離子液體輔助酶法提取姜黃素類化合物工藝優化

譚 索，司瑞茹，強悅越，韋 航，黃 彪，曾紹校，陸東和，傅建煒,

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002；2.福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所/福建省農產品質量安全重點實驗室，福建福州 350003；3.福建省農業科學院農業工程技術研究所，福建福州 350003）

姜黃素類化合物是分布在姜黃、莪術和郁金等姜黃屬植物中的天然多酚化合物，主要包括姜黃素（curcumin，Cur，75%～80%）、脫甲氧基姜黃素（demethoxycurcumin，DMC，3%～5%）和雙脫甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcumin，BDMC，15%～20%）等，結構如圖1 所示。姜黃素類化合物呈橙黃色針狀/結晶粉末，不溶于冷水和乙醚，易溶于乙醇和乙酸。近年來大量研究表明姜黃素類化合物具有促進健康的作用，包括抗癌、抗菌、抗氧化、抗腫瘤和免疫調節等，并且由于其細胞毒性較低，高劑量給藥無副作用，幾個世紀以來在亞洲被廣泛使用，常作為香料、防腐劑、著色劑和治療劑等應用于食品或醫療領域。

圖1 姜黃素類化合物的結構Fig.1 Structure of curcuminoid

目前，提取姜黃素類化合物的傳統方法有乙醇回流法、酸堿提取法、水楊酸鈉法、活性炭吸附法等。這些傳統的提取方法耗時長、提取率低、耗費大量有機試劑。此外，姜黃素為弱酸性物質，堿液提取時會導致其分解為香蘭素、阿魏酸和阿魏酰甲烷等。酶法提取也是提取植物活性成分常用的方法，酶法提取是利用適當的酶來破壞植物細胞壁，使得活性成分更容易被提取出來的方法，具有產物回收率高、溶劑用量少等優點。如齊瑞芳等和肖秀麗均采用纖維素酶、淀粉酶及木瓜蛋白酶組成的復合酶提取姜黃素，得到的產品質量穩定，反應條件易控制，但提取工藝中酶解反應時間大概需要2～4 h，因此酶法提取也面臨著酶解時間長的問題。基于此，近年來發展了多種新技術來輔助酶法提取姜黃素類化合物，如超臨界CO萃取法、超聲輔助提取法和微波輔助提取法，但這些方法都需要特定的儀器設備，價格昂貴，操作費用大，成本高，不適合工業運用。

離子液體由有機陽離子和無機或有機陰離子組成，是綠色化學新興研究領域之一。傳統溶劑只能依靠濃度差來完成提取，離子液體可以通過溶解纖維素來溶解部分植物細胞壁達到提取的目的，從而增大提取率和縮短提取時間。同時離子液體能夠有效穩定酶-底物的過渡態，降低反應活化能，使酶表現出較高的催化活性。徐佳琳、王佳等報道采用過離子液體提取姜黃素類化合物，并指出離子液體可以提高姜黃素類化合物的提取率。利用離子液體輔助酶法提取姜黃中姜黃素類化合物的工藝鮮見報道。

本研究采用離子液體（1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽）輔助酶法提取姜黃素類化合物，主要研究了離子液體與酶對姜黃素類化合物提取率的協同效果，考察了不同因素對姜黃素類化合物得率的影響，并通過響應面法優化提取工藝，以期為獲得得率高、經濟節約的姜黃素提取工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃 江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司；纖維素酶（酶活≥400 U/mg）、果膠酶（酶活≥500 U/mg）、木聚糖酶（酶活≥6000 U/mg）、半纖維素酶（酶活≥2 U/mg）、-淀粉酶（酶活≥50 U/mg）上海寶曼生物科技有限公司；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽 麥克林有限公司；姜黃素、脫甲氧基姜黃素、雙脫甲氧基姜黃素標準品 純度≥95%，壇墨質檢-標準物質中心；檸檬酸、磷酸氫二鈉、無水乙醇等均為國產分析純。

SPD-M40 超高效液相色譜儀 島津公司；TDL-5-A 離心機 上海安亭科學儀器廠；IKA VXR B S025旋渦振蕩 器 德國IKA 公司；AL204 電子天平 瑞士METTLER TOLEDO 公司；800Y 高速多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司；HD-2500 多管漩渦混合儀 杭州佑寧儀器有限公司；Sun Fire C柱色譜柱（4.6 mm×150 mm, 3.5 μm） 美國沃特世公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶法提取姜黃素類化合物 將姜黃粉碎后過80 目篩，稱取一定質量的姜黃粉于離心管中，加入20%（酶：姜黃粉）的纖維素酶，再按料液比1:10 加入pH4.8 緩沖溶液，混勻，置于60 ℃恒溫振蕩水浴鍋中酶解70 min；酶解結束后取出離心管按料液比1:10（姜黃粉：無水乙醇）加入無水乙醇，2500 r/min渦旋振蕩5 min 后，于4500 r/min 離心5 min，取出上清液，稀釋一定倍數后用高效液相色譜測定姜黃素含量。

