苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細胞的免疫調節和抗氧化作用

舒 翔，程 明，王 輝，朱紅英，譚樂和，顧文亮，朱科學,

（1.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所，海南萬寧 571533；2.國家知識產權局專利局專利審查協作江蘇中心，江蘇蘇州 215011；3.海南大學食品科學與工程學院，海南海口 570100；4.海南省特色熱帶作物適宜性加工與品質控制重點實驗室，海南萬寧 571533）

多糖是一類廣泛存在于植物、動物、海洋生物和微生物中的生物活性大分子物質。近年來，多糖的免疫調節功能受到廣泛關注。多糖可通過調節淋巴細胞亞群、激活免疫細胞、誘導炎性細胞因子和活化補體等多途徑發揮其免疫調節作用[1]。脾臟作為機體免疫應答的重要場所，含有大量的T 淋巴細胞和B 淋巴細胞，同時刺激或選擇性刺激T、B 細胞分裂增殖并促進相關細胞因子和抗體的分泌，直接反映機體的免疫調節能力。例如：蛹蟲草胞外多糖可提高免疫器官指數、促進T、B 細胞增殖和增加免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白M、腫瘤壞死因子-α、白介素-6、白介素-2 和干擾素-γ等的分泌，具有顯著的免疫調節效果[2]；庫爾勒香梨粗多糖能提高小鼠血清白介素-2 和干擾素-γ水平、增加實驗動物脾臟和胸腺等免疫器官指數，提高巨噬細胞的吞噬能力等[3]；苦瓜多糖可通過提升溶血素水平、提高巨噬細胞的吞噬能力和刺激小鼠脾臟淋巴細胞的增殖，提高免疫抑制小鼠的免疫功能[4]。

苦丁茶冬青（Ilex kudingchaC.J. Tseng）是冬青科冬青屬（Ilex aquifoliumL.）常綠喬木，其茶葉中富含多糖、多酚、多種必需氨基酸、維生素、微量元素等營養物質，具有抑菌、降血壓、降血糖、降血脂等藥用價值，且安全無毒[5-8]。許實波等[9]開展了苦丁茶水提物的毒理學研究，發現苦丁茶水提物的最大耐受量為168 g/kg，屬于無毒性級，服用安全。

苦丁茶冬青多糖是一類含α-吡喃糖環結構的高分子化合物，具有抑制特定異常細胞增殖和分化的功效，極具開發前景[10-11]。韋曉潔等[12]研究了超臨界CO2萃取參數對苦丁茶多糖得率的影響，并優化了其工藝條件。于淑池等[13]研究表明海南苦丁茶多糖可降低糖尿病小鼠的血糖，具有降血糖功效。課題組前期研究發現苦丁茶冬青萃取物具有調節血脂和高膽固醇血癥的功效[14]，苦丁茶冬青多糖具有較強的體外抗氧化活性等生物活性[11]。為進一步探索苦丁茶冬青多糖的免疫調節效果，本研究以苦丁茶冬青多糖為實驗材料，以小鼠脾臟淋巴細胞為研究對象，分析苦丁茶冬青多糖對體外培養小鼠脾臟淋巴細胞的增殖作用，并通過測定超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase, SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity, T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase, CAT）活力等抗氧化酶活性，檢測腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、干 擾 素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）等細胞因子的分泌水平，研究苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細胞的免疫調節和抗氧化作用，為海南苦丁茶資源的高值化開發和利用提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦丁茶冬青多糖 苦丁茶冬青原料由中國熱帶農業科學院香料飲料研究所（興隆熱帶植物園）提供，多糖制備參照團隊建立的方法[11]，通過熱水浸提和終濃度為20%、40%、60%和80%的四種不同濃度乙醇分級沉淀以制備苦丁茶冬青多糖，其主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸等組成，其相對分子質量為440.44 kDa，純度為87.59%[15]。

BALB/c 雄性小鼠 6 周，體重20～30 g，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；無水乙醇 西隴科學股份有限公司；臺盼藍染料 美國Sigma 公司；RPMI-1640 培養基 美國Gibco 公司；CCK-8 試劑盒、SOD、T-AOC、GSHPx、CAT 和MDA 檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；NO 檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；TNF-α、IFN-γ和IL-1β細胞因子ELISA 檢測試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；其他化學試劑均為分析純。

