黃瓜GR-RBP3 啟動子克隆及低溫對其活性的誘導

王斌 黃泳諺易景怡原遠

(1. 廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室，廣東 韶關 512005；2. 韶關學院英東生物與農業學院，廣東 韶關 512005)

富含甘氨酸蛋白(glycine-rich proteins，GRPs)是植物中一類具有半重復甘氨酸基序(semi-repetitive glycine-rich motifs)的蛋白質，氨基酸序列中的甘氨酸含量在20%～70%之間[1]。根據氨基酸序列中重復序列的排列以及是否含有保守結構域，可將GRPs 家族細分為4 個亞家族[2]，其中，亞家族Ⅰ的GRPs 在(GGX)n重復序列的后面連著一個信號肽；亞家族Ⅱ的GRPs 序列中含有一個信號肽，并在C 端含有一段半胱氨酸重復基序；亞家族Ⅲ的GRPs 也含有信號肽，但與其他GRPs 相比，甘氨酸含量較低；亞家族Ⅳ的GRPs 也稱為富甘氨酸RNA 結合蛋白(glycinerich RNA-binding proteins，GR-RBPs)[3]，其氨基酸序列的N 端含有1 個或多個RNA 識別域(RNA recognition motifs，RRM)或冷休克結構域(cold-shock domain)或鋅指結構(zinc fingers)等保守結構域[4]。

GR-RBPs基因的表達與植物抗冷性密切相關。 擬南芥(Arabidopsis thaliana)的AtGR-RBP2、AtGR-RBP4和AtGR-RBP7在低溫處理后表達量顯著增加；與野生型和gr-rbp2突變體相比，過表達AtGR-RBP2顯著增強擬南芥幼苗耐冷性和抗凍性[5]。AtGR-RBP同源基因AtRZ-1b和AtRZ-1c表達與擬南芥抗凍性密切相關，但在冷敏感大腸桿菌中異源超表達AtRZ-1c不能修復其對低溫的敏感性[6]。 在擬南芥中過表達油菜(Brassica napus)GR-RBP1，能促進擬南芥種子萌發，提高轉基因擬南芥的耐冷性和抗凍性[7]。 可見，GR-RBPs表達在增強植物耐冷性中發揮著至關重要的作用。

黃瓜(Cucumis sativus)是重要的果菜類蔬菜，深受消費者喜愛[8，9]。 采后黃瓜組織含水量高，呼吸強度大，室溫貯藏很容易腐爛變質，貯藏期很短[10]。 因此，生產上通常采用低溫貯運以保持采后黃瓜品質，延長貯藏期[11]。 但黃瓜對低溫十分敏感，低溫貯藏時很容易發生冷害[12]。 因此，挖掘耐冷相關基因并解析其在采后黃瓜耐冷性中的作用，對耐冷黃瓜新品種的培育及種質資源改良具有重要意義。

啟動子是啟動和調控基因表達的重要元件，在基因轉錄調控中占有核心地位，決定基因的表達水平[13]。 本研究前期結果證實，低溫鍛煉處理能顯著誘導采后黃瓜耐冷性和CsGR-RBP3表達[14]；在擬南芥中異源超表達CsGR-RBP3，能增強擬南芥幼苗的耐冷性，促進其在低溫條件下的生長[15]。 表明CsGR-RBP3表達與采后黃瓜耐冷性密切相關，但調節其表達的轉錄調控機制仍不清楚。 因此，本研究根據黃瓜基因組信息，利用黃瓜果皮DNA 克隆了CsGR-RBP3啟動子，并采用基因工程方法在煙草和擬南芥中分析了啟動子活性以及低溫對其活性的影響，以期從轉錄調控的角度解析低溫處理誘導CsGR-RBP3表達的分子機理，明確CsGR-RBP3響應低溫信號的方式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