1.2.2 乙醇法提取姜黃素類化合物 將姜黃粉碎后過80 目篩，稱取一定質量的姜黃粉于離心管中，按料液比1:20（姜黃粉：50%乙醇）加入50%乙醇，2500 r/min 渦旋振蕩5 min 后，于4500 r/min 離心5 min，取出上清液，稀釋一定倍數后用高效液相色譜測定姜黃素含量。

1.2.3 離子液體輔助酶法提取姜黃素類化合物 將姜黃粉碎后過80 目篩，稱取一定質量的姜黃粉于離心管中，加入20%（酶：姜黃粉）的纖維素酶，再按料液比1:10（姜黃粉:緩沖液）加入含15%的1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的pH4.8 緩沖溶液，混勻，置于60 ℃恒溫振蕩水浴鍋中酶解70 min；酶解結束后取出離心管按料液比1:10（姜黃粉:無水乙醇）加入無水乙醇，2500 r/min 渦旋振蕩5 min 后，于4500 r/min 離心5 min，取出上清液，稀釋一定倍數后用高效液相色譜測定姜黃素含量。

1.2.4 姜黃素類化合物的測定 采用液相色譜法，參照安徽省地方標準《食品中姜黃素含量的測定 液相色譜法》，并做適當調整。姜黃提取物中姜黃素的分析采用UltiMate 3000 HPLC（Thermo SCIENTIFIC）進行。色譜柱：C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Welch材料）；柱溫：30 ℃；洗脫液：純乙腈-0.5%乙酸水（50:50，v/v），等度洗脫；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL；檢測波長：425 nm；檢測時間：10 min。

1.2.5 姜黃素類化合物標準曲線 分別準確稱取10 mg 姜黃素標準品、脫甲基姜黃素標準品、雙脫甲基姜黃素標準品， 用甲醇定容至10 mL，作為混合標準儲備液。分別吸取不同體積的標準儲備液，用甲醇稀釋成濃度為100、500、1000、2000、4000 ng/mL的標準工作液。將混合標準溶液在上述色譜條件下進樣分析，以峰面積為縱坐標，對應濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 姜黃素類化合物得率測定

式中：X 為姜黃中姜黃素類化合物得率，%；C 為測定液中姜黃素類化合物濃度， g/mL；V 為提取液體積，mL；N 為稀釋倍數；m 為姜黃質量，g。

1.2.7 酶的篩選 按照1.2.1 的提取方法，從纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和-淀粉酶中選出最佳酶，以姜黃素素類化合物得率為指標，進行酶的篩選。

1.2.8 姜黃素類化合物提取工藝條件優化

1.2.8.1 單因素實驗 分別考察酶解pH（3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、6.0），離子液體添加量（0%、5%、10%、15%、20%、25%），酶添加量（5%、10%、15%、20%、25%、30%），酶解時間（30、50、70、90、110、130 min）和酶解溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）對姜黃素類化合物得率的影響。

1.2.8.2 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上，以酶解pH、離子液體添加量、酶用量、酶解時間和酶解溫度為自變量，設計Box-Behnken 試驗優化提取條件（表1），以姜黃素類化合物得率為評價指標，確定離子液體協同酶法提取姜黃素類化合物的最適條件。

表1 響應面試驗的因素和水平設計Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3 數據處理

采用 Design-Expert 10.0 軟件進行響應面試驗設計，Origin 2019 軟件進行數據分析。實驗數據均為三次平行實驗的均值。＜0.05 為具有統計學意義的顯著差異，*＜0.05，**＜0.01。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

利用高效液相色譜法分析姜黃素類化合物混合標準溶液，以峰面積為縱坐標（Y）， 以測定濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，Cur、DMC、BDMC 三者的回歸方程及相關系數見表2。

表2 標準曲線方程表Table 2 Table of standard curve equations

2.2 不同提取方法對姜黃素類化合物得率的影響

以姜黃素類化合物得率為指標，乙醇提取法為對照，研究了添加酶以及添加酶-離子液體對得率的影響，三種不同提取方法對姜黃素類化合物得率的影響結果如圖2 所示。可以看出，加酶后姜黃素類化合物得率有所提高，但并不顯著高于乙醇法提取（＞0.05），在加入離子液體后，得率顯著高于乙醇法提取和酶法提取（＜0.05）。王佳等的研究出現類似的結果，其采用離子液體-乙醇浸提姜黃中的姜黃素，比用乙醇-浸提的提取率提高了0.316%。

圖2 不同提取方法對姜黃素類化合物得率的影響Fig.2 The effects of different extraction methods on the yield of curcuminoid

