食品中脂肪氧化產生的活潑羰基化合物研究進展

劉 楠，崔柯鑫,2，孫 永，王珊珊，楊 敏，孫國輝，王明麗，王大軍，周德慶,

（1.中國水產科學研究院，黃海水產研究所/青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東青島 266071；2.中國海洋大學，食品科學與工程學院，山東青島 266005；3.蓬萊匯洋食品有限公司，山東煙臺 265609；4.煙臺海裕食品有限公司，山東煙臺 264000）

活潑羰基化合物（Reactive carbonyl compounds，RCCs）主要由脂類和糖類的非酶氧化反應產生。脂類氧化分解產生的RCCs 從化學角度主要可以被分為三大類：a.α,β-不飽和醛，如4-羥基-反式-2-壬烯醛（HNE）、4-羥基己烯醛（HHE）和壬烯醛和丙烯醛（ACR）；b. 酮醛，如丙酮醛（MGO）、4-氧代-壬烯醛（ONE）和異酮類化合物（LGD2）；c. 二醛，如乙二醛（GO）和丙二醛（MDA）[1]（結構見圖1）。RCCs 對蛋白質的氧化修飾已被證明可以在多種疾病中誘導抗體，包括系統性紅斑狼瘡、酒精性肝病、糖尿病和類風濕性關節炎等[2-3]。當RCCs 由糖形成時，與蛋白質形成的加合物被命名為糖基化終產物（Advanced glycation end products，AGEs），而當RCCs 由脂質形成時，加合物則被命名為晚期脂類氧化終產物ALEs（Advanced lipoxidation end products）[4]。脂質過氧化產物的主要作用是抑制DNA 的合成及細胞分裂和腫瘤生長，誘導細胞凋亡[5]。近幾年，RCCs 中的ACR、MDA、HNE、HHE 等活潑的醛類物質已被作為氧化應激損傷、疾病進程的重要生物標志物[6-7]。

圖1 脂類氧化分解產生的最活躍羰基化合物種類Fig.1 The most active carbonyl compounds produced by the oxidation and decomposition of lipids

1 與RCCs 有關的主要生化反應

RCCs 中細胞毒性較強的HHE、HNE 等α,β-不飽和醛主要由脂質過氧化產生，ω-6 PUFA（18:2，20:4）脂質過氧化的產物主要是HNE 和己醛，ω-3 PUFA（22:6）的產物則是HHE 和丙醛，有3 個及以上亞甲基中斷雙鍵（20:4，22:6）的PUFA 會生成MDA[8-9]。生成的RCCs 會與一些氨基酸發生反應也會發生羰基化，修飾后形成蛋白質羰基，從而導致蛋白質功能障礙，引起“羰基應激”，進而引發一系列炎癥反應或加快疾病進程。

1.1 RCCs 的產生與脂肪氧化的關系

當食物中含有大量多不飽和脂肪酸、光、熱、金屬離子和自由基等促氧化劑存在時，則會引發脂肪氧化，在魚類中會引起魚體肌肉酸敗，產生不愉快的氣味及有害物質[10-11]。促使脂肪自氧化過程的自由基可由光、高能輻射等因子誘導產生，也可由其他自由基誘導產生，自由基反應的最大特點是傾向于進行鏈式反應。

脂質過氧化的啟動可以由活性物種（Reactive species，RS）的添加引起，或者更常見的是由RS 從亞甲基（-CH2-）基團中提取氫原子引起的；在這兩種情況下，都會產生碳自由基[12]。例如，羥基·OH 可以通過H·抽提進行反應，如圖2 的引發階段。過氧化氫自由基HOO·可以從PUFA 中提取H·，在有氧條件下，碳自由基很容易與O2結合，生成過氧基，過氧基還可以從相鄰的脂肪酸側鏈中提取H。如圖2 的傳遞階段，這是脂質過氧化的傳播期。它形成新的碳自由基，可以與O2反應形成新的過氧化物自由基，因此脂質過氧化的連鎖反應繼續進行（圖2）。ROO 與其提取的H·結合，形成脂質過氧化氫（ROOH）。因此，單個的引發有可能通過連鎖反應產生多個過氧化物分子。