本研究所用黃瓜品種為“翠夏”，由廣東現代金穗種業有限公司培育。 2017年6月采收成熟度好的黃瓜果實，立即在室溫條件下運回實驗室；挑選果形一致、無病蟲害、無機械傷的果實作為試驗材料，并將其分成3 組，每組15 根，用塑料薄膜保鮮袋扎口包裝后分裝在3 個塑料筐中，分別貯藏在25℃和5℃的恒溫培養箱中，培養箱濕度均為85%。 依次在貯藏0、24、48、72 h 取樣，每次取樣從一個筐中隨機取3 根黃瓜，收集果皮，立即用液氮速凍，并保存于-80℃超低溫冰箱，用于提取DNA 和總RNA。

哥倫比亞擬南芥(Arabidopsis thaliana)和本氏煙草(Nicotiana tabacum)的培養條件為23℃、16 h/8 h 光暗周期。 DH5α 大腸桿菌和GV3101農桿菌感受態購自上海唯地生物有限公司。

高保真PCRTaq酶、DNA 提取試劑盒、限制性內切酶，分別購自上海生工生物工程有限公司；Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 試劑盒和反轉錄試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司；植物總RNA 提取試劑盒和GUS 染色試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 DNA 提取、CsGR-RBP3 啟動子克隆及生物信息學分析

使用上海生工生物工程有限公司的Rapid Plant Genomic DNA Isolation Kit 試劑盒提取黃瓜基因組DNA，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA 質量。 利用黃瓜基因組數據庫，查找CsGRRBP3基因ATG 上游1500 bp 左右的DNA 序列，根據查找到的序列設計啟動子克隆引物。 將擴增到的序列送至上海生工生物工程有限公司廣州分公司測序，啟動子克隆所用引物見表1。

將經過測序驗證的啟動子序列提交至啟動子生物信息學分析網站PlantCARE(http:/ /bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，分析啟動子序列中存在的調控元件。 利用TSSP(http:/ /linux1. softberry. com/berry. phtml? topic ＝tssp＆group＝programs＆subgroup ＝promoter)在線網站預測啟動子的轉錄起始位點。 使用TBtools 數據可視化軟件繪制順式作用元件在啟動子中的分布[16]。

1.3 啟動子活性分析

采用雙熒光素酶報道基因實驗分析CsGRRBP3啟動子。 根據克隆的CsGR-RBP3基因啟動子序列設計引物，將其亞克隆到pGreenⅡ0800 Reporter 載體上。 構建載體的引物見表1。

分別將pGreenⅡ62-SK 空載、pGreenⅡ0800空載和CsGR-RBP3 pro::LUC 重組載體轉化GV3101 農桿菌，挑選單克隆陽性菌落，LB 液體培養基中擴大培養，直至菌液OD260值為0.5 ～0.8；離心收集菌體，用滲透液(含10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2和150 μmol/L 乙酰丁香酮)重懸菌體，調整到合適濃度，室溫靜置2 h；將含有pGreenⅡ62-SK 空載的滲透液分別與含有pGreenⅡ0800 空載和CsGR-RBP3 pro::LUC 重組載體的滲透液按1∶1 比例混合，注射到煙草葉片背面細胞，23℃共培養72 h 后，使用上海翌圣生物公司的Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 試劑盒檢測熒光素酶報告基因LUC和REN活性，并計算兩者比值。

1.4 CsGR-RBP3 pro::GUS 融合表達載體構建

使用ScaⅠ和SmaⅠ限制性內切酶雙酶切pBI121-GUS 植物表達載體，切除該表達載體的CaMV35S 啟動子，使其成為線性化片段；根據Cs-GR-RBP3啟動子和pBI121-GUS 植物表達載體ScaⅠ和SmaⅠ酶切位點附近序列設計同源重組引物，將啟動子序列亞克隆到pBI121-GUS 表達載體上，替換CaMV35S 啟動子，用于驅動GUS基因表達。 構建的載體命名為CsGR-RBP3 pro::GUS。 引物詳情見表1。

