銀杏肽對高脂膳食誘導的高脂血癥小鼠的降脂作用

鄭 義，李詩穎，李 闖，梁一凡，糜心怡，陳 琳

（1.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇徐州 221018；2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇徐州 221018）

高脂膳食是高脂血癥的重要誘因，而高脂血癥，尤其是高膽固醇血癥，是動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病最常見的危險因素之一。近年來，營養和健康日益受到重視，我國居民膳食營養狀況總體得到改善，膳食因素對心血管疾病死亡率的歸因比例有所下降，但膳食結構不合理的狀況仍在延續，目前心血管病仍是我國居民首位死亡原因[1]；心血管病危險因素的流行水平較為嚴峻，需進一步加強心血管病的防治工作[2]。大劑量長期服用他汀類降脂藥會導致高血糖、肝酶升高、神經損傷、肌肉疼痛等副作用。研究表明來源于橄欖、大豆、糙米、燕麥、蕎麥、花生、淡水哈、卵形鯧鲹魚、沙丁魚等動植物蛋白的生物活性肽具有較好的輔助降血脂作用[3]。

銀杏肽為銀杏蛋白經過單酶或復酶水解后分離所得的低聚肽，已被證實具有抗氧化、降血糖和肝保護等作用。張煥新等[4]研究表明銀杏肽對鄰苯三酚自氧化和亞油酸氧化具有較強的抑制活性，對超氧陰離子和羥基自由基具有較好的清除活性。賈韶千等[5-6]制備得到了相對分子量為452.21 的銀杏肽，在質量濃度為1.0 mg/mL 時，該肽對DPPH 和羥基自由基的清除率均在80%以上。Ma 等[7]純化和鑒定了3 種相對分子質量小于1000 的ACE 抑制肽，分子對接結果表明銀杏肽主要通過氨基酸殘基與ACE 活性位點結合而抑制ACE 活性。Sun 等[8]純化得到了相對分子質量小于10000 且具有較好α-葡萄糖苷酶抑制活性的銀杏肽，在此基礎之上開發了銀杏肽功能飲料。鄭義等[9]通過急性酒精性肝損傷小鼠模型考察了銀杏肽的保肝作用，結果表明銀杏肽能降低酒精性肝損傷小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）水平，抑制促炎細胞因子表達水平，提高肝臟抗氧化酶活性，降低肝臟丙二醛（malondialdehyde，MDA）和蛋白質羰基水平。銀杏肽能降低小鼠血清TG 和TC 水平，提示銀杏肽具有潛在的降脂作用，有關銀杏肽降脂作用的研究未見報道。

本研究采用高脂膳食誘導的高脂血癥小鼠模型，基于血脂和炎性因子水平、脂肪消化率、動脈粥樣硬化和冠心病等并發癥的發病風險、氧化應激狀態等方面，評價銀杏肽對高脂血癥小鼠的降脂作用，旨在為銀杏肽的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮銀杏 江蘇省邳州市；ICR 小鼠（20±2 g）生產許可證號SCXY （魯） 20190003，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；基礎飼料和高脂飼料：基礎飼料中蛋白、脂肪和碳水化合物的供能比分別為20.54%、12.79%和66.67%；高脂飼料中蛋白、脂肪和碳水化合物的供能比分別為19.54%、47.18%和33.29%江蘇省協同生物醫藥生物工程有限公司；風味蛋白酶（1.5×104U/g） 丹麥諾維信公司；TG、TC、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、MDA 試劑盒 南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒 美國R&D 公司；辛伐他汀 國藥準字H20010053，江蘇聯環藥業股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

BILON92-IID 超聲波細胞破碎儀 上海比朗儀器有限公司；Labscale 小型切向流超濾系統 美國Millipore 公司；723C 可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；LGJ-18A 冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠；TGL-16G 型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；Synergy2 多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏肽的制備 采用超聲輔助堿提酸沉法制備銀杏蛋白[10]，考馬斯亮藍法測得純度為83.42%。按液料比15:1 mL/g 將銀杏蛋白與去離子水配成懸液，沸水浴10 min 滅內源性酶；調pH7.7，加入1.2%風味蛋白酶，55 ℃振蕩酶解3 h；酶解后沸水浴10 min 滅酶，8000 r/min 離心20 min；將上清液通過截留相對分子質量為1 kDa 的超濾膜，收集濾液，冷凍干燥，得銀杏肽，高效凝膠排阻色譜法測得銀杏肽相對分子質量分布范圍為300～1000。

