略陽烏雞湯對D-半乳糖致衰老小鼠不同組織的保護作用

劉 茜，趙浩名，王 令，王珊珊，路宏朝，袁國強，張 濤,

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723000；2.漢中職業技術學院醫學技術學院，陜西漢中 723000；3.陜西百味園網絡科技有限公司，陜西略陽 724300）

衰老是機體在發育成熟后，各器官功能漸進性退化的過程[1-2]，在這一過程中多伴有各種老年疾病的發生，如高血壓、糖尿病等。雖然衰老不可逆，但通過飲食、藥物干預等途徑可以延緩衰老的進程[3-5]。隨著我國人口老齡化加速發展，專家學者以傳統中醫藥理論為基礎結合現代生化、藥理等技術發現中藥材何首烏、靈芝、黃連，天然小分子化合物如雷帕霉素、亞精胺以及多酚類物質等都具有良好的抗衰老作用[6]。但衰老機理非常復雜，是機體多方面異常改變的綜合結果，且個體之間存在一定差異。老年人僅通過服用某一種抗衰老藥物，很難達到預期效果，甚至會對機體造成損傷。傳統醫學和現代醫學一致認為運用食物特性進行食療和養生，可達到滋補身體、延年益壽的作用[7]。

據《本草綱目》記載，烏雞具有滋陰清熱、補肝益腎之功效，適用于所有虛癥?，F代醫學研究表明，烏雞中的黑色素是烏雞發揮抗衰防老的物質基礎之一，黑色素具有清除自由基、抗輻射之功效，其作用效果與黑色素含量呈正相關[8-9]。與其他雞種相比，烏雞肉質中的氨基酸種類齊全、含量豐富[10]。氨基酸除了為機體提供必要的營養支持外，還可調節生理機能。例如，支鏈氨基酸有改善肝功能[11]、緩解疲勞之功效[12]；組氨酸、甘氨酸等具有較好的抗氧化能力[13-15]，可有效清除機體在代謝過程中產生的自由基；精氨酸可調節機體免疫力[16]、促進繁殖、延緩衰老等[17]。馮金秋等[18]研究表明烏雞肽可通過調節機體免疫應答、改善胸腺結構，提高小鼠免疫功能。

雞湯在熬制過程中，由于其采用的加工方式不同，導致其營養物質含量存在一定的差異[19-20]。略陽烏雞生長于陜西省略陽縣黑河流域，距今已有1600 多年的歷史，其肉質細嫩、鮮美，營養豐富，具有“六端烏”（即烏冠、烏腿、烏喙、烏趾、烏舌、烏皮）的特征，是集藥食一體的地方珍稀家禽[21-22]。陜西百味園網絡科技有限公司采用高溫蒸煮和快速梯度降溫技術，研發并生產了略陽烏雞湯系列產品，本研究通過測定略陽烏雞湯中礦物質元素和17 種氨基酸含量，分析評價略陽烏雞湯的主要營養保健價值。并以D-半乳糖致衰老小鼠為模型，開展略陽烏雞湯抗衰老作用的研究與評價，為其產品的深度開發和推廣提供科學的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級昆明種小鼠 購于西安交通大學實驗動物中心（動物生產合格證號：SYXK（陜）2020-005），6～8 周齡，體重（31±1.7）g；實驗鼠繁殖型專用糧 購于沈陽市前民飼料有限公司；SOD、MDA、GSHPx 及T-AOC 檢測試劑盒 購于南京建成生物工程研究所；SA-β-GAL 染色試劑盒 購于上海碧云天生物科技有限公司；略陽烏雞湯 購于陜西百味園網絡科技有限公司，生產許可證編號為：SC10942011 408299；蘇木素、伊紅染色劑 購于珠海貝索生物技術有限公司。

DM1000 型光學顯微鏡、DM1950 型冰凍切片機 德國Leica；Centrifuge5424 型常溫離心機、Research plus 型微量移液槍 德國Eppendorf；ZMS-130型全自動雪花制冰機 常熟市雪科電器有限公司；ICPMS-2030 型電感耦合等離子體質譜儀 ICP MS；AA-6880 型原子吸收光譜儀 SHIMADZU；S2100型氨基酸分析儀 SYKAM；Infinite 200pro 型酶標儀 Tecan。

