基于統計學和營養學的三種藻粉蛋白質營養價值評價與方法分析

李興艷，王 炎，張瑞霞，曹曉琴，馬 娟，羅光宏，焦 揚,3,

（1.河西學院生命科學與工程學院，甘肅張掖 734000；2.張掖美潔環境保護技術有限責任公司，甘肅張掖 734000；3.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅張掖 734000；4.甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅張掖 734000）

螺旋藻（），屬藍藻門，藍藻綱，顫藻科，螺旋藻屬或節旋藻屬，其蛋白質含量可達60%，且氨基酸組成平衡，消化率高。小球藻（），屬綠藻綱，綠球藻目，卵囊藻科，小球藻屬，是普生性單細胞綠藻，在自然界中分布廣泛，能利用光能自養，也能在異養條件下利用有機碳源進行生長、繁殖，其富含蛋白質，營養價值較高。杜氏鹽藻（），屬綠藻門、真綠藻綱、團藻目、鹽藻科，為綠色單細胞藻，是綠藻門中唯一缺乏細胞壁的藻類，具有糖蛋白形成的包被，含有豐富的-胡蘿卜素、蛋白質、多糖等。螺旋藻、小球藻和杜氏鹽藻分別在2004 年、2012 年和2009 年被衛生部確定為新資源食品。

目前，采用統計學或營養學的方法對蛋白質營養評價的研究較多，如：魏文志等采用必需氨基酸指數法評價了7 種小球藻營養價值，并利用主成分和聚類分析法比較分析了7 種小球藻蛋白質氨基酸的差異性。董黎明等利用氨基酸分和必需氨基酸指數對來自不同產地的4 株蛋白核小球藻和2 株橢圓小球藻進行了營養價值評價，并運用統計學方法探討了異養小球藻在營養成分和氨基酸含量上的差異等。但對統計學和營養學評價蛋白質方法的差異研究報道較少。

本工作擬以絲路寒旱區產螺旋藻、小球藻和杜氏鹽藻三種微藻的凍干粉為研究對象，以相關文獻報道的蛋白質營養價值較高的小球藻、螺旋藻、杜氏鹽藻為對照，采用統計學和營養學的分析方法，對三種藻粉蛋白質的營養價值進行綜合比較，并分析各種方法的特點，以期對藻粉質量的監管和藻類產品的營養評價提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氨基酸混合標準品（0.1 μmol/mL） 美國Sigma公司；硫酸 成都市科隆化學品有限公司；硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅指示劑 天津市致遠化學試劑有限公司；氫氧化鈉 天津市北聯精細化學品開發有限公司；鹽酸 白銀良友化學試劑有限公司；硼酸 天津市福晨化學試劑廠；溴甲酚綠指示劑 天津市天新精細化工開發中心；95%乙醇 天津市百世化工有限公司，以上試劑均為分析純；藻類名稱和來源如表1所示。

表1 藻種名稱與來源Table 1 Algae name and source

L-8900 型全自動氨基酸自動分析儀 株式會社日立制作所；RE-52AA 型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；DHG-9246A 型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海璽袁科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗蛋白含量測定 參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定。

1.2.2 氨基酸含量測定 參照GB 5009.124-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》的酸水解法，利用氨基酸自動分析儀測定。

1.3 蛋白質營養評價方法

1.3.1 模糊識別法 設U 為待評價的各種藻粉蛋白，即U ={u,u,u,u,u,u}， 其中， u為1#小球藻蛋白，u為1#螺旋藻蛋白， u為 1#杜氏鹽藻蛋白， u為2#小球藻蛋白， u為 2#螺旋藻蛋白， u為2#杜氏鹽藻蛋白。對于每一個對象 u對 應一個模式P(u)=(u,u,u,···,u)，（i=1,2,···,6），模式中7 分量分別代表對象u的7 種必需氨基酸含量。以雞蛋蛋白為標準蛋白質，其中必需氨基酸含量（mg/g·Pro）為：P(a)=(a,a,a,···,a)=(50.3,92.5,56.3,34.1,56.3,52.3,68.3)， a， a，···，a分別是異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸及纈氨酸的含量。

