嬰兒源鼠李糖乳桿菌的篩選及其促腸道類器官生長的研究

蓋賽倫，陳曉潔，凌 濤，張騰勛，耿 萌，齊 威，羅學剛，張同存，王 楠,

（1.天津科技大學生物工程學院，教育部工業發酵微生物學重點實驗室，天津 300457；2.天津市微生物代謝與發酵過程控制工程研究中心，天津 300457）

嬰兒期是腸道菌群定殖的關鍵時期，腸道菌群早期定殖模式可以影響腸道生理發育、免疫系統、神經系統等的成熟，影響遠期肥胖、過敏性疾病等的發病幾率。近年來，國內外大量研究顯示腸道微生物參與調控腸道細胞增殖分化，其中，益生菌發揮了極重要的益生作用。益生菌的干預對動物早期腸道形態發育、腸道上皮細胞增殖分化、腸道緊密連接及粘膜屏障形成等腸道發育過程有重要影響。一方面，益生菌可以通過自身組分（如菌毛蛋白、細胞壁成分等）、代謝產物（丁酸等）、分泌蛋白（如鼠李糖乳桿菌LGG 分泌的P40 和P75）等促進腸道上皮細胞的增殖分化、增強腸道粘膜屏障功能；另一方面，益生菌還可以通過調節腸道菌群結構來調節腸道功能，進而促進機體腸道粘膜免疫功能。

鼠李糖乳桿菌（）是一種存在于人體腸道中的革蘭氏陽性菌。其中，鼠李糖乳桿菌LGG 是目前全球研究最為廣泛，應用最多的益生菌之一，主要通過平衡腸道菌群、維護腸道屏障結構完整、調節腸道免疫功能和增強腸道免疫力發揮對腸道的保護作用。LGG 通過促進腸道緊密連接和黏蛋白表達維護腸道屏障結構完整。LGG 的早期定殖（出生后1～5 d）促進了小鼠腸道功能成熟和免疫球蛋白A 的產生，同時降低了其成年后對結腸炎的易感性。然而，目前可用于嬰幼兒食品的益生菌菌株十分有限，且大多數為國外菌株，因此，篩選具有促進腸道生長發育潛能的鼠李糖乳桿菌，一方面對于研究益生菌調節腸道發育的功能機制具有重要科學價值；另一方面對于開發具有維護嬰幼兒腸道健康以及臨床腸道損傷修復作用的益生功能食品具有重要意義。

目前，大量用于研究益生菌在腸道發育和腸道疾病中作用的體外模型主要依賴于永生化的細胞系，但由于腸道不同部位的組織具有獨特的結構和生理功能，使用單一的離體細胞模型，很難模擬人體腸道的結構、功能，導致研究結果具有局限性。最近的研究表明，離體的腸道干細胞和隱窩可以在基質膠中經由3D 培養模式形成腸道類器官。這一結構包含特定組織來源的所有終末分化細胞，在形態和細胞組成上與體內腸道極為相似。來自小腸的腸道類器官由于其隱窩豐富通常是體外研究腸道發育和損傷修復的良好工具。目前已有利用小腸類器官研究益生菌對腸道發育影響的相關報道。Wu 等研究證實了羅伊氏乳桿菌（）D8 既可以在生理條件下促進來自小腸的腸道類器官生長增殖，也可以改善TNF-誘導的腸道類器官的損傷，促進腸道上皮的修復。Hou 等利用腸道類器官與固有層淋巴細胞的共培養體系，證明了羅伊氏乳桿菌D8 可以通過刺激固有層淋巴細胞分泌IL-22 來促進腸道干細胞及腸上皮細胞增殖，進而修復受損的腸道屏障。