3110 系列二氧化碳培養箱 Thermo Fisher Scientific 公司；奧林巴斯CKX41 倒置顯微鏡 Olympus公司；Varioskan Flash 全波長多功能酶標儀 Thermo Fisher Scientific 公司；SW-CJ-2FD 凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司；3K15 通用型臺式高速冷凍離心機 Sigma 公司；ZDX-35B 壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；Milli-Q50 超純水系統Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠脾臟淋巴細胞的制備 小鼠脫椎處理，75%醫用酒精浸泡后取其脾臟，參照文獻[16]的方法制備脾淋巴細胞懸液，將收集的脾淋巴細胞用RPMI-1640 培養基，37 ℃、5% CO2無菌條件培養2 h，收集未貼壁的細胞懸液即為脾臟淋巴細胞。采用臺盼藍細胞活性染料對細胞進行計數，利用活細胞數大于95%的脾臟淋巴細胞懸液開展研究和分析。

1.2.2 小鼠脾臟淋巴細胞增殖的檢測 參照文獻[16]的方法將收集到的脾臟淋巴細胞懸液調整濃度至5×106個/mL，以190 μL/孔接種至96 孔板，再添加10 μL 不同濃度的苦丁茶冬青多糖溶液至RPMI-1640 培養基，分別調節最終作用濃度為20、40、80和160 μg/mL，設計一組僅加入10 μL RPMI-1640的培養基為空白對照組，每組設6 個復孔，試驗平行3 次，37 ℃、5% CO2條件下預孵育48 h。按照CCK-8試劑盒操作說明，每孔加入20 μL CCK-8 溶液繼續孵育4 h。在450 nm 處通過全波長多功能酶標儀檢測吸光度，測定苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細胞增殖的影響。

1.2.3 抗氧化活性的測定 按1.2.2 節方法培養后離心收集細胞，按照SOD、T-AOC、GSH-Px、CAT 和MDA 檢測試劑盒說明測定，并計算SOD、T-AOC、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶活力以及MDA 含量。

1.2.4 NO 含量的測定 按照NO 檢測試劑盒的操作說明，540 nm 處測定吸光度，繪制標準曲線（y=0.0095x+0.0482，R2=0.9963)，分析苦丁茶冬青多糖對脾臟淋巴細胞NO 含量的影響。

1.2.5 細胞因子分泌水平的測定 參考Li 等[17]實驗方法，吸取收集細胞培養上清液，參照ELISA 試劑盒說明書，繪制標準曲線（TNF-α：y=0.001x+0.0769，R2=0.9973；IFN-γ：y=0.0012x+0.2183，R2=0.9879；IL-1β：y=0.0033x+0.1259，R2=0.9989），分析小鼠脾臟淋巴細胞上清液中TNF-α、IFN-γ和IL-1β細胞因子的分泌水平。

1.3 數據處理

數據統計通過SPSS Statistics 17.0 分析軟件進行，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用ANOVA 方差分析，結果以±S 表示。P＜0.05時，表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細胞增殖的影響

如圖1 所示，與空白對照組（0.31）相比，20 μg/mL的低濃度苦丁茶冬青多糖處理后小鼠脾臟淋巴細胞溶液的吸光度為0.34，作用效果無顯著性差異（P＞0.05）；當濃度為40 μg/mL 時，吸光度值為0.36，與空白對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）；在80和160 μg/mL 濃度時，吸光度值分別為0.38 和0.41，與對照組相比，脾臟淋巴細胞的增殖作用具有極顯著差異（P＜0.01）。結果表明，苦丁茶冬青多糖可能直接作用于脾臟淋巴細胞，促進細胞的增殖功能，提高機體的免疫力。

圖1 苦丁茶冬青多糖對體外培養脾臟淋巴細胞增殖的影響Fig.1 Effect of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J. Tseng on the proliferation of spleen lymphocyte in vitro