根據蘭式距離法定義對象u 和標準蛋白a 的貼近度U （a,u），即

式中：a表示標準蛋白模式的第k 種必需氨基酸含量，mg/g·pro； u表 示第i個待評價對象的第k 種必需氨基酸含量，mg/g·pro；1≤k≤7。

1.3.2 氨基酸比值系數法 根據氨基酸平衡理論，以雞蛋蛋白中必需氨基酸模式譜計算必需氨基酸比值（EAA）、氨基酸比值系數（RC）和氨基酸比值系數分（SRC）。

式中： EAA為EAA 的平均值；CV 為RC 的變異系數。

1.4 數據處理

采用EXCEL2016 對實驗數據計算，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS26.0 軟件進行顯著性、相關性、主成分和聚類分析。顯著性分析采用單因素方差分析，差異顯著性水平為＜0.05；相關性分析為pearson 相關；聚類分析采用系統聚類法計算組間平方歐式距離。

2 結果與分析

2.1 三種藻粉的蛋白質及氨基酸含量比較

由表2 可見，實驗組三種藻粉的蛋白質含量差異顯著（＜0.05），其中小球藻的蛋白質含量最高，為70.77 g/100 g·DW，杜氏鹽藻的蛋白質含量最低，為42.29 g/100 g·DW。就實驗組三種藻粉而言，小球藻的蛋白含量雖與螺旋藻差異不大，但較杜氏鹽藻高，這種趨勢與文獻報道的三種藻粉的蛋白含量趨勢一致，由此，可以用三種藻粉進行蛋白質營養評價和方法研究。

表2 藻粉中蛋白質含量（g/100 g·DW）Table 2 Protein content of algae powder (g/100 g·DW)

為對三種藻粉的蛋白質進行營養評價，本研究分析了實驗組三種藻粉蛋白質的氨基酸組成與含量，以文獻報道的相應藻粉為對照，進行蛋白質中氨基酸的比較，結果如表3 所示。

表3 藻粉蛋白質的氨基酸組成及含量（mg/g·pro）Table 3 Amino acid composition and content of algae powder protein (mg/g·pro)

由表3 可見，實驗組杜氏鹽藻的總氨基酸和必需氨基酸含量與小球藻和螺旋藻的相比無顯著差異（＞0.05），但小球藻和螺旋藻的總氨基酸和必需氨基酸含量差異顯著（＜0.05），三者的氨基酸總量在730.68～1025.18 mg/g·pro 之間，必需氨基酸總量在291.98～403.26 mg/g·pro 之間。另外，實驗組小球藻的E/N 和E/T 與杜氏鹽藻和螺旋藻的無顯著差異（＞0.05），但杜氏鹽藻與螺旋藻的E/N 和E/T 差異顯著（0.05）。就實驗組三種微藻而言，杜氏鹽藻的E/N 與E/T 是最高的，分別為69.37%和40.96%，而螺旋藻的E/N 與E/T 是最低的，分別為64.84%和39.34%。進一步可以看出，實驗組三種藻粉的Met 組間差異顯著（＜0.05），而大多數氨基酸的組間差異不顯著（＞0.05）。由此，以E/N 和E/T 比較而言，實驗組三種微藻的蛋白質營養評價依次為杜氏鹽藻＞小球藻＞螺旋藻。

2.2 三種微藻蛋白質中氨基酸的統計學分析

采用統計學分析，可將大量的數據借助不同的分析手段，通過數據降維以排除眾多信息共存中相互重疊的信息，同時，這些變量要盡可能多地表征原變量的數據結構特征而不丟失信息，由此以主成分分析法和模糊數學法進行三種微藻的蛋白質營養分析。

2.2.1 主成分分析 以實驗組三種藻粉的17 種氨基酸為分析對象，引入文獻報道的相對應的三種微藻的17 種氨基酸，先對6 種藻粉蛋白質的氨基酸組分進行相關性分析，結果如表4 所示。

由表4 可見，各種氨基酸組分間相關性有差異，有的氨基酸含量間呈負相關如，Met 與Asp、Leu、Phe、Lys、His、Pro、Gly、Cys、Val；有的氨基酸含量間呈極顯著正相關（＜0.01）如，Asp 與Val，Ile 與Tyr、Arg，Tyr與Arg，Leu 與Pro；有的氨基酸含量間呈顯著正相關（＜0.05）如，Asp 與Leu、Phe 和Pro，Gly 與Ala、Val 與Phe和Lys，Ile 與Leu 和Pro 等，且大部分氨基酸組分間相關系數絕對值在0.5～0.8之間，屬中等程度的相關，說明各氨基酸間相關性較強。

表4 六種藻粉蛋白質氨基酸的相關性分析Table 4 Correlation analysis of amino acids of six algae powder proteins

