貝萊斯芽孢桿菌處理對厚皮甜瓜保鮮效果及保護酶活性的影響

王靜怡，佐長賡，牛新湘，管力慧，楊紅梅，楚 敏，王 寧，林 青，婁 愷，史應武,5,

（1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆農業科學院微生物應用研究所，新疆烏魯木齊 830091；3.新疆特殊環境微生物實驗室，新疆烏魯木齊 830091；4.新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所，新疆烏魯木齊 830091；5.農業農村部西北綠洲農業環境重點實驗室，新疆烏魯木齊 830091）

新疆由于其獨特的氣候條件，是重要的瓜果產區。其中，厚皮甜瓜是新疆主要的特色瓜果之一。厚皮甜瓜為葫蘆科（Cuculacere），黃瓜屬（CucumisL.），一年生草本植物，對比其他甜瓜，厚皮甜瓜具有果肉甜度高、口感好、貯藏期長等優點[1]。然而由于其含糖量高，水分足，因此在氣溫高的夏季采摘容易使其受到病原菌的侵染，縮短其貯藏期，給生產者帶來經濟損失[2]。在厚皮甜瓜的貯藏過程中，自身對病原菌的防御會導致自由基的積累，自由基的積累會加速其腐敗進程[3]，厚皮甜瓜體內的保護酶在清除自由基中發揮了重要作用[4-5]。但在采后貯藏期間，保護酶的活性會由于外界因素的變化而降低，因此，減緩保護酶的活性降低及生防菌在厚皮甜瓜表面穩定定殖對延長厚皮甜瓜貯藏期具有積極意義。

果蔬保鮮的研究多使用物理和化學方式[6]，其中物理保鮮方式主要有低溫保鮮、氣調保鮮、輻照保鮮、光照處理保鮮、臭氧保鮮和熱處理保鮮等，杜紅鳳等[7]通過研究常溫、0.5 ℃和3 ℃貯藏條件下哈密瓜保護酶SOD、POD、CAT 活性的變化，得出0.5 ℃的貯藏條件對哈密瓜保護酶活性下降的抑制作用最為明顯；化學保鮮方式主要是利用植物生長調節劑和化學保鮮劑，其中，姚軍等[8]使用0.5%、1.0%和1.5%濃度的水楊酸對采后哈密瓜進行浸泡處理，得出不同濃度的水楊酸均可增強PAL、PPO 和POD的活性，抑制哈密瓜果實腐爛的結論。現今生物保鮮技術以其無污染，成本低，效率高等優點成為研究熱門[9]。生物保鮮技術主要有微生物拮抗保鮮、天然提取物保鮮和基因工程保鮮，其中，微生物拮抗保鮮的主要機理為抑制孢子萌發菌絲生長及誘導植物產生系統抗性[10-11]，劉奎等[12]探究獼猴桃接種枯草芽孢桿菌BS-1 對獼猴桃軟腐病的抑制效果及保鮮效果，發現接種BS-1 可顯著降低獼猴桃果實的腐爛率。目前，對于厚皮甜瓜保鮮效果及采后保護酶活性的變化研究，化學物理方式仍占據研究的主流[7]，近幾年生防菌由于其高效環保的特點逐漸成為研究熱點[13]，但把生防菌與溫度結合用在厚皮甜瓜貯藏期的研究鮮見報道。

本研究選用西州蜜25 號厚皮甜瓜，通過在4 ℃和25 ℃條件下在厚皮甜瓜表面接種貝萊斯芽孢桿菌BG-2，測定貯藏期間拮抗菌在厚皮甜瓜表面定殖特性、保鮮效果和厚皮甜瓜POD、PPO 和PAL 酶活性的變化趨勢，探究2 種溫度下貝萊斯芽孢桿菌BG-2 在厚皮甜瓜表面定殖特性、保鮮效果和對厚皮甜瓜貯藏期保護酶活性變化的影響。探討生物保鮮技術在厚皮甜瓜保鮮領域應用的可能性，為延長新疆厚皮甜瓜貯藏期的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

