龜肉蛋白肽延緩果蠅衰老的作用及機制研究

吳俊豪，王 晶，KHO SETHYKUN，覃 川，王倩倩，余 鵬，馮鳳琴,

（1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江杭州 310058；2.浙江大學寧波研究院，浙江寧波 315100；3.余姚市冷江鱉業(yè)有限公司，浙江寧波 315400）

衰老，通俗來說是指生物體的生長發(fā)育經(jīng)過成熟期后，隨著年齡的繼續(xù)增長，生物個體的器官功能性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性等發(fā)生不可避免地下降或衰退，從而趨向死亡的過程與狀態(tài)[1-2]。許多慢性疾病，如風濕免疫病、心腦血管疾病和中樞神經(jīng)病等，都與衰老有著密切的聯(lián)系[3-4]。衰老是受基因與環(huán)境等多重因素影響的復雜表型，其具體機理目前尚無定論，而自由基學說是目前衰老研究領域較有說服力的理論學說[3]。該學說認為，機體的自由基水平會隨著有氧代謝增加，過剩的自由基會引發(fā)脂質(zhì)的過氧化，破壞細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，造成組織的不可逆損傷，最終導致機體的衰老[5-7]。隨著社會發(fā)展和科技進步，人們對于延緩衰老的需求也在增加，開發(fā)天然的抗氧化功能性食品具有重要的現(xiàn)實意義。過往研究表明，抗氧化肽不僅具有優(yōu)良的自由基清除能力，而且穩(wěn)定性好、無免疫反應[8-10]。Chen 等[11]酶解深紅鯛魚魚鱗得到的抗氧化肽能有效延長果蠅的平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡時間。Ding 等[12]通過酶解和純化從鹿茸中提取的抗氧化四肽Trp-Asp-Val-Lys 能有效抑制斑馬魚體內(nèi)活性氧的生成。Tonolo 等[13]研究證實，四種牛奶衍生肽在細胞內(nèi)的抗氧化作用主要通過激活Keap1-Nrf2 信號通路完成。由此可見，生物活性肽的抗衰老功能研究潛力巨大，開發(fā)新型抗氧化肽是食品與醫(yī)藥領域值得關注的重點方向。

烏龜肉在我國有著悠久的食用歷史，傳統(tǒng)中醫(yī)認為烏龜肉有潤肺滋陰、舒通心氣的作用，兼具了營養(yǎng)和藥用價值[14-15]。石揚等[14]以中華草龜為原料，通過酶解和葡聚糖凝膠柱層析得到了高純度的抗腫瘤活性肽。楊昭等[15]利用堿性蛋白酶和復合蛋白酶對中華草龜、中華花龜和鱷龜肉進行水解，結果表明龜肉酶解液具有較高的自由基清除率，推測其具有抗氧化作用。現(xiàn)階段關于龜肉蛋白肽的研究主要集中在抗腫瘤活性和體外抗氧化活性方面，但是并未涉及動物壽命實驗、體內(nèi)抗氧化活性以及基因表達等相關方向。壽命是評價抗衰老作用最為直接的觀測指標[16]，而果蠅有著生活史短、易于繁殖、含有人類75%已知疾病的同源基因等優(yōu)良特性，是抗衰老研究中常用的動物模型[17]。本研究以果蠅作為模型，用含不同劑量龜肉蛋白肽的培養(yǎng)基喂養(yǎng)，通過生存實驗以及體內(nèi)SOD、CAT 活性和MDA 含量的測定來評價龜肉蛋白肽的抗衰老功能，并通過測定抗氧化相關基因Sod1、Sod2和Cat以及壽命相關基因mth、Rpn11的表達來探究龜肉蛋白肽的抗衰老機制，期望為開發(fā)龜肉蛋白肽抗衰老功能食品提供相關的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮烏龜肉 余姚市冷江鱉業(yè)有限公司；Canton-S 黑腹果蠅 浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心；動物蛋白酶A1（200000 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；細胞色c、抑肽酶、桿菌肽、甘氨-甘氨-色氨-精氨酸和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸標準品（純度≥95%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、丙二醛試劑盒 南京建成生物工程研究所；FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒、RNA simple 總RNA 提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