ROOH 在高溫或金屬存在下會發生水解或熱裂，容易分解為低分子量的次生產物，產生許多揮發物和非揮發物，揮發物如醛、短鏈碳氫化合物、醇、酯、酸和酮[13]，這時就會形成如MDA、HNE 等一些有害的RCCs，過氧化總過程如圖3。

1.2 RCCs 與蛋白質的進一步氧化

蛋白質中沒有天然存在的羰基，主要由氧化機制生成[14]。羰基通過各種氧化途徑引入蛋白質。蛋白質可以通過許多不同的方式進行氧化修飾，一是通過氨基酸側鏈和蛋白質骨架的直接氧化；二是通過與PUFA 和碳水化合物的氧化產物結合而發生間接氧化[15]。活性氧（ROS）可以直接與蛋白質反應，也可以與糖和脂質等分子反應，生成RCCs 后與蛋白質反應[16]。如RCCs 中的HNE 能夠通過與大量靶點的Michael 加成形成蛋白質加合物。HNE 優先與含硫醇蛋白的半胱氨酸殘基形成加合物，其中一些是參與氧化還原信號的蛋白質[17]，如圖4。在大多數情況下，蛋白質的功能會因HNE 加合物的形成而受損。HNE 在蛋白質中形成具有三個不同側鏈的加合物，即半胱氨酸（Cys）、組氨酸（His）和賴氨酸（Lys）[12]。在合成的多氨基酸模型化合物中，研究了這些氨基酸（AA）殘基與HNE 形成加合物的反應活性。結果表明，半胱氨酸殘基的活性最高，HNE/AA 摩爾比的大小順序為：Cys＞His＞Lys。對ONE 也得到了類似的結果，Arg 是ONE 的目標，但一般不是HNE 的目標[18]。

圖4 RCCs 與AA 的反應Fig.4 Reaction of active carbonyl compounds with amino acids

在活性氧（ROS）存在時，自由基與蛋白質的反應會引起蛋白質骨架和氨基酸側鏈的變化。這些變化包括肽鍵的斷裂、氨基酸側鏈的修飾和共價分子間交聯蛋白衍生物的形成。其中最常見的氨基酸修飾是形成蛋白質羰基和蛋白質氫過氧化物[19]。通常把蛋白質羰基化定義為一種不可逆的翻譯后修飾（PTM），會在蛋白質中產生活潑的羰基部分，如醛、酮等[20]，蛋白質羰基通常被用作衰老和疾病中蛋白質氧化的指示物[21]。一般來說，蛋白質羰基化的途徑可以分為直接氧化、金屬催化氧化與游離糖的反應以及脂質過氧化產物[10]。通過金屬催化裂解的蛋白質氧化是魚體內系統中氧化損傷的主要原因，也是魚死后肌肉中氧化損傷的主要原因[15]。

2 RCCs 的檢測

來源于脂類過氧化的RCCs 中主要的標志性物質是HHE、HNE 和MDA。其中，MDA 是國標中對食品已經有所要求的重要檢測指標，而國標中暫時還沒有與HHE 和HNE 相關的檢測和限量標準。RCCs的檢測是一個復雜的過程，由于其化學結構的特殊性需要先衍生化，然后再檢測。

2.1 衍生化與純化

由于RCCs 具有較強的極性在色譜柱中沒有保留，且生物反應活性強，穩定性較差，無紫外或熒光吸收的官能團，因此提取前需先采用衍生化。目前常用的衍生化試劑有2,4-二硝基苯肼（DNPH）[22]、O-2,3,4,5,6-（五氟芐基）羥胺（PFBHA）[23]、雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）[24]和1-（4-肼基-4-氧代丁基）吡啶-1-溴化物（HPB）[25]等。其中，2,4-二硝基苯肼（DNPH）最為常用，在酸性條件下可將RCCs 衍生成為一種穩定可測的物質—2,4-二硝基苯腙，具有紫外吸收[25-27]。

