰科隆儀器技術有限公司；THZ-82A 水浴恒溫搖床 上海江星儀器有限公司；DHP-9162 恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；OLYMPUS BX53 生物顯微鏡 北京東方奧舟科技發展有限公司；F200 PRO 酶標儀 瑞士TECAN 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 德州扒雞貯藏條件及腐敗時間點的確定 通過文獻查閱可知，氣調包裝醬鹵肉制品通常貨架期在11 d 左右，本實驗所取德州扒雞均為當天產品（從生產線取出到取樣不超過3 h）。取樣后立即進行菌落總數測定，剩下樣品于4 ℃電冰柜中貯藏。每隔2 d 進行一次取樣，菌落總數測定方法參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》，以超過國家標準的菌落總數時間點作為腐敗末期時間點。

1.2.2 德州扒雞貯藏期間樣本高通量測序分析 在低溫4 ℃下貯藏，于貯藏0、2、4、6、8、10、12、14、16 d 取樣進行高通量測序。將雞肉樣本送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，委托其基于Illumina MiSeq 技術測序平臺進行高通量測序。

1.2.3 德州扒雞腐敗末期微生物傳統培養

1.2.3.1 腐敗微生物的分離及純化 選取腐敗末期（16 d）的德州扒雞進行菌株鑒定。選擇30～300 CFU的PCA 平板，然后選擇平板上形態不同的典型菌落，反復平板劃線分離，最終得到純化的單菌落，再將菌株保存于斜面上。

1.2.3.2 腐敗微生物的鑒定 對優勢腐敗菌進行初步的菌落形態觀察，包括菌落的顏色、形狀、質地、光澤、隆起狀況、粘稠度、透明度等。通過革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察菌體個體形態和排列狀況等。

將保存的菌株送往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。測序結果在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上BLAST 上進行查詢，相似度超99%即為同一菌屬，用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。

1.2.4 天然抑菌劑對優勢腐敗菌抑菌效價的評定

1.2.4.1 菌懸液的制備 在盧小菊等的方法上加以修改，把1.2.3 得到的優勢腐敗菌接種于LB 肉湯培養基，對其進行擴大培養至對數期，使用時用無菌生理鹽水制成10～10CFU/mL 菌懸液。

1.2.4.2 單一防腐劑抑菌效果測定 在宋萌等方法上加以改進，制備不同濃度的單一防腐劑：參照GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》食品添加劑最大允許使用范圍，分別制備含不同濃度的ε-PL（250、150、 100、60、30、15、0 μg/mL）、Nisin（500、 250、150、 100、 60、 30、 15、 0 μg/mL）、TP（500、250、150、 100、60、30、15、0 μg/mL）、LZ（500、250、150、100、60、30、15、0 μg/mL）的LB 培養基，向每組培養基中接入腐敗微生物后，在37 °C，180 r/min 條件下培養12 h，分別測定OD，同時設置未添加防腐劑的空白對照組。

1.2.4.3 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定 在姚永杰等方法上稍加修改，采用微量二倍稀釋法測定MIC 和MBC 值。稱取一定量抑菌劑制成含有-PL、Nisin、TP、LZ 濃度分別為16000 μg/mL 的LB 培養基。在96 孔板中加入100 μL LB 培養基。在第一個孔中加入100 μL 抑菌劑溶液混勻，吸取100 μL 轉移到頂行的下一個孔，依此類推進行倍比稀釋至最后一列，混勻后棄掉100 μL。設置無菌組作陰性對照組，加細菌菌懸液組作陽性對照，每個孔中約有5×10CFU/mL 的供試菌。然后將裝有細菌的微孔板放入37 °C 培養箱中靜置培24 h。菌液清澈透明，無沉淀、絮狀懸浮物或菌膜產生時抑菌劑的最低含量記為MIC。

在無菌條件下，從MIC 和大于MIC 濃度的孔中取出100 μL 培養液涂于PCA 平板，37 °C 培養24 h 后觀察菌落生長情況，沒有菌落生長的最低的濃度為該抑菌劑的MBC。

1.3 數據處理

所有實驗重復三次，高通量測序數據結果利用生信云平臺（https://cloud.majorbio.com/）進行分析處理，采用Origin 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 腐敗時間點的確定