1.2 實驗方法

1.2.1 略陽烏雞湯的熬制 略陽烏雞湯選用優質略陽烏雞的雞肉和雞骨等為原料，通過原料清洗、整理預煮、速冷分揀、封口、殺菌、冷卻后儲存。在制作過程中嚴格按照GB 14881-2013《食品安全國家標準食品生產通用衛生規范》、中國質量萬里行促進會《自熱方便食品標準》團體標準發布的公告（標準公告[2020]第2 號）等規范生產運營。熬制后的成品營養成分穩定且均一，每100 g 湯中含能量223 KJ、蛋白質4.1 g、脂肪1.3 g、碳水化合物6.2 g。

1.2.2 略陽烏雞湯中礦物質元素含量、氨基酸含量測定 略陽烏雞湯中礦物質元素含量、氨基酸含量測定由西安國聯質量檢測技術股份有限公司完成。鈣的測定參照食品安全國家標準GB 5009.92-2016第四法；鐵的測定參照食品安全國家標準GB 5009.90-2016 第三法；鋅的測定參照食品安全國家標準GB 5009.14-2017 第三法；硒的測定參照食品安全國家標準GB 5009.93-2017 第三法；鉛的測定參照食品安全國家標準GB 5009.12-2017 第二法；總砷的測定參照食品安全國家標準GB 5009.11-2014 第二法；總汞的測定參考食品安全國家標準GB 5009.17-2014第一法；氨基酸的測定參考GB 5009.124-2016。

1.2.3 實驗動物分組、模型建立 將30 只SPF 級昆明系小鼠適應性飼養一周后，隨機分為空白對照組、衰老模型組、略陽烏雞湯干預組。于每日18 點，空白對照組腹腔注射生理鹽水（120 mg/kg），其余各組注射D-半乳糖（120 mg/kg）；衰老模型組和空白對照組灌胃生理鹽水500 mg/（kg·d），略陽烏雞湯干預組灌胃略陽烏雞湯500 mg/（kg·d）。連續干預10 周，每周稱量體重并注意觀察小鼠毛色、精神狀態、飲食、飲水等情況。本實驗方案通過陜西理工大學生物科學與工程學院動物倫理要求審查，無違背動物倫理道德的現象。

1.2.4 血清樣本采集 小鼠禁食24 h，眼眶采血，血液靜置1 h 后，3500 r/min，4 ℃，離心10 min，吸取上清，-20 ℃保存備用。

1.2.5 組織勻漿制備 稱取100 mg 組織放入1 mL裂解液中，冰上勻漿，12000 r/min，4 ℃，離心15 min，吸取上清液，上清液置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.6 睪丸、腎臟、肝臟組織的HE 染色 取小鼠的睪丸、腎臟及肝臟等臟器用組織固定液進行固定。經脫水、透明、石蠟包埋切片，蘇木素/伊紅染色，封片之后光鏡觀察。

1.2.7 睪丸、腎臟、肝臟組織的SA-β-GAL 染色 取小鼠睪丸、腎臟、肝臟組織做冰凍切片，按照SA-β-GAL 染色試劑盒說明書進行染色。

1.2.8 小鼠生化指標測定 小鼠用摘眼球取血法，參照試劑說明書分別測定血清、睪丸、肝臟、腎臟中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）的活力以及丙二醛（MDA）的含量和總抗氧化能力（T-AOC）。

1.3 統計學處理

所有計量資料采用平均值±標準差（mean±SD）表示，組間比較用單因素方差分析，用SPSS 16.0 進行數據處理，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 略陽烏雞湯中微量元素含量及組成

由表1 可知，在略陽烏雞湯中未檢測到鉛、砷、汞，符合食品安全國家標準保健食品對污染物的限量要求。與普通骨湯相比，略陽烏雞湯中鈣、鋅含量較高。

表1 略陽烏雞湯中礦物質種類及含量Table 1 Mineral types and contents in Lüeyang black-bone chickens soup

2.2 略陽烏雞湯中氨基酸含量及組成

略陽烏雞湯中17 種氨基酸的含量和組成如表2所示，略陽烏雞湯中共檢測到了15 種氨基酸（蛋氨酸和酪氨酸未達到檢測上限），其中包括8 種必需氨基酸，7 種非必需氨基酸，分別占氨基酸總量的25.5%、74.5%。亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸3 種支鏈氨基酸占氨基酸總量8.16%。在所檢測到的氨基酸中含量較高的是甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸，含量較低的是異亮氨酸、組氨酸。

表2 略陽烏雞湯中氨基酸種類及含量Table 2 Types and contents of amino acids in Lüeyang black-bone chickens soup