Legend Micro 高速臺式離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RE-3000A 型真空旋轉蒸發(fā)器鄭州南北儀器設備有限公司；Ultimate3000 高效液相色譜儀 美國Dionex 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 龜肉蛋白肽的制備 參考張永進等[18]的方法稍作修改，將新鮮烏龜肉洗凈切塊、去除脂肪，蒸煮3 h 后勻漿，加入動物蛋白酶A1，50 ℃恒溫酶解6 h后取出，立即置于沸水浴中滅酶20 min，然后過濾并離心，取上清液蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得到龜肉蛋白肽粉末。

1.2.2 龜肉蛋白肽的營養(yǎng)成分分析 參照GB 5009-2016《食品安全國家標準》中相應的方法測定龜肉蛋白肽的水分、灰分、蛋白質(zhì)、酸溶蛋白質(zhì)等含量。

1.2.3 龜肉蛋白肽分子質(zhì)量及分布測定 參照GB 5009-2016《食品安全國家標準》，利用高效液相色譜法進行測定。樣品處理方法：精確稱取0.02 g 龜肉蛋白肽樣品，定容到10 mL 并混勻，使用微孔濾膜（0.22 μm）過濾后進樣檢測。

色譜條件：TSK gel 2000 SWXL 分析柱（300 nm×7.8 mm），柱溫30 ℃，流動相按照乙腈:水:三氟乙酸=450:550:1（v/v/v）的比例配制，進樣體積20 μL，流速0.5 mL/min，于220 nm 檢測波長下運行30 min。分別以高純度標準品甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（189 Da）、甘氨-甘氨-色氨-精氨酸（451 Da）、桿菌肽（1450 Da）、抑肽酶（6512 Da）以及細胞色c（12400 Da）的保留時間對分子量的對數(shù)作標準曲線，得到y(tǒng)=-0.2187x+6.7329（R2=0.9901），進一步計算得到龜肉蛋白肽的分子質(zhì)量，單位為Da。

1.2.4 龜肉蛋白肽的氨基酸組成測定

1.2.4.1 樣品前處理 參考史晉源等[19]方法，取20 mg龜肉蛋白肽粉末置于15 mL COD 消解瓶，滴加1 mL鹽酸溶液（6 mol/L），同時充入適量氮氣，立刻密封消解瓶，150 ℃恒溫加熱1.5 h，隨后冷卻至室溫。取各氨基酸對照品10 mg，超聲溶解于0.1 mol/L 鹽酸溶液，定容至25 mL 得到氨基酸標準溶液。

1.2.4.2 氨基酸衍生化反應 流動相A 為乙酸鈉溶液（0.1 mol/L，pH6.5）；流動相B 為經(jīng)過超聲脫氣的80%乙腈溶液；按乙醇:水:三乙胺=2:2:1（v/v/v）的比例配制再干燥液；按異硫氰酸苯酯:乙醇:三乙胺:水=1:7:1:1（v/v/v/v）的比例配制衍生溶液；按流動相A:流動相B=9:1（v/v）的比例配制樣品稀釋液。將不同量的氨基酸標準液（1、5、10、15、20 μL）分別與6 μL 水解液加入1.5 mL 離心管中，依次加入10 μL 再干燥液和20 μL 衍生溶液，渦旋混勻，期間多次使用氮氣干燥，依次加入50 μL 流動相B 和450 μL 流動相A，渦旋混勻，經(jīng)膜過濾后進樣上機檢測。