德州扒雞4 ℃貯藏過程中的菌落總數變化如圖1 所示，從圖中可以看出德州扒雞的初始菌落數在2.4 lg（CFU/g）。0～12 d 菌落總數增長緩慢，主要是由于無氧的環境及較低的溫度抑制了產品中殘存的微生物快速繁殖，此時微生物需要一定的時間即遲滯期以適應新環境，12～14 d 菌落總數急劇增長，這主要是由于微生物在適應了較低的溫度后開始快速生長繁殖，第12 d 時菌落總數達到5.1 lg（CFU/g），已經超過了GB 2726-2016《食品安全國家標準 熟肉制品》中醬鹵肉制品菌落總數不得超過5.0 lg（CFU/g）的標準，所以12 d 為德州扒雞4 ℃貯藏條件下的腐敗時間點。在第14～16 d 菌落總數變化較為平穩，是由于微生物繁殖到一定密度后，會出現微生物之間的相互拮抗作用。

圖1 德州扒雞4 ℃貯藏過程中的菌落總數變化Fig.1 Changes of total bacterial count of Dezhou-braised chicken during storage at 4 ℃

2.2 高通量測序結果分析

2.2.1 德州扒雞貯藏期間微生物群落的多樣性分析多樣性分析可以反映樣品中微生物的多樣性，主要包括Shannon 指數、Simpson 指數、Ace 指數、Chao 指數和Coverage 指數等多種指數，其中Ace指數和Chao 指數反映群落的豐富度，Simpson 指數和Shannon 指數反映群落的多樣性，Coverage 指數反映群落的覆蓋度。本研究對不同貯藏時間的德州扒雞樣品進行高通量測序，通過最小樣本數進行抽平，根據97%的相似度進行聚類。結果如表1 所示，研究結果表明，Shannon 指數隨著貯藏時間的延長逐漸降低，Simpson 指數呈現逐漸增加的趨勢，說明樣品貯藏初期菌群多樣性較高，隨著貯藏時間的延長，菌群多樣性逐漸降低，群落物種均勻度逐漸下降。Ace 指數和Chao 指數在貯藏前期呈現動態變化，貯藏中后期降低趨勢較為明顯，說明德州扒雞細菌菌群豐富度前期隨著貯藏時間的延長不斷變化，可能由于初期菌群未適應環境變化，貯藏后期豐富度逐漸降低，此時出現優勢菌屬。

稀疏曲線可以反映樣品的取樣深度（圖2），隨著測序深度的增加，各樣本的稀釋度逐漸趨于平緩，表明送測樣本能夠充分反映其微生物多樣性情況。結合不同貯藏時間樣本的測序深度指數Coverage 指數（見表1）均大于99%，表明送測樣本的測序結果可以反映實際貯藏情況。

圖2 不同貯藏時間德州扒雞樣品細菌群落的Sobs 曲線（a）和Shannon 曲線（b）Fig.2 Sobs curve (a) and Shannon curve (b) of bacterial community of Dezhou-braised chicken samples at different storage times

表1 德州扒雞貯藏過程中細菌群落的多樣性分析Table 1 Diversity analysis of bacterial community in Dezhou-braised chicken during storage

2.2.2 德州扒雞貯藏期間群落組成分析 如圖3 所示，在貯藏前期（0～4 d），細菌種類復雜多樣，且各細菌所占比例均不高。嗜冷桿菌屬（sp）在整個貯藏過程中都占有絕對優勢，在0～10 d 貯藏期間數量逐漸增加，在腐敗末期（12 d）其數量相對10 d 減少了0.69%，但其相對豐度達仍到76.97%，在貯藏后期（12～16 d），其數量呈現逐漸降低的趨勢。假交替單胞菌屬（sp）在達到腐敗末期前比例相對很低，但到了貯藏后期占比突然升高，在貯藏末期（16 d）相對豐度達到51.00%，與sp同時成為優勢菌屬，似乎表明貯藏后期的條件更有利于其生長。而sp在貯藏后期可能受到了sp的競爭。在腐敗末期時，假單胞菌（sp）相對豐度達到7.34%，肉食桿菌（sp.）相對豐度為4.35%，大球菌（sp）相對豐度為2.59%，氣球菌（sp）相對豐度為1.45%。

圖3 德州扒雞貯藏過程中細菌群落在屬水平的分布情況Fig.3 Distribution of bacterial community at genus level of Dezhou-braised chicken during storage