表1 本研究所用引物信息

1.5 啟動子超表達載體瞬時轉化煙草葉片和GUS 染色

分別將pBI121-GUS 空載和重組載體轉化DH5α 大腸桿菌感受態，對陽性克隆進行菌落PCR 驗證，重組載體雙酶切并測序鑒定；鑒定后的載體轉化GV3101 農桿菌感受態，挑取單克隆陽性菌落，用液體LB 培養基擴大培養至適宜濃度；采用同1.3 的方法，在煙草葉片背面細胞注射含有pBI121-GUS 空載和重組載體的農桿菌懸浮液，侵染后的煙草在23℃環境中暗培養24 h，使農桿菌充分活化，然后分別放置在23℃和5℃的環境中培養48 h。

采用真空滲透的方法，使用一次性注射器將GUS 染色液注入煙草葉片。 然后用打孔器從煙草葉片打取0.5 cm 大小的圓片，放入2 mL 的離心管中，再次用GUS 染色液染色24 h。 染色結束后，使用75%乙醇室溫脫去葉片中的葉綠素，拍照固定葉片GUS 染色情況。

1.6 轉基因擬南芥鑒定和低溫處理

用蘸花法將CsGR-RBP3 pro::GUS 啟動子超表達載體轉化擬南芥，通過抗性篩選、PCR 檢測等鑒定陽性轉基因苗，培養至收獲T2 代種子。提取T3 代轉基因擬南芥DNA，根據GUS基因全長設計引物，采用PCR 法鑒定是否為轉基因苗。

將種子萌發后生長22 d 的轉基因擬南芥苗用于低溫處理試驗:將轉基因擬南芥苗在5℃處理3 d(16 h/8 h 光暗周期)，收集葉片，用于分析GUS基因表達。

1.7 總RNA 提取、cDNA 合成和基因表達分析

使用北京天根生化科技有限公司的RNApre Pure Plant Plus Kit 試劑盒提取黃瓜果皮、煙草葉片和擬南芥葉片總RNA，嚴格按照說明書操作。

利用上海翌圣生物公司的Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 反轉錄試劑盒合成cDNA，具體操作按照試劑盒說明進行。 采用半定量PCR 法分析相應基因的表達情況，CsActin、NtEF1α和AtActin分別作為內參基因，引物詳情見表1。

1.8 數據統計與分析

使用Microsoft Excel 2016 軟件整理試驗數據，并制作圖片。

2 結果與分析

2.1 不同溫度處理對采后黃瓜GR-RBP3 表達的影響

為探究低溫處理對采后黃瓜GR-RBP3表達的誘導作用，檢測了不同溫度貯藏0 ～72 h 的Cs-GR-RBP3表達情況，結果(圖1)表明，在25℃貯藏期間，采后黃瓜GR-RBP3表達量很低，且在貯藏期間的變化不明顯；在5℃貯藏期間，與貯藏前(0 h)相比，CsGR-RBP3表達明顯上調，且表達隨貯藏時間延長而增強。 表明CsGR-RBP3是一個低溫誘導型基因，但低溫如何誘導采后黃瓜GRRBP3表達尚不清楚。

圖1 不同溫度處理對采后黃瓜GR-RBP3 表達的影響

2.2 CsGR-RBP3 啟動子克隆與生物信息學分析

啟動子是調控基因表達的核心元件，推測低溫可能通過影響CsGR-RBP3啟動子活性誘導其表達。 為此，本研究從黃瓜果皮中克隆CsGRRBP3啟動子，并構建啟動子超表達載體，探討低溫處理對CsGR-RBP3啟動子活性的影響。

以黃瓜果皮基因組DNA 為模板，以CsGRRBP3 Pro 為特異性引物，使用高保真Taq酶通過PCR 法擴增CsGR-RBP3基因ATP 上游1500 bp左右的DNA 序列，結果(圖2A)顯示，擴增到了1條約1500 bp 的目的片段。 將該DNA 片段連接18T 載體，轉化DH5α 大腸桿菌，經菌落PCR 檢測，也擴增出了一條與目的條帶大小一致的DNA片段(圖2B)。 經測序鑒定，獲得的片段實際長度為1541 bp，其序列與基因組(http:/ /www.cucurbitgenomics.org/)中已公布的序列一致，表明成功克隆到了CsGR-RBP3啟動子。