1.2.4.3 高效液相色譜的測定條件 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫38 ℃，進樣體積10 μL，流速1 mL/min，于254 nm 波長下運行。以乙酸鈉溶液（0.1 mol/L，pH6.5）作為流動相A，經(jīng)過超聲脫氣的80%乙腈溶液作為流動相B，梯度洗脫時間見表1。以各氨基酸的峰面積為橫坐標，氨基酸標液的質(zhì)量濃度為縱坐標，分別進行線性回歸分析，得到各氨基酸的標準曲線，用于龜肉蛋白肽樣品中各氨基酸的定性和定量分析。

表1 梯度洗脫時間Table 1 Gradient elution time

1.2.5 果蠅培養(yǎng)基的制備 基礎培養(yǎng)基的配方為105 g 玉米粉、40 g 酵母粉、75 g 白砂糖、7.5 g 瓊脂、10 mL 丙酸及1000 mL 純凈水。樣品培養(yǎng)基配制方法和劑量選擇參考史晉源等[19]的方法，在基礎培養(yǎng)基中加入不同劑量龜肉蛋白肽，將實驗組培養(yǎng)基配成對照組（空白）、低劑量組（0.2%）、中劑量組（0.4%）和高劑量組（0.8%），按40 g/瓶分裝于玻璃瓶中用于果蠅擴種，按5 g/管分裝于玻璃試管中用于果蠅的壽命分析。

1.2.6 果蠅擴種 果蠅的飼養(yǎng)環(huán)境為溫度25 ℃，濕度60%～70%，晝夜12 h 交替。將果蠅從保種瓶轉移到新的擴種瓶中，通入CO2使其全部麻醉，在果蠅挑取板上區(qū)分雌雄性別，按照雌:雄=40:20 轉入含基礎培養(yǎng)基的瓶中進行交配產(chǎn)卵。5 d 后放出初代果蠅，培養(yǎng)約10 d，羽化的果蠅即為親代果蠅。將親代果蠅按照雌雄比40:20 接入實驗飼料組，第5 d 放飛親代果蠅，約第10 d 飛出的果蠅即為接種果蠅。

1.2.7 果蠅生存試驗 將24 h 內(nèi)羽化的果蠅轉入空瓶，通入CO2麻醉以區(qū)分雌雄性別。各試驗組試管飼養(yǎng)30 只雌性或雄性果蠅，重復10 次。每隔3 d 給各試管果蠅換新培養(yǎng)基，觀測各試管果蠅的存活數(shù)，計算果蠅實驗常用的壽命指標[20]（半數(shù)死亡時間、平均壽命、平均最高壽命、平均壽命延長率以及存活率），同時繪制雌雄果蠅的生存曲線。各項壽命指標的計算公式如下：

1.2.8 果蠅抗氧化活性實驗 參考Xin 等[21]和張明等[22]的方法，分別于20 d 果蠅青年期和40 d 果蠅老年期時，使用CO2麻醉果蠅并加生理鹽水制成10%組織勻漿，置于低溫離心機中離心15 min（4 ℃，8000 r/min），取上清液，使用試劑盒分別測定每組雌、雄果蠅的總SOD、CAT 活性和MDA 含量。

1.2.9 果蠅基因表達實驗 參考張曉寒等[23]的實驗方法稍作修改，選取基礎培養(yǎng)基為空白對照組，選取果蠅生存實驗和抗氧化活性實驗的最佳劑量，即0.8%龜肉蛋白肽為實驗劑量，選擇生存實驗延壽效果較好的雌性果蠅為實驗對象，重復上述果蠅培養(yǎng)和擴種實驗，在第21 d 時，參照相關試劑盒說明進行果蠅總RNA 提取和cDNA 合成。以cDNA 為模板，利用熒光實時PCR 檢測其抗氧化相關基因Sod1、Sod2和Cat，以及壽命調(diào)節(jié)相關基因mth、Rpn11的mRNA表達水平。引物序列見表2，以rp49為內(nèi)參基因，基因表達以PCR 的2-ΔΔCt值表示。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究使用SPSS 22.0 軟件分析統(tǒng)計學差異，各項數(shù)據(jù)以平均值±標準差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。使用Graphpad Prism 9 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 龜肉蛋白肽營養(yǎng)成分分析