食品體系較為復雜，為了減少各種雜質對羰基化合物分析的影響，分析前需要對樣品進行純化處理，最常用的方法是固相微萃取（SPME）[28]。SPME是集取樣、萃取、預濃縮于一體的綠色無溶劑萃取技術，是一種便捷、低成本、通用、易于自動化的樣品高通量檢測方法，常用作對于揮發性有機物質的分析，并有良好的重現性[29-31]。

2.2 檢測方法

針對食品中的MDA 以及有機化學試劑中的羰基化合物總量國標規定了檢測方法，而針對于HHE、HNE 這兩種物質的檢測主要是利用先色譜法分離后與質譜法結合來進行檢測。

2.2.1 國標中羰基化合物總量的測定 國標對于有機化學試劑中微量羰基化合物總量的測定是利用2,4-二硝基苯肼將羰基轉化成2,4-二硝基苯腙并用比色法進行測定，反應式如圖5。由于比色法存在一定的誤差，也沒有明確具體的提取方法，且不能提供羰基化合物的特定種類信息，因此存在一定的局限性。

圖5 羰基化合物與2，4-二硝基苯肼的反應Fig.5 Reaction of carbonyl compounds with DNPH

2.2.2 MDA 的測定 國標中規定了食品中MDA 的兩種測定方法：第一種為高效液相色譜法：試樣先用酸液提取，再將提取液與硫代巴比妥酸（TBA）作用生成有色化合物，采用高效液相色譜二極管陣列檢測器測定，外標法定量；第二種為分光光度法：MDA 經三氯乙酸溶液提取后，與硫代巴比妥酸（TBA）作用生成粉紅色化合物，測定其在532 nm 波長處的吸光度值，與標準系列比較定量。

2.2.3 HHE 和HNE 的檢測方法 國內外科研工作者對HHE、HNE 的檢測進行了較多的研究。一般采用氣相色譜法（GC）、氣相色譜質譜聯用（GC-MC）、高效液相色譜法（HPLC）或液相色譜質譜聯用（LCMS）進行檢測。

2.2.3.1 LC-MS 用酶系統形成的脂質過氧化產物的分析一般使用帶有紫外檢測的HPLC。高效液相色譜法操作簡單，定量準確，在HHE 和HNE 的檢測中應用較為廣泛。Uchida 等[27]用SPME 纖維從樣品溶液中提取HNE 或HNE 與DNPH 反應生成的衍生物，用HPLC 測定HNE 的含量[32]。Johnston 等[33]用1-甲基-2-苯基吲哚比色法檢測植物中的MDA和HNE，這項研究表明，1-甲基-2-苯基吲哚比色法對植物組織中的MDA 和HNE 不是特異的，特別是對于含有高濃度單糖的樣品，HPLC 被推薦為測量植物組織中MDA 和HNE 最可靠的方法。但由于食品體系的復雜性，單純利用保留時間定性準確度不高，對于較準確的測定需要利用液相色譜分離后與質譜聯合來分析[28]。Douny 等[26]用DNPH 衍生后，建立了LC-MS 的分析方法測定植物油樣中的MDA、HNE、HHE 和2，4-癸二烯（2，4-DECA），驗證表明可以在同一次運行中分析油樣中的MDA、HHE、HNE 和2，4-DECA，對MDA 有很好的準確度，對其他3 種醛在指定濃度下有一定的準確度。

2.2.3.2 GC-MS GC-MS 能夠比較準確地對羰基化合物進行定性定量分析，允許在多種情況下指定結構。Surh 等[34]采用選擇性離子監測GC-MS 測定了56 種市售PUFA 強化食品中HHE 和HNE 的含量。Pstergiadis 等[23]建立了高效、安全的GC-MS 檢測方法，適用于食品中HHE 和HNE 的檢測。付湘晉等[35]以五氟苯肼為衍生化試劑，采用固相微萃取-氣相/質譜法（SPME-GC/MS）檢測魚糜中的RCCs 包括MDA、HHE、HNE。然而，高分子量和極性化合物的鑒定困難以及分子離子的缺失限制了GC-MS的應用，且分析時間較長，對于同時檢測多種羰基化合物并不適用[28,32]。