病原菌 來自實驗室從腐爛厚皮甜瓜中篩選出的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）CH-3；拮抗菌貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BG-2 篩選自厚皮甜瓜種植土地；厚皮甜瓜 選自市場（經新疆農業科學院園藝作物研究所鑒定為西州蜜25 號），購買大小相近、重量3 kg 左右，成熟度基本一致，表皮無損傷，無病害蟲害的西州蜜25 號；營養瓊脂（NA）培養基、營養肉湯（NB）培養基、馬鈴薯葡萄糖水培養基（PDB）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、LB 培養基 青島高科技工業園海博生物技術有限公司；NaCl 天津市登峰化學試劑廠；75%乙醇 天津市廣成化學試劑有限公司；過氧化氫酶試劑盒、多酚氧化酶試劑盒、苯丙氨酸解氨酶試劑盒 蘇州科銘生物技術有限公司。

UVZ255 型紫外分光光度計 日本島津自動化設備有限公司；CENTRIFUGE 型高速冷凍離心機EPPENDORF；GMSX-280 型高壓蒸汽滅菌鍋 北京市永光明醫療儀器廠；ZWY-2102C 型恒溫培養震蕩器 上海智城儀器制造有限公司；WY 型手持折射儀成都豪創光電儀器有限公司；Five Easy Plus 型pH計 北京東南儀誠實驗室設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 拮抗菌處理液的制備 將篩選出的拮抗菌在NA 板上劃線，32 ℃培養24 h，挑取單菌落接種于500 mL 有100 mL LB 培養基的錐形瓶中，32 ℃，180 r/min 搖瓶培養12 h，得到種子液。按2%的接種量接種至500 mL 裝有250 mL NB 培養基的錐形瓶中，32 ℃，180 r/min 搖瓶發酵3 d，8000 r/min 4 ℃離心5 min，取下層菌體沉淀，用0.85%的NaCl 溶液洗滌3 次，加入250 mL 相同濃度NaCl 溶液重懸菌體得到拮抗菌處理液。

1.2.2 病原菌處理液的制備 在PDA 平板中心接種一個病原菌菌餅，用6 mm 打孔器（1×105Pa 滅菌）在長滿病原菌的平板上打取15 個菌餅，接種至含有100 mL PDB 培養基的500 mL 錐形瓶中，25 ℃，160 r/min 搖瓶培養2 d 獲得種子液，以1%的接種量接種至含有250 mL 培養基的500 mL 錐形瓶中，25 ℃，160 r/min 搖瓶發酵5 d，8000 r/min 4 ℃離心5 min，取下層菌體沉淀，用0.85%的NaCl 溶液洗滌3 次沉淀，加入250 mL 相同濃度NaCl 溶液得到病原菌處理液。

1.2.3 厚皮甜瓜果實損傷后接種處理液 根據汪志浩等[14]的方法進行改進：將厚皮甜瓜表面用自來水沖洗干凈并晾干，用75%的乙醇對其進行表面消毒后用無菌水洗3 遍并晾干，選取厚皮甜瓜一側16 cm2的瓜面，用無菌針均勻的刺約2 mm 深的傷口30 個。

對照（CK）：將消毒處理后的厚皮甜瓜于生理鹽水中浸泡2 min。實驗設置3 個處理，處理1（T1）：用拮抗菌處理液（1×107CFU/mL）浸泡表面已消毒損傷厚皮甜瓜2 min；處理2（T2）：將表面消毒處理后的厚皮甜瓜用無菌棉簽蘸取病原菌處理液（1×105CFU/mL）涂抹傷口部位并晾干；處理3（T3）：將表面消毒處理后的厚皮甜瓜用無菌棉簽蘸取病原菌處理液（1×105CFU/mL）涂抹傷口部位，晾干后于拮抗菌處理液中浸泡2 min。。每種處理選取360 個厚皮甜瓜，180 個置于25 ℃，相對濕度55%的人工氣候箱中，180 個置于溫度4 ℃，相對濕度85%的冷庫中。常溫下每隔5 d 測定，低溫下每隔10 d 測定，每次測定每種處理選取9 個瓜。

1.2.4 厚皮甜瓜腐爛率的測定 根據汪志浩等[14]的方法進行改進，常溫下每隔5 d，低溫下每隔10 d，將病斑半徑大于10 mm 的厚皮甜瓜記為腐爛，記錄各組厚皮甜瓜腐爛數量，為方便統計，定義厚皮甜瓜腐爛率計算公式如下：

厚皮甜瓜腐爛率（%）=（腐爛果實數量/果實總數量）×100

1.2.5 厚皮甜瓜酶活測定 將待測厚皮甜瓜切開后稱取5 g 損傷部位果肉，勻漿后吸取1 mL，采用POD、PPO、PAL 測試盒進行提取測定，每次測定重復3 次。