圖2 CsGR-RBP3 啟動子PCR 產物電泳圖譜

將克隆到的DNA 序列提交至PlantCARE 網站，分析啟動子中可能存在的順式調控元件。 結果(表2)顯示CsGR-RBP3啟動子序列中含有豐富的TATA-box 和CAAT-box，這兩個元件是真核生物保守的核心啟動子元件[17]，表明克隆到的序列具備了啟動子基本特性。 另外，在啟動子序列中還鑒定到多個環境響應元件(表2、圖3)，表明CsGR-RBP3表達受低溫、光照、干旱脅迫、厭氧誘導等影響。 同時，還發現了多個MYC 和MYB 轉錄因子的結合位點(圖3)，表明CsGR-RBP3表達可能受MYB 和MYC 類轉錄因子的直接調控。TSSP 網站分析顯示，CsGR-RBP3基因的轉錄起始位點在ATG 上游的1302 bp 處。

表2 PlantCARE 網站預測的CsGR-RBP3啟動子序列中的順式作用元件

圖3 逆境相關元件在CsGR-RBP3 啟動子上的分布

2.3 CsGR-RBP3 啟動子活性分析

采用雙熒光素酶報道基因實驗，分析CsGRRBP3啟動子是否具有啟動基因轉錄的活性。 將CsGR-RBP3啟動子亞克隆到pGreenⅡ0800 Reporter 載體上(圖4A)，與pGreenⅡ62-SK Effecter載體共轉化煙草葉片。 與SK 對照(pGreenⅡ62-SK 空載與pGreenⅡ0800 空載共轉化)相比，Cs-GR-RBP3啟動子能增強LUC 活性，提高LUC/REN 比值(圖4B)，表明CsGR-RBP3啟動子具有啟動基因轉錄的活性。

圖4 重組載體構建及CsGR-RBP3 啟動子活性分析

2.4 低溫處理對CsGR-RBP3 啟動子活性的影響

為了進一步探究低溫對CsGR-RBP3啟動子活性的誘導作用，使用克隆到的啟動子序列替換pBI121-GUS質粒的CaMV35S 組成型啟動子，構建啟動子超表達重組載體(圖5A)，用于驅動GUS基因的表達。

通過卡那霉素抗性篩選、菌落PCR 和雙酶切的方法進行驗證，確保啟動子成功連接到pBI121-GUS 載體上。 重組質粒經雙酶切，并進行瓊脂糖凝膠電泳，出現了兩條DNA 片段(圖5B)，大片段的長度超過10000 bp，推測為線性化質粒片段；小片段的長度為1541 bp，推測為啟動子片段。表明CsGR-RBP3啟動子已成功連接到pBI121-GUS 載體上，獲得了啟動子超表達重組質粒。

分別將pBI121-GUS 空載和重組質粒瞬時在煙草葉片中過表達，并用5℃低溫處理煙草，通過檢測GUS基因表達和活性變化，探究低溫處理對CsGR-RBP3啟動子活性的影響，結果(圖5C)顯示，不論是否低溫處理，轉化空載的煙草葉片中的GUS 活性和基因表達都很高；在23℃條件下，轉化重組質粒的煙草葉片中GUS基因表達和活性都比較低，但在5℃低溫處理48 h 后，GUS基因表達和活性都明顯增強。 表明低溫處理能增強Cs-GR-RBP3啟動子活性。