本研究以從1 月齡健康嬰兒糞便中分離鑒定的5 株鼠李糖乳桿菌作為實驗菌株，比較其耐酸、耐膽鹽、表面疏水性、自動聚集能力及黏附性能，篩選出具有優良抗性和黏附性能的鼠李糖乳桿菌SW-02，并進一步利用腸道類器官模型對鼠李糖乳桿菌SW-02 的促進腸道細胞增殖、完善腸道緊密連接及粘膜屏障的作用進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用菌株鼠李糖乳桿菌LGG 菌株 中國工業微生物菌種保藏中心，菌種保藏號：ATCC 53103；5 株鼠李糖乳桿菌SW-01、SW-02、SW-03、SW-04、SW-X 和兩株副干酪乳桿菌TX-01、TX-02 分離自1 月齡健康嬰兒糞便，保藏于天津科技大學工業微生物菌種資源平臺；雄性SPF 級C57BL/6 小鼠（4 周齡） 中國軍事醫學科學院實驗動物中心（北京），動物試驗均按照天津科技大學試驗動物福利倫理委員會（GB/T 35892-2018）批準的方案進行；人結腸癌細胞HT-29（ATCC HTB-38） 保藏于本實驗室，用10%胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）的DMEM/F12培養基中，在37 ℃、5% CO的條件下培養。

MRS 培養基、瓊脂粉、瓊脂糖、鹽酸、牛膽鹽、青-鏈霉素、冰杜爾貝科磷酸鹽緩沖液（Dulbecco Phosphate-Buffered Saline，DPBS）、M-MLV 逆轉錄酶（20000～28880 U/mg）、Trizol 試劑、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） 北京索萊寶科技有限公司；DMEM/F12 培養基 美國Gibco 公司；胎牛血清新西蘭Newzerum 公司；溫和細胞解離試劑（Gentle Cell Dissociation Reagent，GCDR）、類器官培養基（IntestiCult OGM Mouse Kit） 加拿大干細胞技術有限公司；基質膠（Matrigel Matrix） 美國BD 公司；SYBRGreen qPCR Master mix 德國DBI Bioscience 公司；EdU 檢測試劑盒 大連美侖生物技術有限公司；小鼠黏蛋白2（Mucin2，MUC2）檢測試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；多聚甲醛 天津市江天化工技術股份有限公司；TritonX-100、四甲基偶氮唑鹽（MTT） 美國Sigma 公司；胎牛血清（FBS） 澳洲Ausbian 公司。

TUS-200P 振蕩型恒溫金屬浴 中國上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD 型單人單面凈化工作臺中國上海滬凈醫療器械有限公司；HE-120 多功能水平電泳槽 中國上海天能科技有限公司；SKY-2102C 生化培養箱 中國上海蘇坤實業有限公司；311 型CO培養箱 美國賽默飛世爾科技有限公司；ECLIPSE TE2000U 倒置顯微鏡 日本尼康公司；LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌器 中國上海申安有限公司；Hybrid Technology多功能酶標儀美國伯騰儀器有限公司；StepOnePlus實時熒光定量PCR 儀 美國應用生物系統公司；JIDI-18D 離心機 廣州吉迪儀器有限公司；TY-80B 脫色搖床常州潤華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化和生長曲線測定 從-80 ℃冰箱取出凍存的菌液，在無菌超凈臺中劃線于固體MRS培養基上，挑取單菌落于5 mL 液體MRS 培養基中活化兩次，將活化的菌體以1%（v/v）的接種量接種于液體MRS 培養基中，置于37 ℃恒溫孵育器24 h，每隔2 h 取樣，并在600 nm 波長處測定其光密度值，繪制菌株的生長曲線。

1.2.2 供試菌株耐受性實驗

1.2.2.1 耐酸性能力測定 參照郝冉等的方法，將離心洗滌后的菌體分別重懸于經溶解度為36%～37%的鹽酸調節后pH 為1、2、3 的液體MRS 培養基中，以正常pH 的菌液作為對照（正常生長狀態的乳酸菌），調整菌液濃度為5×10CFU/mL。各組分別取100 μL 接種于96 孔培養板中，37 ℃培養4 h。每孔加入20 μL 5 mg/mL 的MTT 作用4 h，終止培養后每孔加入100 μL 的二甲基亞砜，在室溫于轉速為100 r/min 的搖床上振蕩15 min 以充分溶解結晶物。利用多功能酶標儀測量570 nm 波長處的吸光度（OD）值，存活率按以下公式計算：