2.3 略陽烏雞湯對小鼠體重的影響

由表3 可知，在建模前4 周各組小鼠的體重均隨時間呈上升趨勢，衰老模型組小鼠無精打采，有成群聚集的傾向，食物攝入量減少，體重上升緩慢。與空白對照組相比，衰老模型組小鼠體重在第8 周時出現極顯著下降（P＜0.01）。略陽烏雞湯組小鼠精神狀態較好，攝食量增加，體重一直保持增長狀態，與衰老模型組相比，在第8 周時體重顯著增長（P＜0.01）。表明略陽烏雞湯可以緩解D-半乳糖對衰老小鼠生長的影響。

表3 略陽烏雞湯對小鼠體重的影響（ ±S，n=10）Table 3 Influence of Lüeyang black-bone chickens soup on the body weight of mice（ ±S，n=10）

表3 略陽烏雞湯對小鼠體重的影響（ ±S，n=10）Table 3 Influence of Lüeyang black-bone chickens soup on the body weight of mice（ ±S，n=10）

注：*表示與空白對照組相比差異顯著（P＜0.05），**表示與空白對照組相比差異極顯著（P＜0.01）；#表示與衰老模型組相比差異顯著（P＜0.05），##表示與衰老模型組相比差異極顯著（P＜0.01）；表4～表7同。

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2.4 小鼠重要臟器組織病理觀察

2.4.1 睪丸組織病理學觀察 由圖1 可知，空白對照組小鼠曲細精管飽滿，生精細胞排列規則，管內富含精子（圖1a）。與空白對照組相比，衰老模型組小鼠曲細精管結構異常，出現了大量的空泡樣變，生精細胞層數減少，管內精子減少（圖1b）。經略陽烏雞湯干預后，小鼠曲細精管結構大致正常，生精細胞排列整齊，空泡樣變程度明顯降低（圖1c）。

圖1 小鼠睪丸組織病理學切片（100×）Fig.1 Histopathological section of mouse testis (100×)

2.4.2 小鼠腎臟組織病理學觀察 略陽烏雞湯對小鼠腎臟結構的影響如圖2 所示，空白對照組腎小球結構正常，腎小管類圓形，排列整齊（圖2a）。衰老模型組，腎小管結構被破壞，排列不規整，腎間質出現了纖維化（圖2b）。經略陽烏雞湯干預后，腎小管結構基本正常，細胞排列整齊，核質界限清晰，與空白對照組較為相似（圖2c）。這表明略陽烏雞湯能有效緩解D-半乳糖注射引起的腎臟衰老。

圖2 小鼠腎臟組織病理學切片（400×）Fig.2 Histopathological section of mouse kidney (400×)

2.4.3 小鼠肝臟組織病理觀察 由圖3 可知，空白對照組小鼠肝細胞形態規則、大小均一，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝小葉結構清晰（圖3a）。衰老模型組小鼠肝細胞胞質可見明顯疏松、腫脹，細胞界限模糊，排列紊亂，肝小葉結構異常。（圖3b）。略陽烏雞湯組小鼠肝細胞大小、染色均勻，排列整齊、緊密，肝小葉結構未見明顯異常（圖3c）。

圖3 小鼠肝臟組織病理學切片（400×）Fig.3 Histopathological section of mouse liver (400×)

2.5 小鼠重要臟器SA-β-GAL 染色結果

2.5.1 睪丸組織SA-β-GAL 染色結果 SA-β-GAL是普遍認可的衰老標志物[24]，在pH 為6 時衰老細胞被染成藍色，細胞衰老程度與著色深淺和著色面積呈正相關。由圖4 可知，衰老模型組小鼠睪丸中藍染細胞密度增加，藍染顆粒較粗大（圖4b）。略陽烏雞湯干預后，睪丸組織中的藍染細胞密度明顯減少，藍染顆粒較細小（圖4c）。這表明略陽烏雞湯能顯著改善D-半乳糖對小鼠睪丸組織造成的損傷，延緩睪丸組織的衰老。

圖4 小鼠睪丸組織SA-β-GAL 染色（100×）Fig.4 SA-β-Gal staining of mouse testis (100×)

2.5.2 小鼠腎臟組織SA-β-GAL 染色結果 由圖5可知，衰老模型組小鼠腎臟中藍染細胞增多，且著色面積較深（圖5b）。略陽烏雞湯干預后，藍染細胞數量減少，著色較淺，與空白對照組較為相似（圖5c）。這表明略陽烏雞湯能保護腎臟，延緩腎臟衰老。

圖5 小鼠腎臟組織SA-β-GAL 染色（400×）Fig.5 SA-β-Gal staining of mouse kidney tissue (400×)