由相關性關系表明，各氨基酸之間既有差異又具有一定的相關性，可用主成分分析對不同藻粉蛋白質的氨基酸數據進行降維和綜合評價。以 6 種藻粉蛋白質的17 種氨基酸的量構成17×6 矩陣進行PCA，得出主成分的特征值和方差貢獻率，按照特征值大于1 的原則提取主成分，結果如表5 所示。

由表5 可見，前4 個主成分的特征值均大于1，累計貢獻率為98.305%，表明前4 個主成分基本可反映6 種藻粉蛋白質氨基酸的絕大部分信息。因此，可選前四個主成分作為相互獨立的綜合性變量來代替17 種氨基酸對藻粉蛋白質進行全面分析。

載荷值主要反映了各氨基酸與主成分間的相關系數，其絕對值大小能夠反映各氨基酸對主成分的影響程度，載荷值絕對值越大說明該氨基酸對主成分的影響越大。4 個主成分的因子載荷矩陣，如表6所示。

由表5、表6 可見，第1 主成分的特征值8.924，在PC1 方向Asp、Leu、Pro 的載荷值較高，且與PC1 呈高度正相關。第二主成分的特征值3.348，在PC2 方向Met 與Tyr 的載荷值較高，且與PC2 呈正相關。第三主成分的特征值3.318，在PC3 方向Ser、Cys 和His 的載荷絕對值較高，其中Ser 和Cys 與PC3 呈正相關，His 與PC3 呈負相關。在PC4 方向Ala 的載荷值較高，且與PC4 呈正相關。由此可知，影響主成分的主要氨基酸中包括Leu 和Met 2 種必需氨基酸和Asp、Pro、Tyr、Ser、Cys、His 和Ala 7 種非必需氨基酸。

表5 主成分的特征值和貢獻率Table 5 Eigenvalues and contribution rates of principal components

表6 主成分的因子載荷矩陣Table 6 Factor loading matrix of the principal components

利用PCA 中前4 個成分對6 種藻粉蛋白質氨基酸進行了綜合評價，得藻粉蛋白質氨基酸4 個主成分因子的線性關系分別為：

因4 個主成分可從不同方面反映藻粉蛋白質氨基酸的總體水平，單獨使用某一種主成分并不能對其質量做出綜合性評價，因此以每個主成分對應的方差貢獻率作為權重，對4 個主成分進行權重加和，建立綜合評價模型F=0.525F+0.197F+0.195F+0.066F，計算各藻粉蛋白質氨基酸的綜合得分，結果如表7所示。進一步對藻粉種類進行了Q 型聚類，結果如圖1 所示。

表7 藻粉蛋白氨基酸的主成分得分、綜合得分及綜合排名Table 7 Principal component score, comprehensive score and comprehensive ranking of algae powder protein amino acids

F 值越大，表明該種藻粉蛋白質氨基酸的綜合評價越好。由表7 可見，實驗組三種微藻蛋白質的主成分分析的評價排序為螺旋藻＞杜氏鹽藻＞小球藻。

由圖1 可見，在歐幾里得距離小于5 時，實驗組小球藻和杜氏鹽藻聚為一類，而在歐幾里得距離為15 時，6 種藻粉可被聚為3 類，其中，實驗組和對照組的螺旋藻各聚為一類，實驗組和對照組的小球藻與杜氏鹽藻聚為一類。由此表明，從主成分分析來看，實驗組小球藻和杜氏鹽藻兩者蛋白質的氨基酸更接近，而實驗組的螺旋藻與對照組的螺旋藻蛋白質的氨基酸差異較大。

圖1 藻粉系統聚類分析圖Fig.1 System cluster analysis of algae powder

綜上所述，以主成分分析法對三種藻粉蛋白質營養評價排序為螺旋藻＞杜氏鹽藻＞小球藻。

因主成分分析法考慮了17 種氨基酸對藻粉蛋白質的評價貢獻情況，沒有區分必需氨基酸和非必需氨基酸對蛋白質營養的貢獻差異，由此，采用模糊識別法以待分析蛋白質中必需氨基酸與標準蛋白中必需氨基酸的貼近度U，進一步對實驗組藻粉的蛋白進行營養評價。

2.2.2 模糊識別法分析 根據公式（1）計算待評藻粉蛋白相當于標準蛋白（雞蛋蛋白）的貼近度，常數C 取0.09 以使計算結果處于區間[0,1]，能增加分辨度，利于結果比較。以U=1 作為標準，其結果越大，表明此藻粉蛋白質越接近模式蛋白，營養價值較高，結果如表8 所示。