1.2.6 厚皮甜瓜可溶性固形物（TSS）的測定 根據曹建康[15]的方法進行改進，取傷口部位隨機5 g 厚皮甜瓜果肉于研缽中勻漿，4 層紗布過濾得到汁液，用膠頭滴管滴取3 滴瓜液至手持折射儀檢測鏡上，讀取數值（%），即為厚皮甜瓜可溶性固形物含量。每個處理重復3 次。

1.2.7 厚皮甜瓜pH 的測定 根據陳存坤等[16]的方法進行改進，取傷口部位隨機10 g 厚皮甜瓜果肉于研缽中勻漿，4 層紗布過濾得到汁液，用pH 計測量pH，每個處理重復3 次。

1.2.8 拮抗菌在厚皮甜瓜表面定殖特性的測定 參照李建等[17]的方法進行改進，常溫貯藏厚皮甜瓜每隔5 d 取樣，低溫貯藏每隔10 d 取樣。取傷口處5 g厚皮甜瓜于無菌研缽中研磨，0.85%無菌生理鹽水稀釋104倍，取100 μL 稀釋液涂布于NA 板，32 ℃恒溫培養16 h 后平板計數拮抗菌BG-2。每個處理取3 個重復。

定殖量（CFU/g）=平板菌落數×104

1.3 數據處理

本研究每個處理做3 組平行，每組平行重復3 次，數據結果以平均值±標準差表示，采用Excel 2019 進行作圖，SPSS26 對實驗數據進行整理和分析，用方差分析的最小顯著性差異（LSD）進行差異顯著性比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏溫度下拮抗菌BG-2 對厚皮甜瓜腐爛率的影響

腐爛率是直觀表現厚皮甜瓜腐爛情況的指標，由圖1 可知，在25 ℃和4 ℃條件下，T2 處理最早腐爛，分別從第10 d 和第20 d 開始，T1 處理腐爛時間最晚且腐爛率顯著低于其他處理（P＜0.05）。這可能是由于拮抗菌BG-2 具有廣譜抗菌性，而對厚皮甜瓜消毒處理并不能殺滅所有病原菌，另一方面拮抗菌可以誘導厚皮甜瓜保護酶活性增強，提高抗病能力，延緩腐爛。井敏敏等[18]也通過將拮抗菌接種到貯藏期“臺農”芒果上得出拮抗菌可以抑制芒果果實軟化的結論。25 ℃條件下，第25 d 時，T2 的腐爛率為100%，顯著高于其他處理（P＜0.05），T1 的腐爛率為33.33%，T3 的腐爛率為55.56%，均低于CK，說明拮抗菌BG-2 可以有效控制病原菌的生長。4 ℃條件下，第50 d 時，T2 的腐爛率為100%，此時CK 和T3 的腐爛率均為56.00%，T1 的腐爛率為22.22%，顯著低于其他處理（P＜0.05），T1 處理的保鮮效果最好，且相同天數低溫4 種處理腐爛率均低于常溫，說明低溫可以延緩厚皮甜瓜腐爛，這與王紅林等[19]的研究結果相符。綜上表明拮抗菌BG-2 與低溫結合對延緩厚皮甜瓜腐爛效果最好。

圖1 拮抗菌對新疆厚皮甜瓜腐爛率的影響Fig.1 Effect of decay rate of antagonistic bacteria on Xinjiang muskmelon

2.2 不同貯藏溫度下拮抗菌BG-2 對厚皮甜瓜過氧化物酶活性的影響

植物保護酶在植物防御系統中發揮了重要作用[20-21]，其與某些病原菌的抗病性密切相關，在抵御病原菌入侵中發揮積極作用[22]。研究表明貯藏期水果體內H2O2含量隨貯藏時間延長而增加，過量H2O2會對植物細胞造成損傷，縮短貯藏期[19]。而POD 可以抑制果實體內H2O2的生成[23-26]，平衡活性氧的代謝，延緩果實的衰老[27-28]。由圖2 可知，在25 ℃和4 ℃條件下，4 種處理的過氧化物酶都呈現先上升后下降的趨勢。25 ℃和4 ℃下4 種處理均在第20 d 時酶活達到最高，且T3 處理顯著高于其他處理（P＜0.05），25 ℃下為5.45×103U/g，4 ℃下為3.06×103U/g。整個貯藏期間，T1 和T3 處理酶活始終高于CK 處理，這與寇莉萍等[29]的研究結果相似，這可能是由于厚皮甜瓜受到脅迫后體內POD 活性上升從而抵御病原菌的侵染，T1 處理酶活上升說明拮抗菌能誘導厚皮甜瓜中POD 的活性增高[30]，延長厚皮甜瓜貯藏期。