1.2.2 動物分組與處理 動物實驗研究遵循相關國家標準，符合本院實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準，得到該委員會批準。60 只ICR 小鼠經適應性飼養后，10 只正常組小鼠飼喂基礎飼料，其余50 只小鼠飼喂高脂飼料，連續6 周。造模后，高脂血癥小鼠按體質量隨機分為5 組：高脂模型組、陽性對照組和三組銀杏肽組。低、中和高劑量銀杏肽組每天分別灌胃100、200 和400 mg/kg 銀杏肽，連續4 周。陽性對照組每天灌胃10 mg/kg 辛伐他汀；正常組和高脂模型組每天灌胃等量去離子水。灌胃期間，各組小鼠自由飲水和攝食基礎飼料。每周記錄小鼠體質量和攝食量。

1.2.3 小鼠肝臟指數的測定 脂肪表觀消化率測定后，頸椎脫臼法處死小鼠，稱量小鼠體重。無菌摘取肝臟，稱量小鼠肝臟質量，根據肝臟質量與體質量比，計算肝臟指數。

1.2.4 脂肪表觀消化率的測定 參考田許等[11]報道的方法測定各組小鼠脂肪表觀消化率。末次灌胃24 h后，將小鼠置于代謝籠中，經3 d 適應性飼喂后，收集每只小鼠72 h 內的糞便。稱取1 g 小鼠糞便（或飼料），60 ℃烘干至恒重，記錄質量。將烘干后的小鼠糞便（或飼料）置于索氏提取器中，采用石油醚抽提6 h，將抽提后的殘渣烘干至恒重，記錄質量。兩次恒重時的質量差即為小鼠糞便（或飼料）中粗脂肪質量。脂肪表觀消化率計算公式如下：

1.2.5 血清生化指標的測定 小鼠眼眶后靜脈叢采血，室溫靜置1 h，3500 r/min 離心10 min，收集上清液即為血清，按照試劑盒說明書測定TG、TC、LDLC、HDL-C、IL-6 和TNF-α水平。采用Ghoneim 等[12]報道的方法，計算動脈粥樣硬化指數（atherogenic index，AI）和冠心指數（coronary heart index，CHI）。

1.2.6 肝臟抗氧化能力的測定 稱取1 g 小鼠肝臟，置于組織勻漿器中，加入9 倍體積生理鹽水，制成10%（m/V）肝組織勻漿，3000 r/min 離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書測定T-AOC、T-SOD和MDA 水平。

1.3 數據處理

采用SPSS 24.0 軟件進行數據統計與分析，結果以平均值±標準差表示，組間比較采用Dunnett-t 檢驗。

2 結果與分析

2.1 對小鼠體質量和肝臟指數的影響

高脂膳食通常會導致肥胖，體質量超過標準值的20%，可定義為肥胖[13]。圖1 為銀杏肽對高脂血癥小鼠體質量和肝臟指數的影響。造模后，高脂模型組小鼠體質量顯著高于正常組（P＜0.05），模型組小鼠的體質量比正常組高出26.8%，表明飼喂高脂飼料造成了小鼠肥胖。中、高劑量銀杏肽組小鼠體質量顯著（P＜0.05）低于模型組，提示銀杏肽干預降低了高脂血癥小鼠體質量。

圖1 銀杏肽對高脂血癥小鼠體質量和肝臟指數的影響Fig.1 Effects of Ginkgo biloba peptides on the body weight and liver index in hyperlipidemia mice

高脂模型組小鼠的肝臟指數為正常組的1.33倍，肝臟指數顯著高于正常組（P＜0.05），提示高脂膳食造成了脂肪在肝臟的堆積，導致肝臟腫大。與高脂模型組相比，低、中、高劑量銀杏肽組小鼠肝臟指數均顯著下降（P＜0.05），提示銀杏肽干預緩解了高脂膳食導致的小鼠肝臟腫大，但低、中、高劑量組間差異不顯著（P＞0.05）。陽性對照辛伐他汀也能顯著降低小鼠肝臟指數（P＜0.05），但對體質量無顯著影響（P＞0.05）。高劑量銀杏肽組小鼠肝臟指數與陽性對照組間無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 對小鼠攝食量和脂肪表觀消化率的影響