1.2.2.2 耐膽鹽能力測定 參照Liu 等的方法，將活化的菌體以10CFU/mL 分別接種在空白對照MRS 液體培養基、含有0.1%、0.2%、0.3%膽鹽的MRS 液體培養基中，以不含膽鹽的菌液作為對照（正常生長狀態的乳酸菌）。37 ℃培養4 h，采用同1.2.2.1 的MTT 方法進行檢測和計算存活率。

1.2.2.3 菌株疏水率測定 參照杜蘭蘭等的方法，將活化的菌體以2%（v/v）接種量接種于MRS 液體培養基中，37 ℃培養箱中過夜培養。菌液以5000 r/min離心10 min 收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS，pH7.2）洗滌2 次后重懸。利用多功能酶標儀在600 nm 處檢測其吸光度即初始吸光度值OD，之后將3 mL 細菌懸浮液與600 μL 的二甲苯（5:1）混合，漩渦振蕩2 min。室溫孵育1 h，棄去有機相，取水相于600 nm 波長處測定其吸光度值OD，表面疏水性按以下公式計算：

1.2.2.4 菌株自動聚集率測定 參照杜蘭蘭等的方法，將活化的菌體以2%（v/v）接種量接種于MRS 液體培養基中，37 ℃培養箱中過夜培養。將菌懸液漩渦振蕩10 min 后在600 nm 波長下測定其吸光值作為整個細菌懸液的吸光值（OD），后放于37 ℃靜置孵育。分別在30、60、90、120、150 min時取上層樣品，測定其吸光度（OD）。自動聚集率按以下公式計算：

1.2.2.5 對腸道細胞的黏附能力評價 參照Li 等的方法評價細菌對結腸癌細胞HT-29 的黏附能力。將HT-29 細胞接種于96 孔板中，待細胞長至單層貼壁狀態，1×PBS 清洗細胞兩次后加入無抗生素和無血清的DMEM/F12 培養基預孵育37 ℃培養30 min。將活化的菌體以10CFU/mL 懸浮于無抗生素和無血清的DMEM/F12 培養基中以制備細菌懸液，棄去細胞培養板中培養基后每孔加入制備好的細菌懸液100 μL，37 ℃孵育2 h，PBS 洗去未黏附的細菌后于波長570 nm 處測定吸光值（黏附菌組），以未進行PBS 清洗細菌的細胞作為總菌組，以不加細菌懸液的細胞組作為對照組，之后采用同1.2.2.1 的MTT方法進行檢測和計算黏附能力。計算公式如下：

1.2.3 供試菌株對腸道類器官生長的影響

1.2.3.1 類器官的提取與分離 參考Sato 等的方法略作修改，在幽門下5 cm 處及距回盲部5 cm 處分別離斷小腸。將小腸放入DPBS 中，去除殘留的腸系膜及血管，然后用10 mL 注射器吸取冰DPBS從靠近幽門端沖洗腸腔，使腸內容物排出。將洗凈的小腸剪成5 mm 左右的片段，轉移至50 mL 離心管，冰浴靜置至腸片段沉底，棄掉上清，加入25 mL 溫和細胞解離試劑置于搖床上以20 r/min 轉速室溫孵育15 min，用含有0.1% FBS 的PBS 終止消化，反復吹吸，自然靜置5min 吸取上清，以70 μm 細胞過濾器過濾收集上清液，沉淀，重復上述吹吸步驟3 次。過濾后的上清液于4 ℃以300 g 的離心速率離心5 min，棄上清液，分別用預冷的添加1%青-鏈霉素的PBS和DMEM/F-12 培養基重懸沉淀并離心進行清洗。最后加入適當體積類器官生長培養基重懸沉淀，以1:2 比例與Matrigel 混勻，按每孔50 μL 的體積種植到37 ℃預溫的24 孔板中，放入培養箱中1 h，待基質膠固化后，加入500 μL 類器官生長培養基進行培養，每2～3 d 換一次培養基，每5～7 d 傳代一次。