圖5 CsGR-RBP3 啟動子超表達重組載體構建及低溫對轉基因煙草葉片GUS 基因表達和活性的影響

將啟動子重組質粒在擬南芥中過表達，進一步確認低溫處理對CsGR-RBP3啟動子活性的活化作用。 通過在MS 平板上抗性篩選，初步獲得了6 株卡那霉素抗性苗；將這6 株轉基因苗不斷培養，并再次通過抗性篩選鑒定，直至收獲T2 代種子；以T3 代擬南芥DNA 為模板，采用PCR 法鑒定獲得的抗性苗是否為轉基因植株。 結果(圖6A)顯示，6 株抗性苗中均能檢測到GUS基因，表明重組質粒已整合到擬南芥基因組中，成功獲得過表達CsGR-RBP3啟動子的轉基因擬南芥。

圖6 過表達CsGR-RBP3 啟動子的轉基因擬南芥 鑒定及低溫對GUS 基因表達的影響

在苗齡為22 d 時，同樣使用5℃低溫處理轉基因苗，提取總RNA，檢測GUS基因的表達情況，結果(圖6B)顯示，在23℃條件下，6 株轉基因擬南芥中的GUS基因都有表達，除＃2 轉基因擬南芥中GUS表達量較低外，其他5 株的GUS表達量都較高，再次證明CsGR-RBP3啟動子具有啟動基因轉錄的活性。 5℃低溫處理后，6 株轉基因擬南芥中只有＃1 中GUS基因的表達量沒有明顯增加，其他5 株轉基因苗的GUS基因電泳條帶灰度明顯加深，表明低溫處理能夠增強CsGR-RBP3啟動子活性。

3 討論與結論

植物能感知低溫脅迫信號并迅速作出反應，以降低低溫脅迫對自身造成的傷害[18，19]。 誘導自身耐冷基因表達是植物應對低溫脅迫的一種重要方式[20，21]。 低溫脅迫處理顯著誘導番茄(Solanum lycopersicum)HSP17.7的表達，SlHSP17.7 能與膜定位蛋白SlCCX1-like 相互作用，保持胞質內Ca2＋穩態，過表達SlHSP17.7增加了細胞內蔗糖積累，減少了活性氧含量，從而增強了番茄抗冷性[22]。 水稻(Oryza sativa)RBGD3 是一個富甘氨酸RNA 結合蛋白，在耐旱水稻N22 品系中，低溫、干旱和鹽脅迫均對OsRBGD3表達展現出明顯的誘導效應，組成型過表達OsRBGD3賦予了轉基因擬南芥更強的耐冷性[23]。 本研究中，5℃低溫處理明顯上調了采后黃瓜的CsGR-RBP3表達，表明CsGR-RBP3是一個低溫誘導型基因；在擬南芥中過表達CsGR-RBP3，提高了轉基因擬南芥幼苗的抗冷性和抗凍性[15]；采后黃瓜對低溫十分敏感，在低于10℃的環境中貯藏即可發生冷害[24]。 這些研究表明，低溫誘導CsGR-RBP3表達可能是采后黃瓜應對冷害脅迫的重要方式。

基因啟動子區域含有的順式作用元件決定了該基因的誘導表達模式[25]。 LTR 順式作用元件普遍存在于干旱、高鹽、低溫脅迫應答基因的啟動子中[26，27]，其可能在植物應答非生物脅迫過程中起著重要作用。 擬南芥RD29A是一個逆境誘導基因，在其啟動子區域中也鑒定到LTR 元件[28]。本研究中，我們克隆并分析了黃瓜GR-RBP3啟動子區，發現CsGR-RBP3啟動子區除具有真核生物典型的核心啟動子元件TATA-box 和CAAT-box外，還含有響應低溫的LTR 元件以及響應干旱和光照等其他環境條件的順式作用元件，表明其不僅受低溫脅迫誘導，可能還參與黃瓜對干旱脅迫的響應過程。 低溫脅迫信號可能通過LTR 元件激活CsGR-RBP3啟動子活性，進一步誘導該基因的轉錄。 然而，要確定LTR 元件對CsGR-RBP3表達的核心作用，還需要采用基因工程方法截短啟動子或突變LTR 元件，以明確該元件對CsGRRBP3啟動子活性的影響。