2.5.3 小鼠肝臟組織SA-β-GAL 染色結果 由圖6可知，衰老模型組小鼠肝臟中藍染細胞著色較深，藍染顆粒較粗大（圖6b）。經略陽烏雞湯干預后，藍染細胞明顯減少，著色較淺（圖6c），這表明略陽烏雞湯可拮抗D-半乳糖對肝臟造成的損傷，延緩肝臟衰老。

圖6 小鼠肝臟組織SA-β-GAL 染色（400×）Fig.6 SA-β-Gal staining of mouse liver tissue (400×)

2.6 略陽烏雞湯對衰老小鼠抗氧化水平的影響

2.6.1 略陽烏雞湯對小鼠血清、睪丸、腎臟和肝臟中SOD 活力的影響 由表4 可知，與空白對照組相比，衰老模型組血清、腎臟和肝臟中SOD 的活力極顯著降低（P＜0.01），睪丸中SOD 的活力顯著下降（P＜0.05），這表明衰老模型組小鼠腎臟、肝臟、睪丸抗氧化能力下降。與衰老模型組相比，略陽烏雞湯組小鼠血清、腎臟和肝臟SOD 的活力極顯著上升（P＜0.01），睪丸中SOD 的活力顯著上升（P＜0.05）。這表明略陽烏雞湯可提高機體SOD 活力，增強機體對氧化損傷的抵抗能力。

表4 略陽烏雞湯對小鼠多種器官組織中SOD 活性的影響（ ±S, n=10）Table 4 Effect of Lüeyang black-bone chickens on SOD activity in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

表4 略陽烏雞湯對小鼠多種器官組織中SOD 活性的影響（ ±S, n=10）Table 4 Effect of Lüeyang black-bone chickens on SOD activity in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

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2.6.2 略陽烏雞湯對小鼠血清、睪丸、腎臟和肝臟中GSH-Px 活力的影響 由表5 可見，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠血清、睪丸、腎臟和肝臟中GSH-Px 活力極顯著降低（P＜0.01）。與衰老模型組相比，略陽烏雞湯組小鼠血清、睪丸、腎臟和肝臟中GSH-Px 的活力極顯著升高（P＜0.01）。上述結果表明略陽烏雞湯對GSH-Px 活力的升高有促進作用，有助于提高機體的氧化應激能力。

表5 略陽烏雞湯對小鼠多種器官組織中GSH-Px 活力的影響（ ±S, n=10）Table 5 Effect of Lüeyang black-bone chickens on GSH-Px activity in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

表5 略陽烏雞湯對小鼠多種器官組織中GSH-Px 活力的影響（ ±S, n=10）Table 5 Effect of Lüeyang black-bone chickens on GSH-Px activity in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

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2.6.3 略陽烏雞湯對小鼠血清、睪丸、腎臟和肝臟中MDA 含量的影響 由表6 可見，與空白對照組相比，衰老模型組血清、睪丸、腎臟、肝臟中的MDA 水平極顯著上升（P＜0.01）；與衰老模型組相比，略陽烏雞湯組小鼠血清、睪丸、腎臟、肝臟中MDA 水平顯著下降（P＜0.01），上述結果表明，衰老模型小鼠機體內氧化損傷較嚴重，略陽烏雞湯干預后能顯著增加機體抗氧化能力，減少MDA 在機體內的積累。

表6 略陽烏雞湯對小鼠多種器官組織中MDA 水平的影響（ ±S, n=10）Table 6 Effect of Lüeyang black-bone chickens on MDA level in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

表6 略陽烏雞湯對小鼠多種器官組織中MDA 水平的影響（ ±S, n=10）Table 6 Effect of Lüeyang black-bone chickens on MDA level in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

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2.6.4 略陽烏雞湯對小鼠血清、睪丸、腎臟和肝臟中T-AOC 的影響 由表7 可知，與空白對照組相比，衰老模型組小鼠血清、睪丸、腎臟、肝臟中的T-AOC極顯著降低（P＜0.01）。與衰老模型組相比，略陽烏雞湯組小鼠血清、睪丸、腎臟和肝臟中T-AOC 極顯著上升（P＜0.01）。上述實驗結果說明略陽烏雞湯能增強機體總抗氧化能力，清除過多的自由基，進而使組織細胞免受氧化損傷。

表7 略陽烏雞湯對小鼠多種器官組織中T-AOC 的影響（ ±S, n=10）Table 7 Effect of Lüeyang black-bone chickens on T-AOC in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