龜肉蛋白肽的部分成分含量見表3。龜肉的蛋白酶解產(chǎn)物中含有大量蛋白質(zhì)，占總營養(yǎng)成分的86.49%，其中85.98%為酸溶蛋白，而且水解度高達32%。酸溶蛋白含游離氨基酸和小肽，具有較低的分子量，可以很好地溶于酸性溶液中[24]，說明龜肉蛋白肽在體內(nèi)容易被消化吸收。

表3 龜肉蛋白肽的營養(yǎng)成分Table 3 Nutrient content of PTPDP

2.2 龜肉蛋白肽分子質(zhì)量分布

蛋白酶解產(chǎn)物中，分子量相對較小的肽鏈片段往往會表現(xiàn)出更強的抗氧化活性[25]。申彩虹[26]通過酶解法制備得到了海參寡肽（130～2000 Da）和海參多肽（2000～5000 Da），前者的抗氧化能力顯著強于后者。另一研究也顯示，鱸魚肉水解所得肽段中抗氧化活性最強的肽段同時相對分子質(zhì)量也最小[27]。龜肉蛋白肽分子量分布情況見表4，其中分子量為180～500 Da 的肽段含量最大，占60.39%。龜肉蛋白肽中94.71%的肽段為1000 Da 以下的小肽，因此推測其具有潛在的抗氧化功能。

表4 龜肉蛋白肽分子量分布Table 4 Molecular weight distribution of PTPDP

2.3 龜肉蛋白肽氨基酸組成

過往研究表明，甘氨酸和谷氨酸是內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽的組成氨基酸[28]，谷氨酸還參與紅細胞的生產(chǎn)，具有抵抗記憶力減退、改善腦細胞等抗衰老作用[29]；精氨酸與細胞增殖、信號傳導等多種生物學功能相關，可改善多種衰老相關疾病[19,30]；支鏈氨基酸，包括纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸在內(nèi)，可以有效延長實驗小鼠的各項壽命指標，具有抗氧化、延緩衰老的作用[31]；此外，丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸也被廣泛認為具有抗氧化功效[19]。龜肉蛋白肽由16 種氨基酸組成（見表5），上述10 種具有抗氧化、抗衰老功能的氨基酸共占80.30%，其中甘氨酸（15.79%）、谷氨酸（14.70%）和脯氨酸（9.73%）的相對含量最高。因此推測龜肉蛋白肽可能具有抗氧化、延緩衰老的作用。

2.4 龜肉蛋白肽對果蠅壽命的影響

壽命是評價抗衰老作用的生物實驗中最直接的觀測指標，果蠅實驗中，通常用半數(shù)死亡時間、平均壽命、平均最高壽命和平均壽命延長率作為觀測指標[16]。不同劑量龜肉蛋白肽對雌、雄果蠅壽命的影響如表6 所示，除低劑量組果蠅的半數(shù)死亡時間外，各實驗組果蠅的各項壽命指標均較對照組有所上升，且對壽命的延長效果隨喂食龜肉蛋白肽的含量增加而升高。對于雄性果蠅，高劑量組的平均壽命極顯著增加（P＜0.01），平均最高壽命顯著增加（P＜0.05）。對于雌性果蠅，低劑量組的平均最高壽命顯著增加（P＜0.05），中劑量組的平均最高壽命極顯著增加（P＜0.01），高劑量組半數(shù)死亡時間、平均壽命和平均最高壽命均極顯著增加（P＜0.01）。綜上所述，0.8%龜肉蛋白肽培養(yǎng)基喂養(yǎng)果蠅對其壽命的延長效果最佳。