表8 不同藻粉蛋白相對于標準蛋白的貼近度Table 8 Closeness degree between different algae powder protein and the model protein

由表8 可見，以雞蛋蛋白作為標準蛋白，實驗組三種藻粉蛋白的貼近度由高到低依次為螺旋藻＞杜氏鹽藻＞小球藻，而對照組三種藻粉蛋白質的貼近度依次為小球藻＞杜氏鹽藻＞螺旋藻。

綜上所述，基于統計學的主成分分析法和模糊識別法，實驗組三種藻粉蛋白質的評價順序均為螺旋藻＞杜氏鹽藻＞小球藻。

實驗組三種藻粉蛋白質以必需氨基酸和總氨基酸量的比較，結果為杜氏鹽藻＞小球藻＞螺旋藻，而以主成分分析和模糊識別法兩種統計學分析法，結果為螺旋藻＞杜氏鹽藻＞小球藻，基于兩種結果的差異，由此，進一步采用食品營養學中較常用的氨基酸比值系數法再次進行分析。

2.3 三種藻粉蛋白質的氨基酸比值系數法分析

氨基酸比值系數法中，主要由RC、SRC 兩組指標進行分析。RC 最小值對應的氨基酸是第一限制氨基酸，RC＞1 或RC＜1，說明這種必需氨基酸相對過剩或相對不足，RC=1 說明其組成比例與模式譜一致，營養價值較高。SRC 越小，說明待評價對象蛋白質的營養價值越低；SRC 接近100，則營養價值越高；SRC=100 時，說明該樣品中必需氨基酸組成比例與模式譜一致。由此，以雞蛋蛋白中必需氨基酸為模式譜，對實驗組三種藻粉蛋白必需氨基酸的RC和SRC 進行分析，結果如表9 所示。

表9 藻粉蛋白質中必需氨基酸的EAA、RC 和SRC 值Table 9 EAA, RC and SRC values of essential amino acids in algae powder protein

由表9 可見，除色氨酸由于處理方法的原因沒有檢測到外，以7 種必需氨基酸對藻粉蛋白質進行營養價值評價。實驗組三種藻粉及對照組小球藻與杜氏鹽藻的第一限制氨基酸均為Met，而對照組螺旋藻的第一限制氨基酸為Val。實驗組三種藻粉以SRC評價的排序為小球藻＞螺旋藻＞杜氏鹽藻，而對照組的SRC 評價的排序為螺旋藻＞杜氏鹽藻＞小球藻。

3 討論

通過蛋白質含量的比較可以看出，實驗組小球藻、螺旋藻和杜氏鹽藻的蛋白質含量差異顯著（＜0.05），其中小球藻和螺旋藻蛋白質含量在65.56～70.77 g/100 g·DW 之間。實驗組杜氏鹽藻的蛋白質含量為42.29 g/100 g·DW，是文獻報道的1.4 倍左右，可能的原因是微藻的營養組分會受生長環境條件的影響，這與閆春宇等的報道結果一致。就蛋白質含量而言，實驗組三種藻粉蛋白質的排序為小球藻＞螺旋藻＞杜氏鹽藻。

根據FAO/WHO 推薦模式，蛋白質E/N 在60%以上、E/T 在40%左右是營養理想的蛋白質。就必需氨基酸、非必需氨基酸和總氨基酸量的比較而言，實驗組三種藻粉蛋白質的評價依次為杜氏鹽藻＞小球藻＞螺旋藻，實驗組杜氏鹽藻藻粉的蛋白質含量雖最低，但其E/N 與E/T 的值均最高，可能是因其必需氨基酸的總量占比較高，而螺旋藻的必需氨基酸、非必需氨基酸和總氨基酸量含量雖均高于杜氏鹽藻，但因其非必需氨基酸含量較高，使得E/N 與E/T 的值均較低。在對照組中，杜氏鹽藻的E/N 與E/T 是最低的，與實驗組得出的結果不一致，這也表明，僅從數值的大小比較，不能全面比較蛋白質的質量。