Gram 等報道，在貯藏過程中，食品中的微生物在初期種類多、結構復雜，隨貯藏時間的延長，最終一種或幾種微生物會在與其他細菌競爭過程中處于優勢地位，或產生抑制其他微生物生長的代謝產物，抑制其他微生物的生長而成為優勢菌群,與此研究結果相符。

2.3 傳統培養分析結果

高通量測序分析結果可知，sp是德州扒雞腐敗過程的優勢菌屬。通過傳統培養進行腐敗末期優勢菌的分離鑒定，共得到七株代表性顯著的菌株，分別編號為B1～B7，其菌落形態如圖4 所示。通過革蘭氏染色判定菌株B1、B2、B6、B7 為革蘭氏陽性菌，菌株B3、B4、B5 為革蘭氏陰性菌。

圖4 德州扒雞優勢腐敗菌的培養特征和細胞形態（100×）Fig.4 Culture characteristics and cell morphology of dominant spoilage bacteria in Dezhou-braised chicken (100×)

將純化培養的菌株進行測序，所得序列結果用Blast 進行比對，選取同源性最高的序列，利用MEGA7.0 軟件構建系統發育樹。結果如圖5 所示，菌株B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7 分別與廣布肉桿菌（）、水域微小桿菌（）、血嗜冷桿菌（）、變形斑沙雷氏菌（）、隆德假單胞菌（）、溶酪大球菌（）、綠色氣球菌（）的相關序列相似度達到99%以上。

圖5 基于16S rRNA 基因序列的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

綜上所述，通過分離鑒定，結合菌落形態特征可知，氣調包裝德州扒雞在4 ℃貯藏條件下優勢腐敗細菌主要為廣布肉桿菌（）、水域微小桿菌（）、血嗜冷桿菌（）、變形斑沙雷氏菌（）、隆德假單胞菌（）、溶酪大球菌（）、綠色氣球菌（）。對比圖3 可知，五種分離得到的腐敗菌均屬于腐敗末期高通量測序結果中的菌屬，對比高通量測序結果可知微小桿菌（sp.）和沙雷氏菌（sp）在腐敗末期相對豐度僅為0.04%和0.06%，可能因為所占比例過少圖中未顯示。

2.4 天然抑菌劑抑菌價效的評定

2.4.1 單一抑菌劑抑菌效力 選用-PL、Nisin、TP、LZ 四種常見的天然抑菌劑對德州扒雞分離出的七種腐敗菌進行抑菌能力測定，結果如圖6 所示。

圖6 不同天然抑菌劑對腐敗細菌的抑制效果Fig.6 Inhibitory effects of different natural antimicrobial agents on spoilage bacteria

-PL 和TP 是廣譜抑菌劑，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有較好的抑菌效果，從圖6（a）可以看出，隨著-PL 濃度的增加，腐敗細菌的OD值下降趨勢明顯，表明在國標范圍（0～250 μg/mL）內，-PL 能有效抑制腐敗細菌的生長。當-PL 濃度為250 μg/mL，腐敗細菌OD接近0，所有細菌的生長被完全抑制，其抑菌效果顯著。從圖6（d）可以看出，當TP 濃度達到250 μg/mL 時，僅能抑制、、的生長，當濃度達到國家規定標準500 μg/mL 時，仍未能抑制的生長，相較-PL 抑菌效果較差。

從圖6（b）可以看出，當Nisin 濃度為60 μg/mL時，可以抑制除兩種腐敗菌外所有細菌的生長，對其他五種細菌的抑菌效果優于-PL。從圖6（c）可以看出，當LZ 濃度達到500 μg/mL，僅能抑制兩種腐敗菌的生長，此濃度已達到國家規定標準上限，說明其抑菌效果與Nisin 相比較差。前人的研究中，生物抑菌劑Nisin 和LZ 對革蘭氏陽性菌大多比革蘭氏陰性菌具有更好的抑菌作用，但李偉麗等從腐敗醋酸中分離出13 種細菌，其中包含革蘭氏陰性菌耐酸乳酸菌，用Nisin 分別對分離出的菌株進行抑菌實驗，結果顯示Nisin 對耐酸乳酸菌也表現為強烈殺菌效果。在本實驗中，Nisin 對革蘭氏陰性菌也具有較好的抑菌效果，與李偉麗等研究結果相似。這可能與受試菌本身的特性有關，其抑菌機理有待進一步研究。