CCK-8 法是一種最常用的淋巴細胞增殖檢測方法[18]。李芳宇等[19]采用CCK-8 法檢測細胞的增殖情況，發現人參根提取物能顯著增強小鼠脾臟淋巴細胞的增殖能力。龐敏等[20]利用CCK-8 法探討術芩總多糖對免疫抑制小鼠脾臟淋巴細胞增殖的影響，結果顯示濃度為0.1 μg/mL 的術芩總多糖作用小鼠脾臟淋巴細胞12 h，細胞的增殖能力最強。孫延斌等[21]發現苦丁茶可促進免疫功能低下小鼠抗體生成水平和巨噬細胞的吞噬能力，調節機體免疫功能。本研究表明，苦丁茶冬青多糖能顯著提高小鼠脾臟淋巴細胞的體外增殖能力（P＜0.05），推斷其可能通過增強小鼠淋巴細胞增殖能力以發揮其免疫調節作用。

2.2 苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細胞抗氧化能力的影響

由圖2 可知，空白對照組SOD、T-AOC、GSH-Px和CAT 活性分別為0.99 U/mg 蛋白、0.21 mmol/mg蛋白、208.06 mU/mg 蛋白和416.83 U/mg 蛋白。苦丁茶冬青多糖濃度在20～160 μg/mL 范圍內，SOD、T-AOC、GSH-Px 和CAT 活力隨濃度的增加而升高，當濃度為80 和160 μg/mL 時，與對照組相比，抗氧化酶活力極顯著增強（P＜0.01）；其中，當濃度為160 μg/mL 時，SOD、T-AOC、GSH-Px 和CAT 活性分別提高至4.54 U/mg 蛋白、1.06 mmol/mg 蛋白、799.01 mU/mg 蛋白和806.85 U/mg 蛋白。

圖2 苦丁茶冬青多糖對體外培養脾臟淋巴細胞抗氧化酶活力的影響Fig.2 Effect of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J. Tseng on antioxidant enzyme activities in spleen lymphocytes in vitro

圖3結果顯示，空白對照組MDA 含量為43.29 μmol/mg 蛋白，苦丁茶冬青多糖濃度為20 μg/mL時，MDA 含量下降至30.76 μmol/mg 蛋白，具有顯著降低效果（P＜0.05）；在40、80 和160 μg/mL 濃度時，MDA 含量分別降到18.67、13.44 和13.022 μmol/mg蛋白，具有極顯著降低效果（P＜0.01）。

圖3 苦丁茶冬青多糖對體外培養脾臟淋巴細胞抗氧化產物MDA 含量的影響Fig.3 Effect of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J. Tseng on MDA production in spleen lymphocytes in vitro

機體抗氧化系統與免疫系統密不可分，當機體氧化自由基的產生大于自身自由基的清除時，就會造成氧化損傷，誘導機體保護性免疫反應。SOD、GSH-Px 和CAT 等是機體防御氧化損傷的關鍵酶，在維持體內的氧化與自由基動態平衡中發揮著重要作用[22]。丙二醛（MDA）是衡量機體自由基代謝程度的重要指標[23]。華巖[24]的研究結果顯示，補充黃精多糖的運動組MDA 含量明顯降低，而SOD、GSHPx 活性相較于運動組明顯升高，表明黃精多糖能改善受損細胞膜功能，降低大強度運動導致的脂質過氧化損傷。團隊前期研究發現苦丁茶多糖具有較強的DPPH 自由基和OH-自由基清除能力，本研究發現，苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細胞SOD、T-AOC、GSH-Px 和CAT 活力具有顯著增強作用，并顯著降低MDA 含量，該結果表明苦丁茶冬青多糖能夠提高抗氧化酶活性、抑制細胞的氧化損傷水平，調節細胞的免疫功能。

2.3 苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細胞NO 分泌水平的影響

如圖4 所示，苦丁茶冬青多糖能刺激脾臟淋巴細胞分泌NO，與空白對照組相比，苦丁茶冬青多糖濃度為20、40、80、160 μg/mL 時可分別提高小鼠脾臟淋巴細胞NO 含量1.38 倍、1.62 倍、2.31 倍和4.04倍。濃度高于40 μg/mL 時，NO 分泌效果呈顯著增強趨勢（P＜0.05）。

圖4 苦丁茶冬青多糖對體外培養脾臟淋巴細胞NO 分泌水平的影響Fig.4 Effect of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J. Tseng on NO production in spleen lymphocytes in vitro