表6 不同劑量龜肉蛋白肽對雌、雄果蠅壽命的影響Table 6 Effects of different doses of PTPDP on the lifespan of female and male D. melanogaster

果蠅的生存曲線見圖1，20 d 之前，各實驗組相比空白對照無顯著性差異（P＞0.05），20 d 后高劑量組雌、雄果蠅的存活率均逐漸高于對照組。各劑量龜肉蛋白肽喂養(yǎng)下，雌雄果蠅存活率歸零的時間均較對照組變晚，其中0.8%龜肉蛋白肽組最晚。總體來說，龜肉蛋白肽可以增加雌雄果蠅的存活率，其中0.8%龜肉蛋白肽的效果最好。

圖1 雌性（A）和雄性（B）果蠅的生存曲線Fig.1 The survival curves of female (A) and male (B) D.melanogaster

本實驗中，龜肉蛋白肽對雌性果蠅的延壽效果好于雄性：喂食0.8%龜肉蛋白肽的雌性果蠅半數(shù)死亡時間較對照組極顯著延長（P＜0.01），而雄性果蠅則無顯著性差異（P＞0.05）；0.2%、0.4%龜肉蛋白肽喂養(yǎng)的雌性果蠅平均最高壽命分別顯著延長（P＜0.05）、極顯著延長（P＜0.01），而同組雄性果蠅不呈顯著性差異（P＞0.05）；0.8%龜肉蛋白肽組雌性果蠅的平均最高壽命較對照組極顯著延長（P＜0.01），而同組雄性果蠅并未呈現(xiàn)極顯著差異（0.01＜P＜0.05）。以往同類研究表明[19,32]，由于對受試藥物的適應性與敏感性不同，雌、雄果蠅的壽命實驗結果會存在差異，因此可推測本實驗中雌性果蠅對龜肉蛋白肽更為敏感。

2.5 龜肉蛋白肽對果蠅體內(nèi)抗氧化活性的影響

抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）可以清除機體的多余活性氧，從而實現(xiàn)體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡[32-34]，二者的活性是評價機體自由基清除能力的間接指標。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是多不飽和脂肪酸等脂質(zhì)在氧自由基作用下發(fā)生氧化反應的最終產(chǎn)物，具有細胞毒性，通常會隨年齡的增大而增多[35]，其含量是間接反應脂質(zhì)氧化程度的重要指標[36]。

如表7 所示，隨著果蠅年齡的增長，40 d 時SOD活性較20 d 普遍降低。0.4%龜肉蛋白肽組雌性果蠅20 d 和40 d 的SOD 活性均較對照組顯著增強（P＜0.05），同組雄性果蠅20 d 的SOD 活性顯著增強（P＜0.05），但40 d 時無顯著差異（P＞0.05）。0.8%龜肉蛋白肽組雌、雄果蠅20 d 和40 d 的SOD 活性均較對照組顯著增強（P＜0.05），其中雌性果蠅20 d 時極顯著增強（P＜0.01）。綜上所述，龜肉蛋白肽能有效提高果蠅SOD 活性，最佳劑量為0.8%，且對雌性果蠅SOD 活性的提升效果好于雄性。

表7 不同劑量龜肉蛋白肽對果蠅體內(nèi)SOD 活性的影響Table 7 Effects of different doses of PTPDP on SOD activity of D. melanogaster

如表8 所示，0.2%和0.4%龜肉蛋白肽喂養(yǎng)雌性果蠅20 d 和40 d 的CAT 活性較對照組分別顯著增加（P＜0.05）、極顯著增加（P＜0.01），而同劑量喂養(yǎng)的雄性果蠅CAT 活性則沒有顯著增強（P＞0.05）。0.8%龜肉蛋白肽組雌性果蠅20 d 和40 d 的CAT活性極顯著增加（P＜0.01），雄性果蠅20 d 時顯著增加（P＜0.05），40 d 時極顯著增加（P＜0.01）。綜上所述，龜肉蛋白肽能有效提高果蠅CAT 活性，最佳劑量為0.8%，對雌性果蠅作用效果較好。