從結果可知，離子液體對姜黃素類化合物的提取有較大影響。離子液體既能作為生物催化介質，提高酶的活性及酶解產物的得率，同時離子液體能夠有效穩定酶-底物的過渡態，降低反應活化能，使酶表現出較高的催化活性。有研究表明，姜黃素與離子液體可能通過氫鍵、疏水相互作用和π-π 相互作用達到增溶效果，在咪唑類離子液體中，碳鏈越長，對姜黃素的增溶效果越高。

與果膠酶、半纖維素酶、木聚糖酶和-淀粉酶相比，使用纖維素酶酶解后的姜黃素類化合物的得率更高。姜黃細胞壁主要由纖維素和半纖維素組成，纖維素容易產生分子內氫鍵及纖維素鏈之間的分子間氫鍵，并聚集形成纖維素微纖絲。當提取溶液中加入適量的纖維素酶時，能有效地破壞姜黃的細胞壁，提高提取效率。因此，選擇纖維素酶進行離子液體輔助酶法提取姜黃素類化合物的工藝優化。

2.3 單因素實驗

2.3.1 酶解pH 對姜黃素類化合物得率的影響 對不同pH 條件下纖維素酶-離子液體法對姜黃素類化合物的得率進行評價，結果如圖3 所示。從圖中可以看出，不同的酶解pH 對姜黃素類化合物的提取率沒有顯著影響（＞0.05），隨著pH 的變化，得率僅發生較小波動。得率在pH3.0～5.4 范圍內隨pH 的增大而增大，在pH5.4 時姜黃素類化合物得率達到5.49%，當pH＞5.4 時，姜黃素類化合物得率呈現下降趨勢。這是由于酶的活性存在一個最佳pH 范圍，酶解pH 越接近纖維素酶的最適pH，纖維素酶的活性就越高。有研究表明，pH 可以改變底物和酶分子的帶電狀態，影響底物和酶的結合，大于或者小于最適的pH，都會使得酶活性會顯著降低，同時也會引起蛋白的變性，從而影響酶的活性。姜黃素類化合物的溶出率也受pH 的影響，其在堿性條件下的溶解率更高，但極不穩定，容易分解為香蘭素、阿魏酸和阿魏酰甲烷等，而在酸性條件溶解率較低，但穩定性較好，這可能是pH3.0～6.0 時對姜黃素類化合物得率影響不顯著的原因。因此，選用pH4.8～6.0 進行響應面優化試驗。

圖3 酶解pH 對姜黃素類化合物得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis pH on the yield of curcuminoid

2.3.2 離子液體添加量對姜黃素類化合物得率的影響 離子液體添加量對姜黃素類化合物的影響如圖4 所示。可以看出，當離子液體添加量在0%～20%范圍時，姜黃素類化合物得率隨著離子液體添加量的增加而增加，添加量為20%時，姜黃素類化合物得率達到最大值。隨著離子液體添加量的增加，姜黃素類化合物得率下降。

圖4 離子液體用量對姜黃素類化合物得率的影響Fig.4 The effect of ionic liquid dosage on the yield of curcuminoid

由結果可知，離子液體添加量對得率有較大影響。離子液體具有較強的催化活性，在與酶結合提取姜黃素時，可以提高酶的活性。適當的離子液體添加能夠增強纖維素酶的催化活性，當離子液體添加量較低時，可能影響非酶水解反應速率，從而使反應初速率受到影響。但當離子液體添加量過多時，由于其本身較高的黏度，會使得溶劑提取體系的黏度增大，降低了傳質速率，使得有效成分的擴散能力下降，不僅影響了姜黃素類化合物的溶出，還阻礙了纖維素酶與底物的結合，從而影響到纖維素酶的催化作用，降低酶解速率。因此，選擇添加量為15%～25%離子液體進行響應面優化試驗。

2.3.3 酶添加量對姜黃素類化合物得率的影響 纖維素酶添加量對姜黃素類化合物的影響如圖5 所示。從圖中可知，酶添加量由5%增加到30%時，姜黃素類化合物得率總體上呈現先增加后降低的趨勢。在酶添加量為15%時，姜黃素類化合物得率到達最大值；當酶添加量大于15%時，姜黃素類化合物得率又呈下降趨勢。當酶添加量由5%增加到15%時，反應體系中纖維素酶對細胞壁的破壞程度隨酶添加量的增大而增大，細胞內膜的通透性增加，傳質阻力降低，因此姜黃素類化合物得率呈增加趨勢。而當酶用量過大時，姜黃素類化合物提取呈現下降趨勢，當酶過飽和時，也會增加提取液的粘稠度，不利于提取，導致得率下降，戴浩等采用酶解組合高速勻漿法提取人參中皂苷和多糖的研究中出現了類似的變化趨勢。因此，選擇添加量15%～25%纖維素酶進行響應面優化試驗。