1.2.3.2 類器官與菌株共培養及出芽率、出芽個數的計數 倒置顯微鏡下觀察類器官的生長情況，將類器官以50 個/孔的密度接種到24 孔板，待1～2 d 后生長到具有一定球形類器官結構時與菌株進行共培養。將菌體用類器官生長培養基進行重懸，以1×10CFU/孔的密度加入到細胞培養板中。實驗分為3 組進行，對照組（Control）、LGG 共培養組和SW-02 共培養組。共培養3 d，在光學顯微鏡下觀察類器官生長情況，并計算類器官的出芽率及出芽個數。

1.2.3.3 EdU 染色評估類器官的增殖狀態 類器官的增殖情況利用EdU 細胞增殖檢測試劑盒進行，實驗步驟參考試劑盒說明書進行。首先對處理后的類器官進行EdU 標記，每孔加入200 μL 含有50 μmol/L EdU 的培養基孵育2 h，棄去培養基。用4%多聚甲醛進行固定，然后利用Apollo?熒光染料進行染色，最后用Hoechst33342 對細胞核進行染色以評估總細胞數，并在共聚焦顯微鏡下觀察計數，計算EdU 陽性細胞數的比例。

1.2.3.4 實時熒光定量PCR 測定基因mRNA 的相對表達量 利用Trizol 試劑提取總RNA，取2 μg RNA 用M-MLV 逆轉錄酶進行逆轉錄。PCR 擴增體系20 μL：qPCR master mix 10 μL，50×ROX 0.4 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，無菌蒸餾水7.6 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，40 個循環；95 ℃l min，55 ℃ l min，95 ℃ 15 s 繪制熔解曲線。以GAPDH 作為參考基因，2法計算目標基因mRNA的相對表達量。目標基因的引物序列見表1。

表1 熒光實時定量PCR 引物Table 1 Primers for real-time PCR

1.2.3.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定MUC2含量 類器官與菌體共培養后，離心收集培養基上清，采用酶聯免疫吸附法檢測培養基上清液中MUC2 水平，試劑盒采用小鼠MUC2 的ELISA 檢測試劑盒，檢測方法參考說明書進行。最后在450 nm波長測定光密度值，同時根據標準品繪制標準曲線并計算樣本中MUC2 含量。

1.3 數據處理

數據采用平均值±標準差（mean±SD）表示，每組實驗重復3 次。運用SPSS 19.0 軟件，通過One-way ANOVA 和Two-way ANOVA 進行數據分析，試驗數據使用GraphPad Prism 5.0 軟件進行繪圖及擬合處理。＜0.05 認為具有統計學顯著差異。

2 結果與分析

2.1 供試菌株的生長曲線測定

通過生長曲線的測定來評價所篩菌株的差異性，結果如圖1 所示：

圖1 供試菌株的生長曲線Fig.1 Growth curve of the tested strains

由圖1 可以看出，所有的鼠李糖乳桿菌菌株在0～4 h 為生長遲滯期，4～12 h 進入對數生長期，OD由0.1 左右迅速提高至1.3 左右，此時生長速度較快。12 h 后進入穩定期，OD基本不變，與對照菌LGG 無明顯差異。而兩株副干酪乳桿菌TX-01和TX-02 生長較為緩慢，24 h 時OD 值分別為1.11和1.06。

2.2 供試菌株的耐受性

2.2.1 耐酸性能力測試 從圖2 可以看出：當pH為1、2 和3 時，鼠李糖乳桿菌SW-02 的存活率顯著高于商用菌株LGG（＜0.05），存活率分別達到了23.13%±1.75%、30.36%±2.54%和50.73%±2.77%。同時，在pH 為3 時，鼠李糖乳桿菌SW-03 和鼠李糖乳桿菌SW-X 的存活率顯著高于除SW-02 與LGG外的其他四組（＜0.05），存活率分別達到了35.17%±1.49%和33.51%±1.88%，也有較強的耐酸性。這表明SW-02、SW-03 和SW-X 具有更優的耐酸性，能在高濃度的胃液中存活并進入小腸。郭羽等證實，LGG 在pH1.5 和2 的條件下培養4 h 其存活率分別為25.12%和27.96%。賀珊珊等對5 株益生菌進行耐酸性篩選，其中鼠李糖乳桿菌LR-D 能夠短時耐受低pH 環境，在pH2.5 的發酵液中培養2 h的存活率能夠達到14.39%。對照本實驗結果，SW-02 的耐酸能力與上述菌相比更有優勢。