2.2.3.3 試劑盒快速檢測 市場上檢測魚組織中4-HHE 和4-HNE 的試劑盒的出現滿足了人們對HHE和HNE 檢測的需求。該方法采用雙抗體夾心法測定標本中4-HNE 或4-HHE 的含量。該方法的原理為將4-HNE 或4-HHE 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入經過勻漿離心后的魚組織上清液標本，再與HRP 標記的4-HNE 或4-HHE 抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中4-HNE 或4-HHE 的含量具有正相關關系。用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中魚組織中的4-HNE 或4-HHE 濃度。試劑盒與傳統的檢測方法相比，檢測速度更快，操作更簡便，在應對突發事件時，試劑盒這種快速檢測技術高效性的優勢得到充分體現。然而試劑盒的弊端也很明顯，其檢測范圍在2～65 ng·L-1之間，對于含量過高或過低以及需要準確定量分析的樣品，還是要利用液相分離與質譜檢測相結合的方法進行準確地分析測定。

綜上，國標中雖然規定了羰基化合物總量的測定方法，但該方式適用于有機溶劑，不合適化學成分復雜的食品。國標中只規定了食品中活潑羰基化合物MDA 的檢測方法，其他的活潑羰基化合物如HHE 和HNE 并未有相關的規定，雖然進行了一些檢測方法的研究，但是其準確性和通用性還有待提高。

3 與RCCs 有關的飲食暴露量研究

RCCs 中的醛類衍生物是在脂肪、油和糖的烹調過程中產生的，因此食品是人體RCCs 暴露的重要途徑。根據RCCs 的暴露量的研究判斷其毒性更為科學可靠。僅根據飲食消耗，估計人體每天的α，β不飽和醛耐受劑量為5 mg·kg-1bw[36]。2006 年WHO的一個工作組通過小鼠實驗確定了丙烯醛的容許口服攝入量為7.5 μg·kg-1bw·d-1，但由于分析困難和缺乏可靠的含量測量，無法評估通過食物接觸的丙烯醛[37]。

因此，活潑羰基化合物飲食暴露量的調查研究就更為重要，但目前的研究較為有限。2005 年在韓國的一項研究顯示，根據2001 年韓國膳食攝入量調查資料，韓國人每天接觸4-羥基-2-烯烴（不包括油炸食品）為4.3 μg·d-1，由1.6 μg HHE 和2.7 μg HNE 組成。據計算，韓國人每天可額外接觸油炸食品中的4-羥基-2-烯烴11.8 μg 以上。韓國人攝入植物油、魚、貝類和一些油炸食品中的4-羥基-2-烯烴的綜合暴露量為16.1 μg·d-1，相當于60 kg 韓國成年人0.3 μg·kg-1bw·d-1，這種情況下可能不會對人體健康造成風險[13]。對于普遍喜食油炸食品或干腌制水產品的居民而言，RCCs 攝入極易超標，會造成一定的食品安全風險。盡管有研究報告了4-羥基-2-烯烴的毒性，但還沒有足夠的數據表明RCCs 的實際安全劑量，因此有待進一步研究。

2014 年在比利時的一項研究中，對含有HHE、HNE、MDA 的16 種食品類別進行了分析，結合從比利時人口的國家代表性樣本中獲得的消費數據，進行了定量暴露評估：84%的分析樣品MDA 超標，63%的樣品檢測到HNE 和16%的HHE，HHE 和HNE的檢測率分別為63%和16%。食用干堅果、油炸零食、薯條和腌制肉末產品對MDA 和HNE 的攝入量貢獻最大。食用腌制和切碎的生肉產品的人中有一小部分人（3.8%），他們可能處于潛在的風險中。但由于沒有可靠的MDA、HNE 和HHE 的毒理學數據，研究者認為應該采取預防措施，防止食品在加工和儲存過程中的脂質氧化[38]。