轉錄因子在調控靶基因表達過程中發揮重要作用，通過與靶基因啟動子中的反式作用因子結合位點相結合，調控靶基因表達[29]。 在擬南芥中，絕大多數低溫誘導基因COR(cold responsive gene)啟動子中含有MYC 元件，CBF 直接通過與COR基因啟動子中的MYC 元件結合，調控下游基因的表達[30]。 低溫脅迫顯著誘導水稻的Os-MYB38與OsRBGD3表達，酵母單雜交文庫篩選結果顯示，OsMYB38可能與OsRBGD3啟動子結合，調控OsRBGD3表達[23]。 小桐子的JcDnaJ20是一個低溫誘導基因，啟動子中也含有MYB 和MYC 元件[27]。 植物DnaJ 蛋白是一類小分子熱休克蛋白，通常作為分子伴侶行使生物學功能[31，32]。 與DnaJ 蛋白類似，GR-RBP 蛋白也具有分子伴侶功能，且他們有著相似的氨基酸結構，都含有鋅指結構域和富含甘氨酸的結構域[4，33]。本研究從CsGR-RBP3啟動子中鑒定到了多個MYB 和MYC 結合位點，表明MYB 和MYC 類轉錄因子可能調控CsGR-RBP3表達。 本課題組近期的研究結果證實，轉錄因子CsMYB62 能直接與CsGR-RBP3啟動子中的MYB 元件結合，并激活其表達[34]。 是否其他轉錄因子也參與CsGRRBP3的表達調控，還需要采用分子生物學手段，如酵母單雜交、凝膠遷移實驗、雙熒光素酶報道基因實驗等方法，進一步確認轉錄因子與CsGRRBP3啟動子的結合。

逆境誘導型啟動子對下游基因的表達調控具有明顯的時空特異性，即只在逆境脅迫條件下才誘導其大量轉錄，避免過量表達浪費植物自身的物質與能量，影響其正常生長發育[35]。 擬南芥的AtCOR15a是一個典型的低溫誘導基因，過表達該基因能顯著增強擬南芥對低溫的抗性，且啟動子也具有低溫誘導特性[36]；AtSOC1是控制擬南芥開花的一個重要調節基因，將AtCOR15a啟動子與AtSOC1基因全長融合，構建融合表達載體并轉化菊花，可實現通過干旱脅迫控制菊花開花時間[37]。 表明AtCOR15a啟動子具有響應逆境信號并激活下游基因表達的能力。 此外，將AtCOR15a啟動子與GUS標記基因融合，重組載體轉化馬鈴薯，結果發現低溫處理明顯增強馬鈴薯葉片GUS活性[38]。 許多擬南芥冷誘導基因(如CBF、LEA、COR、ERD等)的啟動子也都表現出明顯的低溫誘導特性[39]。 本研究中，低溫處理可誘導冷藏黃瓜的CsGR-RBP3表達，在煙草和擬南芥中轉化該基因啟動子驅動的GUS融合表達載體，能驅動GUS表達，且低溫處理顯著提高GUS 的基因表達量和活性，表明該啟動子具有低溫誘導活性，低溫通過增強CsGR-RBP3啟動子活性，誘導采后黃瓜的CsGR-RBP3表達。

總之，CsGR-RBP3是一個低溫誘導型基因，其表達上調是采后黃瓜應對低溫冷害的重要方式。CsGR-RBP3啟動子中含有響應低溫的LTR元件，并具有啟動基因轉錄的活性。CsGR-RBP3啟動子能驅動GUS表達，且低溫處理明顯提高GUS基因的表達量。 表明低溫通過LTR 元件活化啟動子活性，進一步激活CsGR-RBP3表達。本研究為理解CsGR-RBP3在冷藏黃瓜中的作用奠定了基礎，同時為后續耐冷黃瓜新品種培育積累潛在基因資源。