圖2 供試菌株的耐酸性能力Fig.2 Acid resistance of the tested strains

2.2.2 耐膽鹽能力測試 從圖3 可以看出，鼠李糖乳桿菌SW-X、SW-03 和SW-02 的耐膽鹽能力最為突出，顯著高于對照菌株鼠李糖乳桿菌LGG 和其余菌株（＜0.05），在膽鹽濃度為0.3%時，存活率分別達到了51.04%±4.61%、47.02%±4.11%和47.35%±4.21%。而SW-01、SW-04、TX-01 和TX-02 的存活率與LGG 相差不大。這表明，SW-X、SW-03 和SW-02具有更優的耐膽鹽性。與本文的研究結果相似，呂嘉櫪等發現在膽鹽濃度為0.1%～0.3%時，LGG 菌落存活率為37%～60%。薛梅等發現鼠李糖乳桿菌LV108 在膽鹽濃度為0.3%時，培養2 h 后存活率在45%左右，在膽鹽濃度為0.1%時，培養2 h 后存活率大于75%。對照本實驗結果，SW-X、SW-03 和SW-02 在相同濃度膽鹽處理4 h 時，存活率與鼠李糖乳桿菌LV108 處理2 h 時結果相似，表明本實驗篩選菌株SW-X、SW-03 和SW-02 具有更好的耐膽鹽能力。

圖3 供試菌株的耐膽鹽能力Fig.3 Bile salt tolerance of the tested strains

2.2.3 疏水率和自動聚集率測定 研究表明，細菌的疏水性能力、自動聚集能力和細菌的黏附性能存在一定的相關性，疏水性和自動聚集能力越高，其粘附性越好。因此，通過疏水性實驗和自動聚集實驗，來測定菌株對HT-29 細胞的粘附性，以評價菌株在腸上皮的粘附能力。結果如圖4、圖5 所示：

圖4 供試菌株的疏水率Fig.4 Hydrophobicity of the tested strains

圖5 供試菌株的自動聚集率Fig.5 Automatic aggregation rate of the tested strains

從圖4 可以看出，細菌表面疏水性實驗中，不同菌株的疏水性能力出現出明顯的差異，SW-02、SW-01、LGG、SW-04 和TX-02 的疏水率相對較高，分別為22.94%±1.80%、22.36%±1.68%、16.52%±2.10%、12.90%±2.53%和12.76%±1.75%，而SW-03、SWX 和TX-01 的疏水性能力相對較差，分別為10.87%±2.07%、6.46%±1.80%和8.74%±1.69%。杜蘭蘭等的研究表明，LGG 對二甲苯的疏水率為9.85%±1.25%。李珊珊等的研究表明，鼠李糖乳桿菌ATCC7469對二甲苯的疏水率為15%左右，對照本實驗結果，SW-02 和SW-01 的疏水性能力與上述菌相比更有優勢。

從圖5 可以看出，自動聚集能力實驗中，各菌株之間的自動聚集率表現出明顯的差異。在2.5 h 時，SW-01 自動聚集率最高，為14.46%±1.20%，SW-02 和SW-03 次之，自動聚集率分別達到了11.55%±0.89%和10.57%±1.04%。龔虹等認為自動聚集能力高的細菌，其表面疏水性也高。本研究中對比表面疏水性能力和自動聚集能力結果發現SW-01 和SW-02的表面疏水性與自動聚集能力均較高。