2.3 不同貯藏溫度下拮抗菌BG-2 對厚皮甜瓜多酚氧化酶活性的影響

PPO 在植物體活性氧系統調控中起著關鍵作用，能有效維持細胞內自由基的正常水平，同時PPO 可催化植物體內的酚類物質轉變為有毒的醌類物質和單寧，抑制病原菌的生長[31-32]。由圖3 可知，在25 ℃條件下，多酚氧化物酶呈現先上升后下降的趨勢，在4 ℃條件下，多酚氧化物酶呈現緩慢上升的趨勢。在25 ℃貯藏期間，T1 處理在第10 d 時酶活顯著高于其他處理（P＜0.05），為63.2 U/g。其余3 種處理在第15 d 時酶活達到最高，此時T3 處理酶活顯著高于其他處理（P＜0.05），為65.8 U/g，這可能是由于病原菌和拮抗菌結合具有協同作用[18]。在4 ℃貯藏期間，4 種處理中在第40 d 時酶活達到最高，T3 處理顯著高于其他處理（P＜0.05），為69 U/g，說明低溫能有效延長PPO 活性的上升期，與袁啟鳳等[33]研究結論相似。2 種貯藏溫度下拮抗菌處理酶活始終高于CK 處理，表明拮抗菌BG-2 和低溫結合處理厚皮甜瓜能有效減緩PPO 活性的降低，延長厚皮甜瓜貯藏期。

圖3 拮抗菌對新疆厚皮甜瓜多酚氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of antagonistic bacteria on PPO activity of Xinjiang muskmelon

2.4 不同貯藏溫度下拮抗菌BG-2 對厚皮甜瓜苯丙氨酸解氨酶活性的影響

PAL 是苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶[34]，合成的酚類、植保素、木質素和異黃酮類物質在抵御病原菌侵染植物體中起著重要作用[35]。由圖4 可知，在25 ℃和4 ℃條件下，苯丙氨酸解氨酶呈現先上升后下降的趨勢。在25 ℃貯藏期間，在第10 d 時酶活達到最高，4 種處理中T1 處理顯著高于其他處理（P＜0.05），為5.55 U/g，是初始值的1.60 倍，增長較明顯。在4 ℃貯藏期間，CK、T1、T3 在第20 d 時酶活達到最高，其中，T1 處理顯著高于其他2 個處理（P＜0.05），為5.72 U/g，是初始值的2.31 倍，增長明顯。40 d后T3 處理PAL 活性高于其他，可能是由于病原菌與拮抗菌結合在誘導PAL 酶活性中具有協同作用，T2 處理在整個貯藏期間雖然整體呈上升趨勢但增長較為平緩，且對比T1 和T3 處理始終處于較低水平。表明拮抗菌BG-2 處理厚皮甜瓜能有效減緩PAL 活性的降低從而延長厚皮甜瓜貯藏期。

圖4 拮抗菌對新疆厚皮甜瓜苯丙氨酸解氨酶活性的影響Fig.4 Effect of antagonistic bacteria on PAL activity of Xinjiang muskmelon

2.5 不同貯藏溫度下拮抗菌BG-2 對厚皮甜瓜可溶性固形物的影響

可溶性固形物是判斷果實是否成熟及影響果實風味的重要指標[36]。由圖5 可知，在25 ℃和4 ℃條件下，厚皮甜瓜的可溶性固形物含量呈現下降的趨勢。在整個貯藏期間，T1 處理和T3 處理可溶性固形物含量均顯著高于T2 處理（P＜0.05）。在25 ℃下，貯藏第25 d 時，T1 和T3 處理的可溶性固形物分別下降了17.25%和14.19%，T2 處理下降了60.59%。在4 ℃下，貯藏第50 d 時，各處理可溶性固形物含量達到最低，T1 和T3 處理顯著高于CK 和T2 處理（P＜0.05）。整個4 ℃貯藏過程T1 和T3 處理的可溶性固形物含量分別下降了15.72%和14.43%，這與趙魯寧等[37]的研究結果一致。果實中可溶性固形物中主要成分是糖類物質，而糖類物質是果實重要的風味物質和能量來源[38]。低溫貯藏能有效減緩果實可溶性固形物的下降，延長貯藏期[39]，與本研究中4 ℃下4 種處理可溶性固形物含量高于25 ℃相符。說明拮抗菌BG-2 與低溫結合能有效抑制厚皮甜瓜貯藏過程中可溶性固形物的下降，降低厚皮甜瓜風味和營養物質的損失。