對藻粉中的17 種氨基酸含量進行PCA 統計學分析，從中提取了4 個主成分因子，累積方差貢獻率達98.305%，根據各主成分的方差貢獻率構建綜合評價模型，得分越高說明對應藻粉蛋白質氨基酸綜合評價越好。進一步對主成分結果進行了聚類分析，發現實驗組杜氏鹽藻和小球藻在歐氏距離不到5 時，最先聚為了一類，而實驗組螺旋藻單獨聚為一類。由此表明，杜氏鹽藻和小球藻的蛋白質評價結果更接近，二者與螺旋藻的蛋白質評價結差異較大。實驗組三種藻粉的綜合得分為螺旋藻＞杜氏鹽藻＞小球藻。

進一步以模糊識別法，將蛋白質中必需氨基酸進行統計學分析，得出實驗組三種藻粉的蛋白質評價依次為螺旋藻＞杜氏鹽藻＞小球藻，這一結果與PCA分析結果相一致，但對照組三種藻粉蛋白質的貼近度依次為小球藻＞杜氏鹽藻＞螺旋藻，與PCA 分析不一致。可能的原因是PCA 關注的是所有氨基酸的量對蛋白質的整體貢獻，在4 個主成分中，提取出Leu 和Met 2 種必需氨基酸，以及Asp、Pro、Tyr、Ser、Cys、His 和Ala 7 種非必需氨基酸，這9 種氨基酸代表了17 種氨基酸的大多數信息，而模糊分析法僅分析的是必需氨基酸與蛋白質模式譜的貼近度，所選取的氨基酸類型有較大差異。另外，對照組三種藻粉的氨基酸含量來源于不同文獻，測定差異也是可能的原因之一。

為更全面比較蛋白質評價方法的特點，采用食品營養學上較常用的氨基酸比值系數法對實驗組三種藻粉中必需氨基酸進行了RC 和SRC 值分析，結果表明，實驗組三種藻粉的第一限制氨基酸均為Met，但對照組三種藻粉的第一限制氨基酸有Met 和Val。閆春宇等研究了22 株螺旋藻的氨基酸，結果表明只有藻株F-810 的第一限制氨基酸為Val，F-351 的第一限制氨基酸為Ile 等，可能是因為雖同為螺旋藻，但受營養、生長周期、采收時間和環境等的影響，第一限制氨基酸的種類也會出現差異。這與本研究結果一致。由SRC 值比較可得，實驗組三種藻粉蛋白質的營養價值排序為小球藻＞螺旋藻＞杜氏鹽藻，與蛋白質含量分析的結果一致。

綜合以上分析，模糊識別法和氨基酸比值系數法的原理是一致的，均以模式蛋白質中必需氨基酸含量為目標，比較其與目標值的接近程度，若某一種必需氨基酸含量太高，為過剩，但并不表明其營養價值高。而兩種方法分析的結果有差異，究其原因可能是SRC 法中考慮了某一種必需氨基酸與平均必需氨基酸的標準差，而模糊識別法僅以蘭氏距離法定義了貼近度，相對而言嚴謹性略低。主成分分析法從統計學角度對所有氨基酸的量標準化后，去掉了量綱差異進行了分析，沒有區分蛋白質生物學角度的營養，但可以分析出蛋白質中有代表性的氨基酸種類。FAO/WHO 推薦的蛋白質的E/N 和E/T 更注重必需氨基酸的量，而沒有考慮蛋白質在生物體內的吸收特點。

4 結論

本研究采用2 種統計學方法和2 種食品營養學上的常用方法，對絲路寒旱區的三種藻粉中蛋白質的營養價值進行了評價，實驗組三種藻粉蛋白質的營養價值為小球藻＞螺旋藻＞杜氏鹽藻。綜合四種方法的特點，氨基酸比值系數法和模糊識別法對蛋白質中必需氨基酸從生物吸收的角度開展分析，但就計算方法而言，氨基酸比值系數法更嚴謹，雖在本研究中模糊識別法與主成分分析法的結果一致，但采用主成分分析法分析蛋白質中代表性氨基酸種類可能更好些。而FAO/WHO 推薦的蛋白質E/N 和E/T 值分析法，僅關注的是必需氨基酸的量，而未考慮生物吸收必需氨基酸的特點。由于色氨酸在酸水解過程中被破壞，試驗結果缺少對色氨酸的分析，在后續研究中可用堿水解法測定色氨酸含量，進一步完善分析結果。本實驗所選的三種藻粉產地僅限于絲路寒旱區，來源單一，因此，在今后還應擴大采樣范圍，比較我國不同產地藻種的養殖、采收、干燥等因素對藻粉蛋白質營養價值的影響，為今后藻粉的質量監管和藻類產品的營養評價提供理論支撐。