系統性硬化病患者血清lncRNA MEG3表達及其與Th17/Treg平衡的關系研究

郝 鈺，李 波

濟南市中醫醫院檢驗科，山東濟南 250012

系統性硬化病(SSc)是一種結締組織病變，可累及皮膚、腎臟、心臟、消化道等，損害患者身心健康[1-2]。有研究認為，SSc發病與免疫失調、環境、微小RNA(miRNA)、血管纖維化、長鏈非編碼RNA(lncRNA)等有關[3-4]。研究發現，輔助性T細胞17(Th17)/調節性T細胞(Treg)在SSc中失衡，其可能通過影響免疫水平影響SSc發生、發展[5]。另外，lncRNA人母系表達基因3(MEG3)在類風濕關節炎(RA)中呈低表達，其可能通過調節炎性反應，進而影響RA病變過程[6]；而在SSc患者中，微小RNA-21(miR-21)可促進纖維化，lncRNA MEG3可靶向調節miR-21表達[7-8]。由此推測，SSc患者中lncRNA MEG3表達水平可能與Th17/Treg平衡有關。本研究旨在通過測定lncRNA MEG3在SSc患者血清中的表達情況，分析lncRNA MEG3與Th17/Treg平衡的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年3月本院診治的54例SSc患者作為SSc組。其中男8例，女46例；年齡25～57歲，平均(41.35±12.56)歲；病程3～24個月，平均(13.78±8.29)個月。另選取同期54例體檢健康者作為對照組，其中男10例，女44例；年齡25～57歲，平均(42.63±12.70)歲；無自身免疫性疾病史。SSc組與對照組性別、年齡等比較，差異無統計學意義(P>0.05)。SSc組納入標準：(1)符合文獻[9]中的SSc診斷標準；(2)病程≤24個月，臨床資料完整。排除標準：(1)合并心血管疾病、急性感染者；(2)合并精神疾病、腫瘤者；(3)合并肝、腎原發性疾病者；(4)皮膚硬化且處于晚期、皮膚嚴重萎縮者；(5)哺乳期、妊娠期女性。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求，獲得本院倫理委員會批準，且受試者及其家屬簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本收集 分別收集健康體檢者、SSc患者清晨空腹外周血6～7 mL，分成兩份，一份置于含肝素抗凝劑的抗凝管內，用于Th17、Treg細胞百分比檢測；另一份置于5 mL EP管內，自然凝集25 min后，3 800 r/min離心7 min(離心半徑為8 cm)，分離血清，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2流式細胞術檢測Th17、Treg細胞水平 取1.2.1中的抗凝血，按密度梯度離心法使用人Ficoll淋巴細胞分離液(上海雅吉生物科技有限公司)獲取外周血單個核細胞(PBMCs)，利用RPMI 1640培養液(南京維森特生物技術有限公司)將PBMCs稀釋為1.5×106個/mL的細胞懸液，流式細胞儀(型號：FACSCantoⅡ，美國BD公司)檢測Th17、Treg細胞百分比，求Th17/Treg比值。

1.2.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測血清lncRNA MEG3、miR-21、維甲酸相關孤核受體γt(RORγt)mRNA、叉頭/翼狀螺旋轉錄因子3(Foxp3)mRNA表達水平 解凍血清，按TRIzol試劑盒(上海愛必信生物科技有限公司)說明書提取總RNA，用超微量分光光度計(美國Quawell公司)按cDNA逆轉錄試劑盒(上海康朗生物科技有限公司)說明書將RNA逆轉錄為cDNA。使用2×SYBR Green QPCR mix試劑盒(美國AMEKO公司)及RT-qPCR儀(CFX96型，美國Bio-Rad公司)對cDNA進行PCR擴增。采用2-ΔΔCt法計算血清lncRNA MEG3、miR-21及Foxp3 mRNA、RORγt mRNA相對表達水平，lncRNA MEG3、RORγt、Foxp3以GAPDH為內參，miR-21以U6為內參，各引物序列見表1。

表1 lncRNA MEG3、Foxp3、RORγt、miR-21及GAPDH、U6的引物序列

2 結 果

2.1兩組血清lncRNA MEG3、miR-21及外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較 與對照組相比，SSc組患者血清lncRNA MEG3表達水平、Treg細胞百分比降低(P<0.05)，miR-21表達水平、Th17細胞百分比、Th17/Treg升高(P<0.05)，見表2。兩組Th17(CD4+IL-17+)、Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細胞水平見圖1、2。

表2 兩組血清lncRNA MEG3、miR-21及外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較

注：A為對照組；B為SSc組；百分率為CD4+IL-17+/CD4+ T細胞比例。

注：A為對照組；B為SSc組；百分率為CD4+CD25+Foxp3+/CD4+ T細胞比例。

2.2兩組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達水平比較 與對照組相比，SSc組患者血清RORγt mRNA表達水平升高(P<0.05)，Foxp3 mRNA表達水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 兩組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對表達水平比較

2.3SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表達水平與外周血Th17、Treg、Th17/Treg相關性 Pearson法分析顯示，SSc患者血清lncRNA MEG3表達水平與Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg及血清miR-21表達水平與Treg、Foxp3 mRNA呈負相關(P<0.05)，血清lncRNA MEG3表達水平與Treg、Foxp3 mRNA及血清miR-21表達水平與Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表達水平與Th17、Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相關性