2.2.4 供試菌株對結腸癌細胞HT-29 黏附能力的測定 為了進一步驗證菌株對腸道上皮細胞的黏附能力，利用HT-29 細胞測定了各菌株對細胞的粘附能力。結果如圖6 所示：

圖6 供試菌株對HT-29 細胞的黏附率Fig.6 Adhesion rates of the tested strains to HT-29 cells

從圖6 可以看出，與對照菌株LGG 相比，菌株SW-02、SW-01 和SW-03 均表現出較高的黏附能力，黏附率分別為17.42%±1.22%、14.01%±1.82%和12.52%±1.43%。菌株TX-01 和TX-02 的黏附能力最差，黏附率均顯著低于對照菌株LGG（＜0.05）。與本文的研究結果相似，唐雅茹等測得植物乳桿菌KLDS1.0386 對腸上皮細胞的黏附率為16.65%。在本研究中，通過對菌株生長曲線、耐酸耐膽鹽實驗、疏水性實驗和自動聚集能力實驗以及細胞黏附實驗的測定，綜合判斷發現從健康嬰兒中分離獲得的菌株SW-02 的耐受性較好，因此后續對鼠李糖乳桿菌SW-02 的促腸道類器官生長作用進行評價。

2.3 鼠李糖乳桿菌SW-02 對腸道類器官的影響

2.3.1 鼠李糖乳桿菌SW-02 對腸道類器官生長的影響 從小鼠小腸中分離隱窩，并進行長期傳代培養形成腸道類器官，結果如圖7 所示。

分離的腸道隱窩數小時至1 d 內閉合構成球形結構（圖7A），其中心可見內腔，隨著腸道干細胞的自我更新、不斷增殖，2～3 d 左右形成出芽結構并向外突出生長（圖7B），經6～7 d 培養后類器官最后可形成多個出芽結構，演化成為典型的腸道類器官（圖7C）。后續視類器官的生長情況5～7 d 可傳代1 次，凍存、復蘇后均有活力。

圖7 腸道類器官的形態學變化Fig.7 Morphological changes of intestinal organoids

為了進一步評價鼠李糖乳桿菌SW-02 對腸道類器官生長的影響，以LGG 作為對照菌株，將SW-02 與腸道類器官進行共培養，結果如圖8 所示。

從圖8 可以看出，與對照組相比，與鼠李糖乳桿菌SW-02 共培養的類器官體積明顯增大，同時SW-02 顯著提高了類器官的出芽率和出芽個數（＜0.05）。這說明SW-02 能促進干細胞的增殖和分化，促進了腸道類器官的生長。類器官具有某些與來源器官相似的結構特征和功能特性，而且能夠在體外3D 培養體系中穩定擴增，因此在生物學基礎研究、構建疾病模型、腫瘤研究、組織再生修復、基因治療以及藥物篩選等方面顯示出了廣闊的應用前景。Lukovac等利用腸道類器官模型，研究了益生菌的代謝產物短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFA）及嗜黏蛋白阿克曼菌（）和普氏糞桿菌（）的代謝產物對腸道類器官中基因轉錄水平的影響。與本文的研究結果相似，羅伊氏乳桿菌D8 可以促進小鼠腸道類器官生長增殖。Sittipo 等證實熱滅活的嗜酸乳桿菌可以使輻射所致損傷的腸道類器官恢復生長，提高出芽率。

圖8 鼠李糖乳桿菌SW-02 對腸道類器官生長的影響Fig.8 Effect of L. rhamnosus SW-02 on the growth of intestinal organoids

2.3.2 EdU 染色檢測鼠李糖乳桿菌SW-02 對腸道類器官中細胞增殖的影響 利用EdU 染色評價了鼠李糖乳桿菌SW-02 腸道類器官中細胞增殖的影響，結果如圖9 所示。

從圖9 可以看出，鼠李糖乳桿菌SW-02 能促進類器官中細胞的增殖，EdU 陽性細胞的百分比為85.2%±2.7%，顯著高于對照組的45%±0.9%（＜0.05）。與LGG 共培養的類器官中EdU 陽性細胞的百分比為69.9%±5.5%。這說明SW-02 的刺激，能夠促進腸上皮細胞的增殖。相似地，Wu 等和Hou 等兩個研究工作均證實羅伊氏乳桿菌D8 可以上調腸道類器官中EdU 陽性細胞數。