表7 略陽烏雞湯對小鼠多種器官組織中T-AOC 的影響（ ±S, n=10）Table 7 Effect of Lüeyang black-bone chickens on T-AOC in various organs and tissues of mice ( ±S, n=10)

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3 討論與結論

略陽烏雞湯是漢中當地傳統美食，因味道鮮美，營養豐富，而深受人們喜愛。通過對略陽烏雞湯中氨基酸、礦物質元素的組成和含量進行分析，對略陽烏雞湯的安全性和營養價值進行科學評價。食品中重金屬污染是影響食品安全的重要因素之一，長期攝入金屬污染的食品對人體有極大危害。在略陽烏雞湯中未檢測到鉛、汞、砷，符合國家食品安全中對重金屬污染物的限量要求。略陽烏雞湯中鈣、鋅、硒的含量分別為1040±2.59 mg/kg、3.25±0.65 mg/kg、8.72±0.53 μg/kg。根據中國居民膳食營養素參考攝入標準，老年人鈣的推薦攝入量為1000 mg/d，經常食用略陽烏雞湯有利于及時補充機體流失的鈣質。此外，略陽烏雞湯中鋅含量明顯高于骨湯，這可能與烏雞肉中鋅元素含量較高有關[25]。鋅作為動物必需的微量元素之一，可抑制NADPH 氧化酶活性，減少自由基的產生，適量的補鋅可提高SOD 的活力，有助于維持體內氧化還原系統平衡[26-27]。略陽烏雞湯中總氨基酸的含量為1234 mg/100 g，這與黃佳露等[28]報道的采用智能燃氣灶燉制的烏雞湯中氨基酸總量62.35 mg/100 mL 有所不同?？赡苁怯捎诎傥秷@網絡有限公司采用的加工工藝優于家庭熬制工藝，使略陽烏雞肉中的蛋白質不斷被分解，氨基酸溶解到湯汁中。略陽烏雞湯中含量較高的氨基酸有甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸，含量較低的是組氨酸、異亮氨酸，這與雁骨膠原多肽的氨基酸組成較為相似。先前的研究[29]表明雁骨膠原多肽能有效清除超氧陰離子自由基和羥基自由基，且雁骨膠原多肽的抗氧化活性與甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸等氨基酸有關，而在略陽烏雞湯中此類氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸）含量達41.17%。因此，推測略陽烏雞湯具有抗氧化、抗衰老之功效。

在生理狀態下，機體的抗氧化系統，如谷胱甘肽基團和超氧化物歧化酶系統，會及時清除機體在代謝過程中產生的ROS 以維持機體氧化還原平衡[30]。隨著年齡的增長，抗氧化酶活力下降，對ROS 的清除能力減退，使ROS 在機體堆積。自由基進入細胞后與膜磷脂等大分子反應形成MDA，MDA 是脂質氧化最終產物，間接反映組織氧化的損傷程度[31]。D-半乳糖進入機體后可導致糖代謝紊亂，蛋白質、脂肪代謝異常，使機體發生退行性變，同時多項生化指標發生異變，如SOD、GSH-Px 等活性降低和MDA水平升高[32]。因此，SOD、GSH-Px、MDA 也常作為衰老標志物。在本實驗中，衰老模型小鼠體內的SOD、GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高，表明造模成功。經略陽烏雞湯干預后，衰老小鼠體內SOD 和GSH-Px 的活性顯著上升，T-AOC 顯著升高，MDA水平顯著下降。該結論與蔡華珍等[33]報道的烏雞黑色素能提高D-半乳糖致衰小鼠抗氧化酶活力較為一致。衰老不僅會使機體出現生化指標改變，還會導致臟器結構改變以及功能退化[34]。HE 染色結果顯示，衰老模型組小鼠的睪丸、腎臟和肝臟結構都出現了不同程度的損傷，略陽烏雞湯處理組小鼠的睪丸、腎臟和肝臟形態結構和正常組織較為接近，細胞大小、著色較均一，核質界限清晰。這表明略陽烏雞湯可提高機體抗氧化酶活力，降低氧化損傷程度，對D-半乳糖引起的組織損傷具有一定的修復作用。

本研究從小鼠的外貌體征、行為活動，結合抗氧化指標、重要器官的組織形態差異以及SA-β-GAL染色等方面系統分析了略陽烏雞湯抗氧化能力和對組織器官的保護作用，充分證明略陽烏雞湯具有良好的抗衰老作用，但是其作用機制還需進一步研究。