攝食量可反映小鼠的食欲情況；脂肪表觀消化率為脂肪被小鼠攝入前的含量和在糞便中含量的差值，可反映小鼠對脂肪的消化能力。圖2 為銀杏肽對高脂血癥小鼠攝食量和脂肪表觀消化率的影響。模型組小鼠攝食量顯著高于正常組（P＜0.05），提示高脂膳食提高了小鼠的食欲。低、中、高劑量銀杏肽組小鼠的攝食量與高脂模型組無統計學差異（P＞0.05），表明銀杏肽對小鼠食欲無顯著影響。模型組小鼠脂肪表觀消化率顯著低于正常組（P＜0.05），表明高脂膳食中脂肪含量過高，超出了小鼠的消化能力。中、高劑量銀杏肽組小鼠脂肪表觀消化率分別比高脂模型組提高9.37%、13.21%，均顯著高于高脂模型組（P＜0.05）。陽性對照辛伐他汀也顯著提高了高脂血癥小鼠對脂肪的消化能力（P＜0.05）。中、高劑量銀杏肽組小鼠攝食量和脂肪表觀消化率與陽性對照組間無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 對小鼠血清TG 和TC 水平的影響

血清TG 和TC 是重要的血脂常規測定指標。圖3 為銀杏肽對高脂血癥小鼠血清TG 和TC 水平的影響。高脂模型組小鼠血清TG 和TC 水平分別是正常小鼠的1.9 和1.7 倍，顯著高于正常組（P＜0.05）。與高脂模型組相比，低、中、高劑量銀杏肽組小鼠TG 水平分別降低了12.38%、28.22%、43.56%，TC水平分別降低了15.67%、26.49%、40.67%，銀杏肽組小鼠血清TG 和TC 水平均顯著低于模型組（P＜0.05），高劑量銀杏肽組小鼠血清TG 和TC 水平與正常組無顯著性差異（P＞0.05），表明銀杏肽干預改善了高脂血癥小鼠的血脂水平。與高脂模型組相比，辛伐他汀也能顯著降低小鼠血清TG 和TC 水平（P＜0.05）。高劑量銀杏肽組小鼠TG 和TC 水平與陽性對照組間無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 銀杏肽對高脂血癥小鼠血清TG 和TC 水平的影響Fig.3 Effects of Ginkgo biloba peptides on the serum TG and TC levels in hyperlipidemia mice

2.4 對小鼠血清LDL-C 和HDL-C 水平的影響

LDL-C 可將膽固醇運輸至肝外組織，LDL-C 水平與心血管疾病的發病率及病變程度正相關；HDLC 可將膽固醇從肝外組織轉運到肝臟進行代謝，HDL-C 水平與心血管病的患病風險負相關。銀杏肽對高脂血癥小鼠血清LDL-C 和HDL-C 水平的影響見圖4。高脂模型組小鼠血清LDL-C 水平是正常組的2.7 倍，顯著高于正常組（P＜0.05）；HDL-C 水平比正常組降低了40.4%，顯著低于正常組（P＜0.05）。與模型組相比，銀杏肽組小鼠血清LDL-C 水平顯著降低，HDL-C 水平顯著升高（P＜0.05）；高劑量銀杏肽組小鼠血清HDL-C 可恢復至正常水平（P＞0.05）。與模型組相比，辛伐他汀也能顯著降低小鼠血清LDLC，升高HDL-C 水平（P＜0.05）。高劑量銀杏肽組小鼠LDL-C 水平顯著高于陽性對照組（P＜0.05），HDLC 水平與陽性對照組間無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 銀杏肽對高脂血癥小鼠血清LDL-C 和HDL-C水平的影響Fig.4 Effects of Ginkgo biloba peptides on the serum LDL-C and HDL-C levels in hyperlipidemia mice

2.5 對小鼠AI 和CHI 的影響

AI 和CHI 可分別反映動脈粥樣硬化和冠心病的發病風險。圖5 為銀杏肽對高脂血癥小鼠AI 和CHI 的影響。高脂模型組小鼠AI 和CHI 分別是正常組的29.7 和2.8 倍，顯著高于正常組（P＜0.05），表明高脂膳食提高了小鼠動脈粥樣硬化和冠心病的發病風險。與高脂模型組相比，低、中、高劑量銀杏肽組小鼠AI 分別降低了45.67%、74.04%、94.23%，CHI分別降低了30.84%、50.00%、63.63%，均顯著低于模型組，且組間差異顯著（P＜0.05），表明銀杏肽在一定程度上降低了高脂血癥小鼠的動脈粥樣硬化和冠心病的發病風險。與高脂模型組相比，辛伐他汀也能顯著降低小鼠AI 和CHI（P＜0.05）。高劑量銀杏肽組小鼠AI 顯著高于陽性對照組（P＜0.05），而CHI 與陽性對照組間無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 銀杏肽對高脂血癥小鼠AI 和CHI 的影響Fig.5 Effects of Ginkgo biloba peptides on the AI and CHI in hyperlipidemia mice