圖5 酶添加量對姜黃素類化合物得率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on the yield of curcuminoid

2.3.4 酶解時間對姜黃素類化合物得率的影響 不同酶解時間對纖維素酶-離子液體法提取姜黃素類化合物得率的影響結果如圖6 所示。可以看出，酶解時間在30～90 min 范圍內，姜黃素類化合物得率緩慢增加，這可能由于在水浴振蕩的作用下，樣品和酶充分接觸，促進了樣品的酶解。當酶解時間超過90 min，水浴振蕩使樣品和酶繼續不斷碰撞，破壞了姜黃素類化合物的結構，姜黃素類化合物得率下降。因此，選擇70～110 min 進行響應面優化試驗。

圖6 酶解時間對姜黃素類化合物得率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of curcuminoid

2.3.5 酶解溫度對姜黃素類化合物得率的影響 酶解溫度對姜黃素類化合物的影響如圖7 所示。可以看出，在酶解溫度為30～60 ℃時，姜黃素類化合物得率呈現上升趨勢。溫度大于60 ℃時，酶會逐漸失去活性，姜黃素類化合物得率呈現下降趨勢。有研究表明，姜黃素類化合物在高于65 ℃時會發生降解因此，選擇50～70 ℃進行響應面優化試驗。

圖7 酶解溫度對姜黃素類化合物得率的影響Fig.7 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of curcuminoid

2.4 響應面試驗

2.4.1 響應面試驗設計及結果 在單因素實驗結果的基礎上，依據Design-Expert 10.0 軟件中的Box-Behnken 法，以得率為響應值,設計5 因素3 水平試驗來進行提取工藝的優化。選取的試驗因素與水平見表2，設計方案與試驗結果見表3。

表3 響應面試驗的設計方案與結果Table 3 Design scheme and results of response surface experiment

對擬合的響應面模型進行方差分析和顯著性檢驗后結果如表4 所示。

利用Design-Expert 10.0 軟件對表3 中的數據進行回歸擬合,得到如下回歸方程：Y=6.00+0.019A-0.12B+0.15C+0.0065D-0.0005E+0.026AB+0.015AC+0.005AD-0.057AE+0.023BC-0.034BD+0.082BE+0.013CD-0.036CE+0.01DE-0.28A-0.71B-0.28C-0.39D-0.41E

由于失擬項=0.9963，影響不顯著，說明除了已知因素的影響外，其他因素對試驗結果沒有顯著的影響，且該模型的＜0.0001，說明此模型的應變量與自變量的線性關系是顯著的。模型的決定系數=0.956，說明預測值與實測值之間具有較高相關性，該模型擬合程度較好。校正決定系數=0.921，表示可以用此數學模型解釋92.1%的姜黃素類化合物得率的變異性。綜上述分析，該方程擬合良好，可以應用此模型預測和分析實驗結果。

2.4.2 響應因子水平的優化 圖8 為根據回歸分析結果做出相應的立體響應面圖，進一步直觀說明酶解pH、離子液體添加量、酶添加量、酶解時間、酶解溫度之間的交互作用以及各因素對姜黃素類化合物得率的影響程度。從圖中可以看出，隨著各因素水平的升高或延長，姜黃素類化合物得率先增加后減少。結合表4 中5 因素值可知，5 因素對姜黃素類化合物得率的影響力：酶添加量＞離子液體添加量＞酶解pH＞酶解時間＞酶解溫度。

圖8 兩因素交互作用對姜黃素類化合物得率的響應面圖Fig.8 Response surface diagram of the interaction between the two factors on the yield of curcuminoid

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for regression model

經Design-Expert 10.0 分析優化，可得到離子液體協同酶法提取姜黃中姜黃素類化合物的最佳工藝條件為酶解pH5.4，離子液體20%，酶用量21%，酶解時間90 min，酶解溫度59 ℃。在此條件下，根據方程得到的得率預測值為5.922%，驗證實際得率為5.882%，與理論得率相對誤差為0.04%。

3 結論

本文以姜黃為原料，采用離子液體輔助酶法提取姜黃素類化合物，利用酶破壞姜黃的細胞壁，通過離子液體提高酶的活性，縮短酶解時間，減少有機溶劑的用量，并提高姜黃素類化合物得率。通過Design-Expert 10.0 軟件分析實驗數據可得到提取姜黃中姜黃素類化合物的最佳工藝為：酶解pH5.4，離子液體20%，酶用量21%，酶解時間90 min，酶解溫度59 ℃。在該工藝下姜黃素類化合物理論得率可達到5.922%，驗證實際得率為5.882%，比同等條件下50%乙醇的得率4.595%高出1.287%。這個結果表明該方法可以有效提取姜黃中的姜黃素類化合物，為姜黃素資源的開發利用提供了參考。