由于為德州扒雞腐敗末期的優勢腐敗菌，四種天然抑菌劑對該菌株的抑菌效果比較可知：Nisin＞-PL＞LZ＞TP，但由于Nisin 對兩種腐敗菌抑菌效果較差，故選用-PL 和Nisin 兩種天然抑菌劑進行下面的抑菌試驗。

2.4.2 最小抑菌、殺菌濃度的測定 采用微量二倍稀釋法測定-PL 和Nisin 兩種抑菌劑對分離出的七株腐敗菌MIC 及MBC 值，結果如表2 所示，-PL對供試菌株的MIC 為15.63～250 μg/mL，在國標范圍內能夠有效抑制腐敗菌的生長，Nisin 對七株供試菌的抑制效果由強到弱依次為：B7＞B2＞B6＞B1=B3＞B4=B5，對德州扒雞優勢腐敗菌的抑菌效果顯著。

表2 兩種天然抑菌劑的MIC、MBCTable 2 MIC and MBC of two natural bacteriostatic agents

3 討論與結論

氣調包裝醬鹵肉制品的二次污染環節較多，導致產品中初始污染微生物種類和數量各不相同，對醬鹵肉制品的質量安全產生重要影響。本文采取高通量測序技術，研究整個貯藏過程中菌落結構變化，發現sp為德州扒雞4 ℃貯藏過程中的優勢菌屬。sp耐鹽、滲透耐壓性強，且低溫酶使其可適應寒冷環境，因此在本產品中具有一定的致腐作用。葉可萍等運用傳統細菌平板培養對氣調包裝醬鹵鴨翅15 ℃貯藏過程中菌群結構分析表明sp為產品貯藏末期的優勢菌。劉均等研究不同包裝方式對貨架期冷鮮雞微生物菌相變化的影響，研究表明占比量最高，與本研究結果一致。本文結合傳統培養技術，分離出德州扒雞貯藏末期七種腐敗菌。其中sp.sp.sp.等都是氣調包裝鮮肉中的常見菌。賴宏剛研究表明醬鹵制品36 ℃貯藏條件下腐敗末期優勢菌以假單胞菌和乳酸菌為主。與本實驗研究結果差異較大，可能是由于不同貯藏溫度導致樣品腐敗的優勢腐敗菌不同。嗜冷菌一般是在-15～20 ℃之間最適宜生長，而普通細菌適應生長溫度為25～40 ℃，故在低溫條件下貯藏的肉制品更有利于嗜冷菌的生長。

天然抑菌劑來源于天然的動植物或微生物，因安全環保成為食品防腐保鮮的研究熱點。通過四種天然抑菌劑對七種腐敗菌抑菌能力的比較，-PL 和Nisin 均能有效抑制腐敗菌的生長，其中-PL 對的抑菌能力較強，MIC 為15.63 μg/mL。-PL 由鏈霉菌好氧發酵產生，能在人體內分解為賴氨酸，可完全被人體消化吸收，對人體無任何副作用。Nisin 作為一種新型多肽，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶分解成氨基酸，不會改變腸道內的正常菌群或與其它抗生素出現交叉抗性，是目前世界上唯一允許被用作食品添加劑的細菌素。-PL 抑菌性與其對菌體細胞壁和細胞膜系統的破壞有關，而Nisin 主要作用于菌體細胞膜，孔道理論認為Nisin 可以通過使微生物細胞膜中形成孔道，導致細胞內三磷酸腺苷、核苷酸以及氨基酸等小分子物質快速流出，細胞的生物合成過程受阻，從而使微生物細胞裂解死亡。

將高通量測序和傳統培養方法結合起來可以更好地驗證菌群構成，本研究通過高通量測序得到德州扒雞腐敗過程中的群落組成結構，通過傳統培養分離得到腐敗末期七種腐敗菌，與高通量測序結果相對應，其中五種腐敗菌占比較高。利用-PL、Nisin、TP、LZ 四種天然抑菌劑對分離得到的腐敗菌進行抑菌試驗，得到-PL 和Nisin兩種抑菌劑對腐敗菌具有較好的抑菌效果，為后續德州扒雞的防腐保鮮提供了理論依據，但仍需進一步采集不同時間點德州扒雞的腐敗菌樣品，確定不同季節導致德州扒雞腐敗變質的微生物是否存在差異，以期闡明季節變換對德州扒雞腐敗時間的影響及腐敗機制。