2.6 對小鼠血清IL-6 和TNF-α 水平的影響

IL-6 和TNF-α在炎性損傷過程中扮演著重要角色。圖6 為銀杏肽對高脂血癥小鼠血清IL-6 和TNF-α水平的影響。高脂模型組小鼠血清IL-6 和TNF-α水平顯著高于正常組（P＜0.05），提示高脂膳食導致小鼠發生了炎性損傷。與高脂模型組相比，低、中、高劑量銀杏肽組小鼠血清IL-6 水平分別降低了13.29%、21.02%、27.46%，TNF-α水平分別降低了15.12%、30.40%、43.52%，均顯著低于模型組（P＜0.05），表明銀杏肽可緩解高脂血癥小鼠的炎性損傷。與高脂模型組相比，辛伐他汀也能顯著降低小鼠血清IL-6 和TNF-α水平（P＜0.05）。高劑量銀杏肽組小鼠IL-6 和TNF-α水平與陽性對照組間無顯著差異（P＞0.05）。

圖6 銀杏肽對高脂血癥小鼠血清IL-6 和TNF-α水平的影響Fig.6 Effects of Ginkgo biloba peptides on serum IL-6 and TNF-α levels in hyperlipidemia mice

2.7 對小鼠肝臟抗氧化能力的影響

T-AOC 反映機體的總抗氧化能力，T-SOD 在機體氧化與抗氧化平衡中扮演著重要的角色。銀杏肽對高脂血癥小鼠肝臟T-AOC 和T-SOD 活性的影響如圖7 所示。高脂模型組小鼠肝臟T-AOC 和T-SOD活性分別比正常組降低了34.9%和30.7%，均顯著低于正常組（P＜0.05），提示高脂膳食致高脂血癥小鼠肝臟處于氧化應激狀態。灌胃銀杏肽后，小鼠肝臟T-AOC 和T-SOD 活性顯著高于高脂模型組（P＜0.05），高劑量銀杏肽組小鼠T-AOC 和T-SOD 活性恢復至正常水平（P＞0.05），表明銀杏肽通過提高機體抗氧化能力，發揮對高脂血癥小鼠的保護作用。與高脂模型組相比，辛伐他汀也能顯著提高小鼠肝臟T-AOC 和T-SOD 活性（P＜0.05），高劑量銀杏肽組小鼠肝臟TAOC 和T-SOD 活性顯著高于陽性對照組（P＜0.05）。

圖7 銀杏肽對高脂血癥小鼠肝臟T-AOC 和T-SOD活性的影響Fig.7 Effects of Ginkgo biloba peptides on T-AOC and T-SOD activities of liver tissue in hyperlipidemia mice

MDA 水平升高被認為是機體脂質過氧化的重要標志。銀杏肽對高脂血癥小鼠肝臟MDA 水平的影響如圖8 所示。高脂模型組小鼠肝臟MDA 水平顯著高于正常組（P＜0.05），表明高脂膳食攝入造成肝組織脂質氧化損傷。與高脂模型組相比，低、中、高劑量銀杏肽組小鼠肝臟MDA 水平分別降低了16.67%、28.07%、40.06%，均顯著低于模型組（P＜0.05），提示銀杏肽可緩解高脂膳食誘導的肝組織脂質氧化損傷。與高脂模型組相比，辛伐他汀也能顯著降低小鼠肝臟MDA 水平（P＜0.05）；高劑量銀杏肽組小鼠肝臟MDA 水平顯著低于陽性對照組（P＜0.05）。

圖8 銀杏肽對高脂血癥小鼠肝臟MDA 水平的影響Fig.8 Effects of Ginkgo biloba peptides on MDA level of liver tissue in hyperlipidemia mice

3 討論與結論

高脂膳食是引發高脂血癥的常見風險因素之一。高脂膳食誘導的高脂血癥動物模型被廣泛用于評價受試物的輔助降血脂功能。本試驗中，連續6 周飼喂高脂飼料造成了小鼠肥胖，肝臟指數顯著升高，脂肪表觀消化率顯著下降（P＜0.05）；血清TG、TC、LDL-C、IL-6 和TNF-α水平顯著升高，HDL-C水平顯著下降（P＜0.05）；肝臟T-AOC 和T-SOD 活性顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.05）；小鼠動脈粥樣硬化和冠心病的發病風險顯著提高（P＜0.05）。根據《輔助降血脂功能評價方法》（國食藥監保化[2012]107 號），可判定高脂血癥小鼠造模成功。上述結果也與前人研究報道一致[14-16]。