表8 不同劑量龜肉蛋白肽對雌、雄果蠅體內(nèi)CAT活性的影響Table 8 Effects of different doses of PTPDP on CAT activity of female and male D. melanogaster

如表9 所示，與空白對照相比，0.2%龜肉蛋白肽飼養(yǎng)的果蠅體內(nèi)MDA 含量無顯著性變化（P＞0.05）。0.4%龜肉蛋白肽組雄果蠅40 d 的MDA 含量與對照組相比顯著減少（P＜0.05）。喂食0.8%龜肉蛋白肽的雌、雄果蠅在20 d 和40 d 的體內(nèi)MDA 含量均顯著減少（P＜0.05）。綜上所述，0.8%龜肉蛋白肽能有效降低果蠅體內(nèi)MDA 含量。

表9 不同劑量龜肉蛋白肽對雌、雄果蠅體內(nèi)MDA含量的影響Table 9 Effects of different doses of PTPDP on MDA content of female and male D. melanogaster

2.6 龜肉蛋白肽對果蠅基因表達的影響

Sod1、Sod2和Cat基因的表達分別影響超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，是評價生物體抗氧化能力的常用指標[4,37]。mth基因的表達量被認為與壽命呈負相關性，研究表明mth發(fā)生突變會使成年果蠅的平均壽命會延長35%[38]。Rpn11基因的表達可以減少衰老相關的泛素化蛋白在體內(nèi)積累，從而延長果蠅壽命[39]。

如圖2 所示，與對照組相比，使用0.8%龜肉蛋白肽培養(yǎng)基的實驗組雌性果蠅體內(nèi)的抗氧化相關基因Sod1、Sod2和Cat的表達量均有上升，其中Sod1和Sod2基因的表達量顯著上升（P＜0.05），Cat基因的表達量極顯著上升（P＜0.01）。壽命相關基因mth基因的表達量極顯著下降（P＜0.01），而Rpn11的表達量極顯著上升（P＜0.01）。綜上所述，0.8%龜肉蛋白肽通過上調(diào)抗氧化相關基因Sod1、Sod2、Cat和壽命相關基因Rpn11的表達，以及下調(diào)壽命相關基因mth的表達來延長果蠅壽命。

圖2 0.8% PTPDP 喂養(yǎng)的雌性果蠅基因表達Fig.2 Gene expressions of female D. melanogaster fed by 0.8% PTPDP

3 結論

本研究酶解烏龜肉得到大量1000 Da 以下的小分子肽段，龜肉蛋白肽富含甘氨酸、谷氨酸和脯氨酸等多種具有抗氧化活性的氨基酸。0.2%、0.4%和0.8%的龜肉蛋白肽都可以有效延長果蠅壽命，提高果蠅體內(nèi)多項抗氧化活性指標，其中喂食0.8%龜肉蛋白肽的作用效果最佳。同等劑量下，相較雄性果蠅，雌性果蠅對龜肉蛋白肽更為敏感。0.8%的龜肉蛋白肽通過上調(diào)抗氧化相關基因Sod1、Sod2、Cat和壽命相關基因Rpn11的表達，以及下調(diào)壽命相關基因mth的表達來延長果蠅壽命。綜上所述，本研究的結果表明龜肉蛋白肽具有潛在的抗衰老功效，為后續(xù)相關醫(yī)藥產(chǎn)品或保健食品的開發(fā)與應用提供了一定的參考。由于衰老的機制較為復雜，且果蠅與人類在許多層面上差異較大，后續(xù)研究可以使用小鼠等哺乳動物作為模型，為深度探究龜肉蛋白肽的抗衰老功能和作用機制，提供更詳實的實驗依據(jù)。