4 羰基化合物的消減與抑制

食品中RCCs 的產生與很多因素相關，比如儲藏過程中溫度的變化、樣品中鹽含量、加工方式等，其中，添加抗氧化劑是最有效的控制RCCs 產生與累積的手段[1,35,39]。抗氧化劑是通過清除自由基、氧化前螯合金屬、淬滅單線態氧和光敏劑以及滅活脂氧合酶來減緩食物的氧化速率，從而抑制脂肪氧化。酚類化合物、抗壞血酸、氨基酸和其他的一些天然提取物作為重要的天然抗氧化劑被廣泛地食用[1,39-43]。抗氧化劑可以與RCCs 直接反應，阻斷蛋白質-RCCs的反應，從而起到保護蛋白質的作用。

天然多酚具有較強的延緩脂質過氧化的抗氧化活性，具有清除自由基能力與抑制脂質過氧化誘導的BSA 修飾之間的相關性，可在一定程度上阻斷對蛋白質羰基化的不利影響[41]。劉焱等[42]研究發現茶多酚能夠通過抑制巰基含量的減少來抑制魚油氧化而導致的蛋白質變性。苗苗[43]研究發現茶多酚可以降低魚糜中的POV 值，表明茶多酚可以有效減緩氫過氧化物的積累，但是并未完全抑制其生成；同時研究還發現，貯藏后期魚糜的TBARS 值也有一定程度的降低。孫濤等[44]研究發現槲皮素和葛根素能促進非酶糖基化早期產物果糖胺和5-HMF 的生成，對反應中期的羰基化合物具有較強的抑制作用。因此有理由認為，酚類化合物清除RCCs 的替代機制可能共同作用于控制蛋白質、脂質過氧化以及一些相關的人類疾病。

維生素C 在體外可以與HNE 形成邁克爾型結合物。反應為抗壞血酸的活化C-H 基團在HNE 的C=C 雙鍵上的Michael 加成，然后環化生成半縮醛[32]。但抗壞血酸性質不穩定，加工過程中的光照高溫等因素會使其發生分解，從而變質失效。

抗氧化活性肽與氨基酸也可以與RCCs 反應生成各種加合產物，如Schiffe 堿和Michael 加合產物等，顯著降低RCCs 的含量，其中，L-半胱氨酸（Cys）應用較多，效果較好[45-46]。

另外，把各種天然抗氧化劑按一定比例進行復配，研究新型復合抗氧化劑也是近年來抗氧化領域研究的熱潮。已有研究發現，相對于單一的抗氧化劑，復合抗氧化劑的抗氧化效果更好[47]。孫逸雯等[48]研究了維生素E 和迷迭香提取物復合的天然抗氧化劑對亞麻籽油氧化穩定性的影響，結果表明復合天然抗氧化劑可有效延緩亞麻籽油的氧化酸敗。為提高凍藏大黃花魚片的品質，卿明民等[49]對茶多酚、維生素E、異抗壞血酸鈉進行了優化復配，結果表明復合抗氧化劑能有效抑制其因脂肪氧化引起的組織損失。

RCCs 的消減控制主要通過兩條途徑，一是通過抑制脂類氧化控制RCCs 的產生；二是通過與RCCs 發生反應，對其起到消減的作用。通過添加抗氧化劑對RCCs 進行消減控制的主要問題是如何提高抗氧化劑的穩定性，因此復合型的抗氧化劑和穩定性更強的抗氧化劑更為有效。

5 結論與展望

本文主要綜述了由脂肪氧化產生的以HHE 和HNE 為代表的RCCs 的檢測方法、飲食暴露和消減控制。近年來，國內外對于嬰兒奶粉[34]、油炸食品[24,50]、肉制品[51-52]、植物油[53]、白酒及其制品[54]中的RCCs均有一定的研究。RCCs 對食品安全有重要影響，但目前的研究存在以下問題：缺少對于水產品中RCCs累積規律的研究以及國家安全標準限量的規定，特別是我國傳統特色干腌制品，如腌魚、咸魚干等的相關研究非常匱乏；尚未建立出針對于干制水產品中RCCs的有效控制手段。在今后的工作中應從蛋白質氧化、脂肪氧化、RCCs、自由基和抗氧化劑等之間的關系開展研究，解析RCCs 累積機制與脂肪氧化機制，開發能夠有效消減控制RCCs 產生和累積的抗氧化劑，提高干制水產品的食用品質及安全性。