銀杏肽干預顯著降低了高脂血癥小鼠血清TC、TG 和LDL-C 水平，升高了HDL-C 水平（P＜0.05），由此可判定銀杏肽輔助降血脂功能動物實驗結果陽性。銀杏肽干預顯著降低了高脂血癥小鼠體質量和肝臟指數（P＜0.05），這與前人研究結果一致。火麻籽多肽[17]和豬骨膠原蛋白肽[18]也能顯著降低小鼠體質量和肝臟指數。銀杏肽干預對小鼠攝食量無顯著性影響（P＞0.05），而錢珊珊等[13]發現大豆活性肽顯著降低了高脂模型組小鼠的采食量，推測這與活性肽的來源和添加量等有關。銀杏肽干預顯著提高了脂肪表觀消化率（P＜0.05），可能是由于銀杏肽為兩性化合物，具有良好的乳化性，銀杏肽作為乳化劑提高了高脂血癥小鼠對高脂膳食中脂肪的消化能力。田許等[11]研究表明魚膠原蛋白肽干預也提高了高脂血癥小鼠的脂肪表觀消化率。

動物試驗和臨床試驗表明，IL-6、TNF-α、IL-1β、單核細胞趨化蛋白-1、C-反應蛋白和趨化因子16 等炎性標志物與高脂血癥和動脈粥樣硬化的發生進展密切相關[19-20]。高脂血癥患者中TNF-α與TC、TG 水平顯著正相關；TNF-α在炎癥過程與動脈粥樣硬化進展過程中扮演著重要角色，TNF-α可通過激活NF-κB、STAT3 等信號通路調節血管平滑肌細胞的遷移和增殖，進而參與動脈粥樣硬化斑塊的發生和進展[21]。IL-6 是炎癥過程的關鍵介質之一，可導致血漿C-反應蛋白、纖維蛋白原和纖溶酶原水平升高；近年來，IL-6 被認為是腦血管疾病的風險標志物和動脈粥樣硬化治療的新靶點[22]。本研究結果表明，低、中、高劑量銀杏肽均能顯著降低小鼠血清IL-6 和TNF-α水平（P＜0.05），提示銀杏肽可緩解高脂膳食誘導的炎性損傷，通過抑制促炎細胞因子表達而發揮對高脂血癥小鼠的降脂作用，有關銀杏肽抑制IL-6 和TNF-α表達水平的信號通路有待后續進一步研究。

大量研究表明，氧化應激是高脂血癥發生發展的早期事件，高脂血癥患者中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性下降，MDA 水平升高；適當攝入外源抗氧化劑，拮抗高脂膳食導致的氧化應激，被認為有助于高脂血癥的防治[23-25]。TAOC 水平下降被認為是氧化應激發生的信號[26]；脊椎動物的T-SOD 包括Cu/Zn-SOD 和Mn-SOD 兩類[27]；MDA 被認為是反映機體氧化應激狀態的重要標志物[28]。本研究中，低、中、高劑量銀杏肽均顯著提高了高脂血癥小鼠肝臟T-AOC 和T-SOD 活性，降低了MDA 水平（P＜0.05），表明銀杏肽通過提高機體抗氧化能力，發揮對高脂血癥小鼠的降脂作用。毛瑞雪等[29]研究表明裸燕麥低聚肽可緩解血脂異常大鼠的脂代謝紊亂，其作用機制與抗氧化應激相關，這與本研究結果一致。而李迪等[30]雖未觀察到吉林人參低聚肽對高脂血癥大鼠的輔助降血脂作用，但該肽可降低血清和肝臟MDA 水平，提高SOD 和谷胱甘肽過氧化物酶活性。有關銀杏肽在體內提高抗氧化酶活性所涉及的信號通路有待后續進一步研究。

綜上所述，銀杏肽能夠降低高脂血癥小鼠體質量、肝臟指數，降低血清TC、TG、LDL-C 水平，提高HDL-C 水平和脂肪表觀消化率，對小鼠攝食量無顯著性影響，緩解高脂膳食誘導的炎性損傷，提高小鼠的抗氧化能力，降低動脈粥樣硬化和冠心病的發病風險。結果提示銀杏肽對高脂膳食誘導的高脂血癥小鼠具有輔助降脂作用，其作用機制與提高機體抗氧化能力和抑制促炎細胞因子表達有關。