2.4SSc患者血清lncRNA MEG3表達水平與miR-21的相關性 Pearson法分析顯示，SSc患者血清lncRNA MEG3表達水平與miR-21呈負相關(r=-0.564，P<0.05)。見圖3。

圖3 SSc患者血清lncRNA MEG3表達水平與miR-21相關性

2.5影響SSc發生的影響因素分析 以是否發生SSc為因變量(發生=1，未發生=0)，采用Enter法納入和剔除變量(α剔除=0.10，α入選=0.05)，以lncRNA MEG3(實測值)、miR-21(實測值)、Th17(實測值)、Treg(實測值)、RORγt mRNA(實測值)、Foxp3 mRNA(實測值)、Th17/Treg(實測值)為自變量，Logistic回歸分析顯示，lncRNA MEG3是影響SSc發生的保護因素(P<0.05)，miR-21、Th17/Treg是影響SSc發生的危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 Logistic回歸分析SSc發生的影響因素

3 討 論

SSc是一種多發于女性的自身免疫系統疾病，以內臟纖維化、皮膚增厚為主要特征，病死率高[10-11]，尋找與SSc發病相關因素并及時干預對改善患者生存情況有積極意義。

既往研究發現，miR-21在SSc血管病變及纖維增生性改變中起促進作用，其可能是SSc的治療靶點[12]。lncRNA可調節相關信號轉導、免疫炎性反應，且lncRNA MEG3作為lncRNA的一員，其可通過靶向調節miR-21表達，進而影響銀屑病發生、發展[8,13]。有報道顯示，lncRNA MEG3在RA中表達下調，其可能靶向調節有關基因進而影響RA病理變化[14]。研究顯示，lncRNA MEG3在強直性脊柱炎中表達水平降低，其可能調節炎性反應，進而影響強直性脊柱炎病變進程，lncRNA MEG3可能是治療強直性脊柱炎的潛在靶標[15]。本研究探究了lncRNA MEG3、miR-21與SSc的關系，結果顯示，SSc患者血清lncRNA MEG3表達水平較低，與其在RA患者中的表達情況一致[14]，miR-21表達水平較高，與HENRY等[12]研究結果相符，提示lncRNA MEG3、miR-21表達失調可能與SSc發生有關。由此推測，lncRNA MEG3可能靶向調控miR-21，進而調節血管病理變化，影響免疫炎性反應，從而在SSc病變過程中發揮作用，但相關機制仍需深入研究。

免疫系統維持著機體對外界刺激的反應與免疫耐受間的平衡，其中Th17/Treg平衡是保證免疫穩態的重要環節，Th17/Treg在復發緩解型多發性硬化患者中較高，其可能在多發性硬化中起重要免疫調節作用[16]。RORγt、Foxp3分別是Th17、Treg細胞的關鍵轉錄因子，RORγt影響Th17細胞分化及IL-17分泌，調節炎性反應，而Foxp3可與染色體結合，調控多種基因表達，在免疫功能、Treg細胞發育中具有重要作用[17-18]。本研究顯示，與體檢健康者相比，SSc患者Th17細胞百分比、Th17/Treg、血清RORγt mRNA表達水平較高，Treg細胞百分比及血清Foxp3 mRNA表達水平較低較低，與李丹等[16]、LEI等[19]、樂靜等[20]研究一致，提示Th17、Treg細胞、RORγt、Foxp3可能參與并影響SSc病理發展，分析可能原因，Th17細胞增多會增強免疫炎性反應，Treg細胞減少會降低免疫炎癥抑制作用強度，Th17、Treg細胞比例失衡，打破免疫平衡，Th17、Treg細胞在SSc疾病進展中起免疫調節作用，而RORγt、Foxp3可能通過影響Th17、Treg細胞功能，調節炎性反應，進而在SSc中發揮調節作用。

此外，ZHENG等[21]報道顯示，miR-21可調節Th17/Treg平衡。本研究探討了lncRNA MEG3、miR-21表達水平與Th17、Treg、Th17/Treg的相關性，結果顯示SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表達水平與Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt、Foxp3 mRNA均相關，提示lncRNA MEG3、miR-21可能與RORγt、Foxp3、Th17、Treg、Th17/Treg共同影響SSc發病進程。本研究還發現，SSc患者血清lncRNA MEG3表達水平與miR-21呈負相關，分析可能原因，lncRNA MEG3可能通過調節miR-21表達，進而調節Th17/Treg平衡，從而影響SSc病理進展。Logistic回歸分析顯示，lncRNA MEG3表達降低，miR-21、Th17/Treg升高均會增加SSc發生風險，及時檢測上述指標水平可能有助于及早診治SSc。

綜上所述，lncRNA MEG3在SSc患者中表達下調，與miR-21、Th17/Treg平衡密切相關，為臨床診治SSc提供了新思路。但本研究樣本量較小，后期需增加樣本量，從多中心、多角度探討lncRNA MEG3與SSc的關系，以提高研究的可靠性。