圖5 拮抗菌對新疆厚皮甜瓜可溶性固形物的影響Fig.5 Effect of antagonistic bacteria on TSS content of Xinjiang muskmelon

2.6 不同貯藏溫度下拮抗菌BG-2 對厚皮甜瓜pH 的影響

由圖6 可知，在25 ℃和4 ℃條件下，厚皮甜瓜的pH 呈現下降的趨勢，這是由于在貯藏過程中厚皮甜瓜腐敗產生有機酸，導致pH 降低，CK 處理在第2 次取樣升高的趨勢可能是由于厚皮甜瓜的后熟消耗了有機酸[16]。在整個貯藏期間，T1 和T3 處理抑制pH 下降的能力優于其他2 種處理。在25 ℃下，貯藏第25 d 時，T1 和T3 處理pH 顯著高于CK 和T2處理（P＜0.05），整個貯藏過程T1 和T3 處理pH 分別下降了8.26%和15.09%，T2 處理下降了30.07%。在4 ℃下，貯藏第50 d 時，各處理pH 達到最低，T1和T3 處理顯著高于CK 和T2 處理（P＜0.05）。整個貯藏過程中，T1 和T3 處理pH 分別下降了5.28%和7.63%，T2 處理下降了21.93%。說明低溫對抑制厚皮甜瓜pH 下降效果更好，T1 和T3 處理不僅能抑制厚皮甜瓜前期貯藏過程中pH 的上升，還能延緩后期pH 的下降，且與低溫結合效果更好。

圖6 拮抗菌對新疆厚皮甜瓜pH 的影響Fig.6 Effect of antagonistic bacteria on pH of Xinjiang muskmelon

2.7 不同貯藏溫度下拮抗菌BG-2 在厚皮甜瓜表面的定殖特征

由圖7 可知，在25 ℃和4 ℃條件下，CK 和T2 處理拮抗菌為0，T1 和T3 處理拮抗菌在厚皮甜瓜表面的定殖規律都呈現了先上升后下降的趨勢。在25 ℃貯藏條件下，T1 和T3 處理拮抗菌定殖量在前20 d 呈現勻速上升的趨勢，在第20 d 達到最高，T1 為5.68×106CFU/g，T3 為4.63×106CFU/g。之后拮抗菌定殖量開始下降，在第25 d 時T1 保持在3.54×106CFU/g，T3 保持在3.45×106CFU/g。在4 ℃貯藏條件下，T1 和T3 處理拮抗菌定殖量在前30 d呈現上升趨勢，在第30 d 達到最高，T1 為1.41×106CFU/g，T3 為1.06×106CFU/g。之后拮抗菌定殖量開始下降，在第50 d 時T1 保持在1.06×106CFU/g，T3 保持在5.50×105CFU/g。說明拮抗菌BG-2 能在厚皮甜瓜表面穩定定殖且保持有效的定殖量。

圖7 拮抗菌在新疆厚皮甜瓜表面的定殖特性Fig.7 Colonization characteristics of antagonistic bacteria on the surface of Xinjiang muskmelon

3 結論

本研究初步探明了25 ℃和4 ℃下拮抗菌BG-2 對新疆厚皮甜瓜貯藏期保鮮效果和保護酶活性的影響。結果表明，2 種溫度貯藏期貯藏結束時，接種拮抗菌BG-2 的厚皮甜瓜T1 處理腐爛率顯著低于T2 處理（P＜0.05），對抑制厚皮甜瓜pH 和可溶性固形物含量的下降也顯著優于CK 和T2 處理（P＜0.05）。厚皮甜瓜保護酶POD 和PAL 活性均呈現先上升后下降的趨勢，PPO 活性在25 ℃下呈現先上升后下降的趨勢，在4 ℃下呈現緩慢上升的趨勢。接種拮抗菌BG-2 的厚皮甜瓜3 種酶活性顯著高于CK 和T2 處理（P＜0.05）。在25 ℃和4 ℃下貝萊斯芽孢桿菌BG-2 均能在厚皮甜瓜表面定殖，降低厚皮甜瓜腐爛率，延緩pH 和可溶性固形物的下降，延緩貯藏期厚皮甜瓜果實內POD、PPO 和PAL 活性下降，尤其與低溫相結合效果更好。