圖9 EdU 染色檢測鼠李糖乳桿菌SW-02 對腸道類器官增殖的影響Fig.9 Effect of L. rhamnosus SW-02 on the proliferation of intestinal organoids by EdU staining

2.3.3 鼠李糖乳桿菌SW-02 對腸道類器官中相關基因mRNA 水平的影響是腸道干細胞的標記物，陽性細胞能夠分化為所有類型的腸道上皮細胞，是一種增殖細胞的相關抗原，其功能與有絲分裂密切相關。緊密連接蛋白Zo-1 對于上調上皮增殖和促進有絲分裂的完成具有至關重要的作用。因此本研究利用Real-time PCR 檢測了腸道干細胞標志物、細胞增殖相關基因和緊密連接蛋白的mRNA 水平，結果如圖10 所示。

從圖10 可以看出，SW-02 的刺激顯著促進了的表達（＜0.05）；同時，的表達出現了明顯上調的趨勢，這與腸道類器官EdU 染色的結果一致；緊密連接蛋白的mRNA 水平也呈顯著上調的趨勢（＜0.05）。這些結果進一步說明鼠李糖乳桿菌SW-02 可以促進腸道類器官的生長，促進腸道屏障的成熟。Sittipo 等證實熱滅活的嗜酸乳桿菌可以上調輻射所致損傷的腸道類器官的的mRNA水平。是腸道上皮細胞增殖能力和腸道發育程度的常用檢測指標，已有多項關于益生菌及其蛋白對小腸類器官及乳鼠小腸組織中的影響的相關報道。與本研究結果相似，Wu 等證實羅伊氏乳桿菌D8 增加了小鼠小腸類器官中的mRNA 水平。

圖10 鼠李糖乳桿菌SW-02 對腸道類器官中相關標志基因mRNA 水平的影響Fig.10 Effect of L. rhamnosus SW-02 on the mRNA levels of the related marker genes in intestinal organoids

2.3.4 鼠李糖乳桿菌SW-02 對腸道類器官中黏蛋白MUC2 表達的影響 為了研究鼠李糖乳桿菌SW-02對腸道粘膜屏障的影響，利用ELISA 的方法檢測了鼠李糖乳桿菌SW-02 對MUC2 表達的影響，結果如圖11 所示。

圖11 鼠李糖乳桿菌SW-02 對腸道類器官中黏蛋白MUC2 表達的影響Fig.11 Effect of L. rhamnosus SW-02 on the express of MUC2 in intestinal organoids

從圖11 可以看出，與對照組相比，SW-02 的處理明顯促進了MUC2 的分泌。這些結果說明鼠李糖乳桿菌SW-02 有助于腸道粘膜屏障的完善。研究證實熱滅活的嗜酸乳桿菌可以上調輻射所致損傷的腸道類器官中的mRNA 水平。與這些研究相似，本研究中通過建立體外腸道類器官模型，發現鼠李糖乳桿菌SW-02 在腸道類器官的出芽個數、出芽率、增殖情況等方面具有顯著促進作用，同時可以上調、、的mRNA 相對表達量和粘蛋白MUC2 分泌。

3 結論

綜上所述，本研究以從一月齡健康嬰兒糞便中分離的5 株鼠李糖乳桿菌作為實驗菌株，以LGG 為對照菌株，通過耐酸、耐膽鹽、疏水性、自動聚集和細胞粘附性實驗，篩選出具有良好抗性的鼠李糖乳桿菌SW-02。進一步通過構建腸道類器官模型，發現鼠李糖乳桿菌SW-02 能夠促進腸道類器官的生長增殖、促進腸道緊密連接蛋白和粘蛋白MUC2 的表達，有利于腸道屏障的完善。以上研究結果表明鼠李糖乳桿菌SW-02 具有潛在的應用價值，有望成為商業開發的備選菌株。