NO 被認為是一種細胞神經遞質，能發揮非特異性免疫反應，可調節多種免疫功能，包括T 淋巴細胞、巨噬細胞和NK 細胞以及炎性細胞的生長和凋亡等[25]。研究表明，金線蓮多糖[26]、蕨麻多糖[27]和金櫻子多糖[28]可促進小鼠脾臟淋巴細胞分泌NO；山豆根多糖能誘導淋巴細胞產生NO，并通過NO 信號轉導通路發揮免疫調節功能[29]。本研究結果表明苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細胞分泌NO 具有較強的促進作用，有助于增強其免疫調節能力。

2.4 苦丁茶冬青多糖對小鼠脾臟淋巴細胞分泌細胞因子的影響

如表1 所示，空白對照組TNF-α、IFN-γ和IL-1β的含量分別為475.75、41.85 和42.31 pg/mL。經苦丁茶冬青多糖處理后，脾臟淋巴細胞TNF-α、IFN-γ和IL-1β等炎性細胞因子分泌水平均呈現增加趨勢，且呈濃度依賴性。在濃度為20 μg/mL 時，苦丁茶冬青多糖對細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β均無顯著的促進作用（P＞0.05）；在濃度為160 μg/mL 時，苦丁茶冬青多糖對TNF-α、IFN-γ和IL-1β的分泌水平極顯著增加（P＜0.01），分別達到610.91、129.33 和84.16 pg/mL。推斷苦丁茶冬青多糖能夠促進脾臟淋巴細胞的增殖與分化，進而通過促進脾臟淋巴細胞分泌TNF-α、IFN-γ和IL-1β以發揮免疫增強作用。脾臟淋巴細胞中含大量的T 細胞，T 細胞被活化后會分泌TNF-α、IFN-γ和IL-1β等多種細胞因子，而當這些細胞因子分泌量上升時，亦促進T 細胞激活[30-31]。T 細胞主要分為CD4＋和CD8＋亞群，其中，CD4＋細胞又分為Th1 及Th2 亞群，Th1 細胞主要分泌IFN-γ，Th2 細胞主要分泌IL-1β等細胞因子，參與細胞免疫調節[32]。大量研究發現多糖具有調節細胞因子分泌的功能，如太子參參須多糖[33]能夠促進免疫功能低下小鼠分泌IL-2 和IFN-γ；懸鉤子木多糖[34]可以促進淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α；金針菇子實體多糖[35]可以提高IL-1β、IL-6 和TNF-α的分泌水平。本研究結果表明，苦丁茶冬青多糖可能通過調節Th1/Th2 平衡，促進小鼠脾臟淋巴細胞TNF-α、IFN-γ和IL-1β的分泌，通過誘導細胞因子的分泌發揮其免疫調節作用。

表1 苦丁茶冬青多糖對體外培養脾臟淋巴細胞分泌細胞因子的影響Table 1 Effect of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J. Tseng on cytokine secretion in spleen lymphocytes in vitro

3 結論

本文通過分析苦丁茶冬青多糖對體外培養小鼠脾臟淋巴細胞增殖、抗氧化和細胞因子分泌的影響，脾臟淋巴細胞的增殖分別為0.34、0.36、0.38 和0.41；濃度為160 μg/mL 時，SOD、T-AOC、GSH-Px 和CAT活性分別提高至4.54 U/mg 蛋白、1.06 mmol/mg蛋白、799.01 mU/mg 蛋白和806.85 U/mg 蛋白，MDA含量降至13.022 μmol/mg 蛋白；TNF-α、IFN-γ和IL-1β的含量分別從475.75、41.85 和42.31 pg/mL增加到610.91、129.33 和84.16 pg/mL。研究表明苦丁茶冬青多糖能夠提高小鼠脾臟淋巴細胞免疫活性，其作用機制可能是通過促進淋巴細胞增殖、增強細胞抗氧化能力及誘導炎性細胞因子分泌等途徑，發揮其免疫調節作用。研究結果可為苦丁茶冬青及同類資源的營養健康產品開發和應用奠定理論基礎，在未來研究中，將從免疫調節通路和分子機制進行深入研究和探討。